生物化学经典实验DNA琼脂糖凝胶电泳的原理、步骤、试剂配制、结果分析共27页

生物化学经典实验DNA琼脂糖凝胶电泳的原理步骤试剂配制结果分析分析DNA琼脂糖凝胶电泳是一种常用的生物化学分离和分析方法，可以根据DNA片段的大小进行分离和鉴定。

它通过将DNA样品加载在琼脂糖凝胶孔隙中，利用电场的作用使DNA片段沿电场方向迁移，从而实现分离和鉴定。

以下是关于DNA琼脂糖凝胶电泳的原理、步骤、试剂配制和结果分析的详细解释。

原理：DNA琼脂糖凝胶电泳原理是根据DNA片段的大小和电荷来进行分离。

琼脂糖凝胶是一种大分子网状结构，DNA片段在凝胶中迁移时受到阻碍，较短的DNA片段能够比较快速地通过凝胶，而较长的DNA片段迁移速度较慢。

步骤：1.准备琼脂糖凝胶：将琼脂糖粉溶解在缓冲液中，加热，混合均匀后倒入电泳槽。

插入槽糖待凝固。

2.准备DNA样品：将待测的DNA样品加入到琼脂糖样品缓冲液中。

可加入染料以便可视化DNA迁移。

3.加载DNA样品：将DNA样品缓冲液均匀地加载到琼脂糖凝胶孔隙中。

4.进行电泳：将电泳槽两端连接上电源，设定合适的电场强度和电泳时间，使DNA片段在凝胶中迁移。

5.可视化DNA片段：停止电泳后，将琼脂糖凝胶转移到紫外可视化仪中，或者使用DNA染料染色，然后观察和记录DNA片段的迁移位置。

试剂配制：1. 缓冲液（TAE缓冲液）：配制1X TAE缓冲液的方法是将0.4 MTris（pH 8.0）、0.2 M醋酸和0.01 M EDTA混合，在加75 ml水至1 L，将该缓冲液与琼脂糖按比例混合。

2. DNA染料：可以使用SYBR Green I等DNA染料，按照厂家说明进行稀释。

结果分析：DNA琼脂糖凝胶电泳的结果主要通过观察和记录DNA片段的迁移位置来进行分析。

根据DNA片段的大小，可以判断不同样品中的DNA片段是否存在，或者根据已知大小的DNA片段作为标记物，来确定未知DNA片段的大小。

通常，较小的DNA片段迁移得更快，迁移距离较大，而较大的DNA片段迁移得更慢，迁移距离较短。

琼脂糖凝胶电泳检测DNA1. 实验目的通过本实验学习琼脂糖凝胶电泳检测DNA的方法和技术。

2. 实验原理DNA分子在琼脂糖凝胶电泳中泳动时有电荷效应和分子筛效应。

DNA分子在高于等电点的pH溶液中带负电荷，在电场中向正极移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于DNA分子本身的大小和构型。

溴乙锭是一种荧光染料，这种扁平分子可以嵌入核酸双链的配对碱基之间，它与DNA的结合几乎没有碱基序列的特异性。

在高离子强度的饱和溶液中，大约每2.5个碱基插于一个溴乙锭分子。

与DNA结合的染料在紫外线下呈现橙色荧光。

3. 实验设备移液器，tip头，水平凝胶电泳槽，稳压电泳仪，微波炉，50ml三角瓶4. 实验试剂琼脂糖，1×TAE（Tris-乙酸0.04M，EDTA 0.001M，pH值为8.2），1mg/ml溴乙锭，上样缓冲液。

EB一般在凝胶或电泳缓冲液中的终浓度为0.5µg/ml，EB见光易分解，故应在棕色试剂瓶中于4℃条件下保存。

电泳缓冲液（50×TAE）：242 gTris，57.1 ml冰醋酸，100ml 0.5 M EDTA（pH=8.0）。

上样缓冲液的功能：增加样品的密度保证样品沉入加样孔内；使样品带有颜色便于简化上样过程；能明确显现样品在电泳胶上泳动位置。

溴酚蓝在琼脂糖凝胶中的迁移速率是二甲苯氰迁移速率的2.2倍，这一特性与琼脂糖浓度无关。

5. 实验步骤（1）用透明胶带将胶板的两端封好。

（2）称取0.16 g琼脂糖于50 mL三角瓶中，加入1×TAE 缓冲液20 mL，配配制0.8 %的琼脂糖凝胶，在微波炉中加热至琼脂糖完全溶解。

（3）待琼脂糖溶液冷却至60 ℃左右时，加入2 µL溴化乙锭（EB）充分混匀。

（4）在距底板0.5~1.0 mm的位置上放置梳子，将温热的琼脂糖凝胶倒入胶槽中，凝胶厚度在3-5 mm之间。

（5）凝胶完全凝固后（室温下30~40 min ），去掉透明胶，小心将胶板移至装有1Х TAE buffer的电泳槽中，轻轻拔去梳子，往电泳槽中注入1Х TAE 电泳缓冲液，没过胶面约1 mm 。

琼脂糖凝胶电泳实验原理和实验方法琼脂糖凝胶电泳实验原理和实验方法[实验原理]电泳是现在用于分离和纯化DNA片段的最常用技术。

包含电解质的多孔支持介质----“胶”并把它置于静电场中。

则DNA分子将向阳极移动，这是因为DNA分子沿其双螺旋骨架两侧带有含负电荷的磷酸根残基。

当DNA长度增加时，来自电场的驱动力和来自凝胶的阻力之间的比率就会降低，不同长度的DNA片段就会表现出不同的迁移率。

因而就可依据DNA分子的大小来使其分离。

该过程通过把示踪染料（Purple Loading Dye）或分子量标准参照物(Ladder)和样品(DNA&RNA)一起进行电泳而得到检测。

分子量标准参照物也可以提供一个用于确定DNA片段大小的标准。

琼脂糖凝胶适用于分离大小在0.2-50Kb范围内的DNA片段。

[实验用品]1.琼脂糖 1.0%1.0g琼脂糖+100ml电泳缓冲液(TAE),微波炉中火30秒至沸腾,熔化的琼脂物冷却至60℃时可加入10mg/ml溴化乙锭10μl,充分混匀,将温热的凝胶倒入已置好梳子(鉴定胶用细密点的梳子；回收胶用粗稀的梳子）的胶膜中在室温下放置30-45min后现进行电泳。

1.5%:琼脂糖1.5g。

2.电泳缓冲液50×TAE Tris 乙酸 Tris 242g 终2 mol/L乙酸57.1ml 终1mol/L0.5M EDTA200ml pH8.0 终100mmol/LdH2O 补足至1000ml使用时稀释1×TAE。

5×TBE Tris 硼酸 Tris 54g 终445mmol/L硼酸27.5g 终445mmol/L0.5M EDTA20ml pH8.0 终10mmol/LdH2O 补足至1000ml使用时稀释10倍成0.5倍如50ml贮存液+450ml水→500ml工作液。

[实验内容与方法]1.移取适量的琼脂糖(如制备1%的琼脂糖胶液就移1g的琼脂糖溶于100ml TAE缓冲液中)微波炉加热使其溶于TAE缓冲液中。

琼脂糖凝胶电泳鉴定DNA琼脂糖凝胶电泳琼脂糖凝胶电泳是用琼脂或琼脂糖作支持介质的一种电泳方法。

对于分子量较大的样品，如大分子核酸、病毒等，一般可采用孔径较大的琼脂糖凝胶进行电泳分离。

琼脂糖凝胶约可区分相差100bp的DNA片段，其分辨率虽比聚丙烯酰胺凝胶低，但它制备容易，分离范围广，尤其适于分离大片段DNA。

普通琼脂糖凝胶分离DNA的范围为0.2-20kb，利用脉冲电泳，可分离高达10^7bp的DNA片段。

琼脂糖凝胶电泳操作流程准备干净的配胶板和电泳槽注意DNA酶污染的仪器可能会降解DNA，造成条带信号弱、模糊甚至缺失的现象。

选择电泳方法一般的核酸检测只需要琼脂糖凝胶电泳就可以；如果需要分辨率高的电泳，特别是只有几个bp的差别应该选择聚丙烯酰胺凝胶电泳；用普通电泳不合适的巨大DNA链应该使用脉冲凝胶电泳。

注意巨大的DNA链用普通电泳可能跑不出胶孔导致缺带。

正确选择凝胶浓度对于琼脂糖凝胶电泳，浓度通常在0.5～2％之间，低浓度的用来进行大片段核酸的电泳，高浓度的用来进行小片段分析。

低浓度胶易碎，小心操作和使用质量好的琼脂糖是解决办法。

注意高浓度的胶可能使分子大小相近的DNA带不易分辨，造成条带缺失现象。

适合的电泳缓冲液常用的缓冲液有TAE和TBE，而TBE比TAE有着更好的缓冲能力。

电泳时使用新制的缓冲液可以明显提高电泳效果。

注意电泳缓冲液多次使用后，离子强度降低，PH值上升，缓冲性能下降，可能使DNA电泳产生条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

电泳的合适电压和温度电泳时电压不应该超过20V/cm，电泳温度应该低于30℃，对于巨大的DNA 电泳，温度应该低于15℃。

注意如果电泳时电压和温度过高，可能导致出现条带模糊和不规则的DNA带迁移的现象。

特别是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态是电压太大可能导致小片段跑出胶而出现缺带现象DNA样品的纯度和状态注意样品中含盐量太高和含杂质蛋白均可以产生条带模糊和条带缺失的现象。

DNA琼脂糖凝胶电泳实验原理及超详细步骤物品准备水平电泳槽、电泳仪、微波炉、紫外透射仪、锥形瓶、琼脂糖、电泳缓冲液(1xTBE) 溴化乙锭(EB)溶液、上样缓冲液等实验原理DNA分子在琼脂糖中泳动时有电荷效应和分子筛效应，但主要为分子筛效应。

在pH值为8.0- 8.3时，核酸分子碱基几乎不解离，磷酸全部解离，核酸分子带负电，在电泳时向正极移动。

采用适当浓度的凝胶介质作为电泳支持物，在分子筛的作用下，使分子大小和构象不同的核酸分子泳动率出现较大的差异，从而达到分离核酸片段检测其大小的目的。

核酸分子中嵌入荧光染料(如EB )后，在紫外灯下可观察到核酸片段所在的位置。

实验步骤（1）准备制胶架，用蒸馏水将电泳槽和梳子冲洗干净，放在水平桌面上，并架好梳子（2）配制琼脂糖凝胶及倒胶，琼脂糖凝胶浓度与线形DNA的最佳分辨范围a.以1%的胶为例，三角瓶内0.6g琼脂糖+60ml(0.5xTBE)煮胶溶解冷却至60C(不烫手)b.加入溴化乙锭溶液（终浓度0.5ug/ml）或按照1ul/30mL的比例加入DNAgreen 染料，并充分混匀。

c.倒板,小胶倒入25-30ml左右琼脂糖溶液，大胶则60-70ml左右，若需切胶回收，凝胶可适当加厚。

d.室温下充分凝固，大约30分钟-1小时e.垂直向上拔出梳子f.将胶板放入电泳槽g.向电泳槽中加入0.5xTBE缓冲液至刚没过凝胶表面1-2nm.（3）加样将DNA样品(5ul)与6X上样缓冲液( 1ul)混匀后，用微量加样枪小心加入样品孔内，上样量根据样品浓度可适当调整，若DNA含量偏低，则可依上述比例增加上样量，但总体积不可超过样品槽容量（一般小孔40ul为上限，大孔200ul为上限，具体和制胶膜规格相关）。

注意加样枪的枪头不可插入过深，以免刺穿凝胶，导致样品外溢。

每加完一个样品要更换枪头，以防止EB污染。

（4）电泳接通电源，一般红色为正极，黑色为负极，切记DNA样品由负极往正极泳动(靠近加样孔的一端为负)，电压为5V/cm (长度以两个电极之间的距离计算)，一般控制电压保持在110v，电流在40mA以上。

琼脂糖凝胶电泳技术的原理和方法一、原理：琼脂糖凝胶电泳是一种常用的分离和分析生物大分子的方法。

其原理是利用琼脂糖凝胶作为固定相，通过电场作用将待分离物质在凝胶中进行分离。

琼脂糖凝胶是一种具有多孔结构的凝胶介质，可以根据待分离物质的尺寸和电荷特性进行分离。

二、方法：1. 准备琼脂糖凝胶：首先，按照所需的凝胶浓度和体积配制琼脂糖溶液。

然后，在琼脂糖溶液中加入缓冲液，并搅拌均匀。

将混合液倒入凝胶板中，待其凝固后，准备好使用的琼脂糖凝胶。

2. 样品制备：将待分离的样品进行处理，如蛋白质样品可以经过蛋白质提取和纯化步骤，DNA样品可以进行酶切等处理。

3. 样品加载：将处理好的样品加载到琼脂糖凝胶中。

可以使用样品井或样品孔进行加载，确保每个样品均匀地加载到凝胶中。

4. 电泳条件设置：根据待分离物质的特性和需求，设置适当的电泳条件。

包括电场强度、电泳时间和缓冲液pH值等。

5. 电泳分离：将凝胶板放入电泳槽中，连接电源，进行电泳分离。

在电场的作用下，待分离物质会在凝胶中进行迁移，根据其尺寸和电荷特性进行分离。

6. 结果分析：电泳结束后，可以通过染色等方法观察凝胶板上的带状图案。

根据不同的染色方法，可以观察到不同的待分离物质，如蛋白质带、DNA带等。

三、应用：琼脂糖凝胶电泳技术在生物科学研究中具有广泛的应用。

其中，常见的应用有以下几个方面：1. 蛋白质分离与鉴定：可以通过琼脂糖凝胶电泳技术对蛋白质进行分离和鉴定。

蛋白质在电泳过程中根据其分子量的不同而分离成多个带状条带，通过染色或Western blotting等方法可以对目标蛋白质进行定性或定量分析。

2. DNA分析：琼脂糖凝胶电泳技术在DNA分析中也有重要应用。

可以通过电泳分离来检测DNA片段的长度和纯度，如测序片段、PCR产物等。

3. RNA分析：琼脂糖凝胶电泳技术也可以用于RNA的分析。

通过电泳分离可以检测RNA的大小、纯度和相对含量等。

4. 蛋白质-核酸相互作用研究：通过琼脂糖凝胶电泳技术，可以研究蛋白质与核酸之间的相互作用。

实验二质粒DNA的琼脂糖凝胶电泳一、实验目的掌握琼脂糖凝胶电泳的原理和方法，初步估算双链线性未知DNA分子的大小。

学习质粒的琼脂糖凝胶电泳方法。

二、实验原理琼脂糖是从琼脂中分离制备的链状多糖，是由β－D－吡喃型半乳糖和3,6－脱水－β－L－吡喃型半乳糖以糖苷键相互交替（1,3－1,4）连接而成的一种线性半乳多聚糖，它能够在热的溶剂中溶化并在冷却过程中形成凝胶。

许多琼脂糖分子依靠氢键及其他力的作用使其互相盘绕形成绳状琼脂糖束，构成大网孔型凝胶。

该物质对尿素和盐酸胍等破坏氢键的试剂有较强的抵抗力。

在 pH4.0－9.0的缓冲液中是稳定的。

由于其分子上无带电基团，在缓冲液离子强度大于 0.05 时，对蛋白质无吸附作用，也无电渗现象，因而分辨率和重现性均较好，是一种优良的电泳材料。

在一定浓度的琼脂糖凝胶介质中，如 DNA 分子的电泳迁移率与其分子量、分子构型和所用缓冲液对迁移率相关。

当凝胶浓度太高时，凝胶孔径变小，环状DNA 不能进入胶中，相对迁移率为零，而同等大小的线性 DNA 可以按长轴方向前移，相对迁移率大于零。

DNA分子在电场中会向正极方向移动，不同长度的DNA由于受到凝胶介质的阻力不同，表现为不同的迁移率而被分开。

三、仪器设备、材料与试剂仪器设备电泳仪电炉凝胶成像系统电子天平 pH计量筒（10 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）烧杯（50 mL，100 mL，500 mL，1 000 mL）一次性手套无粉乳胶手套（光明牌，大、中、小三种号码）玻璃棒称量勺微量移液器（1 000 μL，200 μL，20 μL）灭菌的1.5 mL离心管（eppendorf管）灭菌吸头（1 000 μL，200 μL，20μL），相应的吸头盒吸水纸 100mL三角瓶材料：碱法提取获得的质粒DNA样品，标准相对分子量DNA（Marker）四、试剂配制：● 50×TAE电泳缓冲液母液：50ml母液加入体积终浓度Tris碱12.1g冰乙酸 2.85ml0.1M Na2EDT A·2H2O （pH8.0）25ml无菌水至50ml实验时，取1mL50×TAE电泳缓冲液母液，加49mL双蒸水稀释成1×TAE ● 6×DNA电泳上样液母液加入体积终浓度溴酚蓝0.25%二甲苯氰0.25%蔗糖水溶液40%（W/V）● Gel Red贮存液操作时应戴一次性手套五、实验步骤(一电泳前准备准备内容作用1.刷干净电泳制胶的梳子，板子，槽子，蒸馏水洗净晾干防止不必要的重复污染，减少外来的污染。

一、实验目的琼脂糖凝胶电泳是常用的检测核酸的方法，学习DNA琼脂糖凝胶电泳的使用技术，掌握有关的技术和识读电泳图谱的方法。

二、实验原理琼脂糖凝胶电泳是常用的用于分离、鉴定DNA、RNA分子混合物的方法，这种电泳方法以琼脂凝胶作为支持物，利用DNA分子在泳动时的电荷效应和分子筛效应，达到分离混合物的目的。

DNA分子在高于其等电点的溶液中带负电，在电场中向阳极移动。

在一定的电场强度下，DNA分子的迁移速度取决于分子筛效应，即分子本身的大小和构型是主要的影响因素。

DNA分子的迁移速度与其相对分子量成反比。

不同构型的DNA分子的迁移速度不同。

如环形DNA分子样品，其中有三种构型的分子：共价闭合环状的超螺旋分子（cccDNA）、开环分子(ocDNA)、和线形DNA分子(IDNA)。

这三种不同构型分子进行电泳时的迁移速度大小顺序为: cccDNA＞IDNA＞ocDNA核酸分子是两性解离分子，pH3.5是碱基上的氨基解离，而三个磷酸基团中只有一个磷酸解离，所以分子带正电，在电场中向负极泳动；而 pH8.0-8.3时，碱基几乎不解离，而磷酸基团解离，所以核酸分子带负电，在电场中向正极泳动。

不同的核酸分子的电荷密度大致相同，因此对泳动速度影响不大。

在中性或碱性时，单链DNA与等长的双链DNA的泳动率大致相同。

影响核酸分子泳动率的因素主要是：1、样品的物理性状即分子的大小、电荷数、颗粒形状和空间构型。

一般而言，电荷密度愈大，泳动率越大。

但是不同核酸分子的电荷密度大致相同，所以对泳动率的影响不明显。

对线形分子来说，分子量的常用对数与泳动率成反比，用此标准样品电泳并测定其泳动率，然后进行DNA分子长度（bp）的负对数——泳动距离作标准曲线图，可以用于测定未知分子的长度大小。

DNA分子的空间构型对泳动率的影响很大，比如质粒分子，泳动率的大小顺序为：cDNA＞ID NA＞ocDNA但是由于琼脂糖浓度、电场强度、离子强度和溴化乙锭等的影响，会出现相反的情况。