免疫组化流程

细胞免疫组化步骤1. PBS冲洗两次2. 丙酮固定10min3. 浸入0.75%H2O2-PBS(30%H2O2 0.05 ml+PBS 2ml) 37℃30 min4. PBS振洗2次,每次3min5. 加封闭血清,湿盒内37℃30 min6. 弃去血清7. 加一抗, 37℃30~60min (1:200 1:150稀释)8. PBS振洗3次,每次3min9. 加二抗, 37℃30 min10. PBS振洗3次,每次3min11. 加ABC复合剂, 37℃30 min12. PBS振洗2次,THB(Tris-HCl缓冲液0.5mol/l,PH 7.6 )振洗1次,每次3min13. 浸入新鲜底物溶液（DAB50mg+100ml THB）,在室温下暗处10~20min14. 自来水洗5min15. 染核浸入苏木素染液2min,自来水洗，迅速过盐酸酒精，自来水洗，过氨水，自来水洗16. 逐级脱水，70％1次，95％2次，无水3次每次1min17. 透明，过二甲苯3次，每次1min18. 封片将有细胞的一面向下封片一、免疫组化操作规程（一）、仪器设备1）18cm不锈钢高压锅或电炉或医用微波炉；2）水浴锅（二）、试剂1）PBS缓冲液（pH7.2～7.4）：NaCl 137mmol/L，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO4 4.3mmol/L，KH2PO4 1.4mmol/L。

2）0.01mol/L柠檬酸盐缓冲液（CB，pH6.0，1000ml）：柠檬酸三钠3g，柠檬酸0.4g。

3）0.5mol/L EDTA缓冲液（pH8.0）：700ml水中溶解186.1gEDTA·2H2O，用10 mmol/L NaOH调至pH8.0,加水至1000ml。

4）1mol/L的TBS缓冲液（pH8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0,加水至1000ml。

5）酶消化液：a、0.1%胰蛋白酶液：用0.1%CaCl2(pH7.8) 配制。

免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2. 水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7.2―7.4）：NaC137mmol/L，KCl2.7mmol/L ,Na2HPO4 4.3mmol/L, KH2PO4 1.4mmol/L. 2．0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6.0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0.4g。

3．0.5mol/L EDTA缓冲液（ph8.0）：700ml水中溶解186.1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph8.0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8.0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH8.0, 加水1000ml。

5. 酶消化液：a.0.1%胰蛋白酶:用0.1%CaCl 12(ph7.8)配制。

b.0.4%胃蛋白酶液：用0.1N的HCl配制。

6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7. 风裱剂：a.甘油和0.5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9.0–9.5）等量混合 b 油和TBS(PBS)配制8．TBS/PBS PH9.0–9.5,适用于荧光纤维镜标本;ph7.0-7.4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

a 组织芯片置于二甲苯中浸泡10分钟,更换二甲苯后在浸泡10分钟b 无水乙醇中浸泡五分钟c 95%乙醇中浸泡五分钟d 75%乙醇中浸泡五分钟2、抗原修复：用于福尔马林固定的石蜡包埋组织芯片：A 抗原热修复a 高压热修复在沸水中加入EDTA(ph8.0)或0.01m枸橼酸钠缓冲溶液（ph6.0）.盖上不锈钢锅盖，但不能锁定。

1.脱蜡复水：
（1）石蜡切片浸泡在二甲苯中2次（分别置入两个装有二甲苯的染缸），每次10min；
（2）无水乙醇、95%、85%、75%、50%乙醇、纯水中依次放置5min；
（3）PBS缓冲液中浸泡5min。

2.抗原修复：
（1）加入H2O2，湿盒中孵育10min，PBS浸泡冲洗3次，每次5min；
（2）放入0.01M枸橼酸缓冲液中，微波炉大火加热至沸腾（保持8min）；
（3）待修复液温度降至室温，PBS冲洗2次，每次5min。

3.免疫反应：
（1）滤纸擦去多余的PBS，低价PBS稀释的10%正常山羊血清，室温下湿盒封闭30-60min；
（2）孵育结束后去除封闭液，滴加一抗工作液，4度孵育过夜；
（3）移去一抗工作液后，用PBS冲洗2次，每次10min，擦去切片周围多余液体；
（4）滴加二抗工作液，室温湿盒孵育30min，弃去二抗后PBS洗2次，每次10min。

4.化学染色：
（1）擦去切片上多余PBS，滴加新鲜配置的DAB工作液，湿盒孵育，显微镜检测染色程度；
（2）染色结束后PBS洗去DAB染液3次，每次5min；
（3）去除残留液体，苏木素复染25min；
（4）复染结束后，清水洗去，1%盐酸酒精中风化数秒，再次水洗。

5.脱水封片：
（1）依次将切片放入50%、75%、85%、95%乙醇和无水乙醇中，各放置5min；
（2）二甲苯中透明化处理2次，每次10min；
（3）脱水处理后，擦去周围液体，滴加几滴中性树胶，盖上盖玻片，用镊子钝端轻敲盖玻片以除去气泡。

vegf免疫组化流程VEGF免疫组化流程是一种常用于研究血管内皮生长因子（Vascular Endothelial Growth Factor，VEGF）在生物组织中的表达和分布的实验方法。

VEGF是一种重要的调节因子，对血管生成和组织修复过程起着重要作用。

VEGF免疫组化流程可以帮助科研人员了解VEGF在不同组织中的表达情况，进一步研究其功能和疾病相关性。

下面将介绍VEGF免疫组化流程的详细步骤。

流程步骤：1. 组织固定：将组织标本取出，迅速固定。

常用的固定剂包括10%中性缓冲福尔马林（neutral buffered formalin）和4%的冷磷酸盐缓冲液（4% paraformaldehyde）。

固定时间根据组织的大小和类型进行调整，一般为4-24小时。

2. 组织包埋：将固定的组织标本进行去水和透明化处理。

去水可使用不同浓度的乙醇，透明化可使用透明剂（如二甲苯或其它透明剂）进行处理。

该步骤的目的是为了保持标本的完整性和可切片性。

3. 切片：将透明化的组织标本放入组织切片机中进行切片。

切片厚度一般为3-5μm。

切片完成后，用标签或玻片记录好切片的顺序和位置。

4. 石蜡去除和抗原修复：将切片的石蜡脱除，一般使用二甲基苯（xylene）或其它脱蜡剂进行处理。

然后进行抗原修复步骤，该步骤的目的是为了恢复组织标本中的抗原的可识别性。

抗原修复方法可能有多种选择，包括高温蒸压法（如压力锅法）、酶消化法以及化学方法。

5. 抗体染色：将修复后的切片进行抗体染色。

VEGF的免疫组化染色可使用VEGF特异性的一抗和二抗来实现。

一抗与组织标本中的VEGF结合，二抗与一抗结合，再使用染色剂如二氧化钼直接可视化。

免疫组化染色的过程中需进行阴性对照和阳性对照，以确保结果的准确性。

6. 洗涤和封片：完成抗体染色后，将切片进行洗涤，去除多余的染色剂和抗体。

之后将切片用温暖的蒸馏水冲洗数次，以去除洗涤液中的盐析物。

最后，用有机溶剂（如二甲苯或其它溶剂）将切片覆盖玻片，并在切片和玻片之间加入合适的封片剂，然后加盖盖玻片。

免疫组化实验步骤免疫组化操作步骤一、实验原理与意义免疫组织化学又称免疫细胞化学，是指带显色剂标记的特异性抗体在组织细胞原位通过抗原抗体反应和组织化学的呈色反应，对相应抗原进行定性、定位、定量测定的一项新技术。

它把免疫反应的特异性、组织化学的可见性巧妙地结合起来，借助显微镜(包括荧光显微镜、电子显微镜)的显像和放大作用，在细胞、亚细胞水平检测各种抗原物质(如蛋白质、多肽、酶、激素、病原体以及受体等)。

（一）、仪器设备1. 18cm不锈钢高压锅或电炉或用微波炉.2.水浴锅（二）、试剂1. PBS缓冲液（ph7."2―7."4）：NaC137mmol/L，KCl2."7mmol/L ,Na2HPO44."3mmol/L, KH2PO41."4mmol/L.2．"0.01mol/L柠檬酸钠缓冲液（CB,ph6."0,1000ml）：柠檬酸三钠3g,柠檬酸0."4g。

3．0."5mol/L EDTA缓冲液（ph8."0）：700ml水中溶解186."1g EDTA& 8226;2H2O,用10mmol/L NaOH调至ph 8."0,加水至1000ml.4. 1mol/L的TBS缓冲液（ph8."0）：在800ml水中溶解121gTris碱，用1N的HCl调至pH 8."0,加水1000ml。

5.酶消化液：a.0."1%胰蛋白酶:用0."1%CaCl 12(ph7."8)配制。

b.0."4%胃蛋白酶液：用0."1N的HCl配制。

6. 3%甲醇―H2O2溶液：用30%H2O2和80%甲醇溶液配制7.风裱剂：a.甘油和0."5mmol/L碳酸盐缓冲液（pH9."0–9."5）等量混合b油和TBS(PBS)配制8．"TBS/PBS PH9."0–9."5,适用于荧光纤维镜标本;ph7."0-7."4适合光学纤维标本（三）、操作流程1、脱蜡和水化：脱蜡前应将组织芯片在室温中放置60分钟或60℃恒温箱中烘烤20分钟。

免疫组化原理及流程介绍免疫组化（Immunohistochemistry，IHC）是一种利用免疫反应来检测组织内特定抗原的技术。

它通过将特定的抗体与要检测的组织染色连接，从而实现对该抗原的可视化检测和定位。

免疫组化广泛应用于病理学领域，可以用于诊断和鉴定疾病，研究疾病发生机制以及评估治疗效果。

下面将介绍免疫组化的工作原理和流程。

免疫组化的工作原理可以分为两个步骤：抗原-抗体反应和可视化。

抗原-抗体反应是指将固定的组织样本与特异性抗体结合，形成抗原-抗体复合物。

这种特异性的结合是由于抗原与抗体之间具有互补的结构，类似于锁与钥的关系。

一旦抗原-抗体结合发生，可以通过一系列的化学反应来可视化这种结合，从而观察到抗原的位置和表达水平。

免疫组化的流程一般可以分为样本制备、抗原修复、抗体染色和结果分析四个主要步骤。

样本制备：首先，需要取得要检测的组织样本。

这些组织样本可以是切片、细胞涂片或者细胞悬液。

然后，将样本固定在载玻片上，以保持组织结构的完整性。

抗原修复：组织样本的形态学上常常被固定剂和时间的影响而改变，导致抗原的结构发生损坏。

为了修复抗原使其可被抗体识别，需要进行抗原修复步骤。

常用的抗原修复方法包括高压蒸汽处理（例如蒸气胶片锅或蒸箱）和化学处理（例如酶解或化学溶解）。

抗体染色：通过将特异性抗体与要检测的抗原结合，可实现抗原-抗体复合物的形成。

抗体可以是单克隆抗体或多克隆抗体，可以使用直接染色或间接染色技术。

直接染色是将抗原和抗体直接连接，通过抗原-抗体复合物可视化抗原的表达水平。

间接染色是先与一种包含特异性抗体的二抗结合，再利用第二抗体与标记物（通常是酶或荧光标记）结合，从而放大信号。

结果分析：通过显微镜观察染色结果，评估抗原的表达情况和分布。

常用的评估方法包括定性评估和定量评估。

定性评估是通过观察染色强度和细胞定位来判断抗原的表达水平和细胞类型。

定量评估则是通过计算染色阳性的细胞数量或染色强度来定量化抗原的表达水平。

免疫组化流程---袁燕平以下步骤为本人免疫组化常用步骤，流程与常见流程无异，流程如下；1 脱蜡---脱蜡前首先烤片10分钟，二甲苯1，2，3，各10分钟。

二甲苯应该经常更换！2 水化---梯度酒精至水，100％5分钟，100％5分钟，95％3分钟,85％3分钟,75％3分钟，自来水流水冲3分钟。

注意冲水时水量不宜过大，细流即可！3 抗原修复---采取微波加热修复，修复液为柠檬酸盐溶液（最常用），具体方法为：先将修复液加热至沸腾，然后放入玻片，先使用中火8分钟，然后低火8分钟。

一般要求热修复时间达到15分钟才能达到比较好的抗原修复作用。

请注意：在抗原修复完成之后要求玻片上组织一直保持湿润，千万不能出现组织风干的情况。

部分抗原分子可无需进行抗原修复。

4 冷却---一般采取流水降温冷却法，即将容器置于自来水流水中缓慢降温，降温不宜过快，30分钟为好。

部分实验室采取自然冷却法。

5 灭内源性过氧化物酶---注意此时开始一直将玻片置于湿盒中保湿！滴加液体前先用免疫组化专用笔绕组织涂画一圈，甩干组织上的水分，用力不要过猛，然后滴加3％的过氧化氢-甲醇溶液（或者医用3％的过氧化氢），室温15min。

（因为免疫组化中使用的显色液的主要成分为过氧化氢，灭酶可以避免假阳性的出现）。

随后PBS洗3次3分钟。

6 封闭---甩干组织上的液体，滴加与二抗来源相同的非免疫血清（兔血清常用），室温封闭20分钟。

提前配制一抗，使用抗体稀释液（或PBS）按1:100-400（酌情）比例稀释一抗。

每块组织滴加10-30ul体积抗体即可，每次使用前必须新鲜配制，抗体稀释后尽快使用。

7 孵一抗---不需PBS洗，可甩干组织上的液体并滴加合适稀释度的一抗， 4度过夜孵育。

8 复温---将湿盒从冰箱拿出置于室温中15分钟。

PBS洗3次3分钟。

9孵二抗---甩干组织上的液体，滴加二抗，每张切片约滴加10ul即可，注意液体面积要大于组织面积，否则显色时出现边缘效应（假阳性），37度孵育30-60分钟。

免疫组化操作规程
《免疫组化操作规程》
免疫组化（Immunohistochemistry, IHC）是一种广泛应用于生物医学研究和临床诊断中的技术，其操作规程的严谨性和标准化对于获得准确可靠的结果至关重要。

下面是一份免疫组化操作规程供参考：
1. 样本处理：将组织标本固定在适当的条件下，然后进行蜡包埋并切片。

注意保护好标本的完整性和质量。

2. 抗原修复：对标本进行适当的热处理或酶处理，以修复由于固定等步骤导致的抗原构象变化。

3. 抗体选择：选择适当的一抗和二抗，确保一抗的特异性和敏感性，二抗的来源和标记物的稳定性。

4. 标本处理：将切片标本进行脱脂、脱水和透明化处理，确保标本的透明度和形态保持完好。

5. 抗体染色：将标本与一抗和二抗分别反应，通过荧光标记或酶标记来检测靶标记的位置和强度。

6. 阅读结果：采用专业显微镜观察标本的染色结果，进行定量分析或者定性分析。

7. 结果验证：通过对照组和阳性对照进行染色结果的验证，确
保结果的准确性。

8. 结果分析：根据染色结果和临床信息进行综合分析，作出科学可靠的结论。

以上是一份免疫组化操作规程的基本内容，但在实际操作中还需要根据具体的实验室条件和要求进行进一步的细化和规范化。

希望这份规程能为从事免疫组化工作的科研人员和临床检验人员提供一些帮助。

免疫组化实验流程审批免疫组化实验是一种常用的生物学和医学研究技术，它对于疾病的诊断、治疗和研究具有重要意义。

为了确保实验的准确性、可靠性和安全性，需要建立一套严格的实验流程审批制度。

一、免疫组化实验的基本原理和应用免疫组化实验基于抗原与抗体特异性结合的原理。

通过将特定的抗体与组织或细胞中的抗原结合，再利用显色反应或荧光标记等方法，使抗原所在的位置得以显示。

这一技术广泛应用于肿瘤诊断、病理学研究、神经科学、免疫学等领域。

在肿瘤诊断中，免疫组化可以帮助确定肿瘤的类型、来源、分化程度以及预测肿瘤的预后和对治疗的反应。

例如，乳腺癌中雌激素受体、孕激素受体和HER2 的检测，对于治疗方案的选择具有重要指导意义。

二、实验前的准备工作1、实验人员资质从事免疫组化实验的人员应具备相关的专业知识和技能，经过系统的培训，并熟悉实验室的安全操作规范。

实验人员需要了解免疫组化的基本原理、实验步骤、常见问题及解决方法。

2、实验材料和试剂选择合适的组织样本、抗体、显色剂等实验材料和试剂至关重要。

组织样本应保证新鲜、固定良好，并经过正确的处理和保存。

抗体的选择应根据实验目的和样本类型，确保其特异性和亲和力。

显色剂应具有良好的稳定性和显色效果。

3、实验设备和仪器准备齐全且性能良好的实验设备和仪器，如切片机、孵育箱、显微镜等。

设备应定期进行维护和校准，以保证实验结果的准确性和可靠性。

三、免疫组化实验流程1、组织样本处理（1）取材：从生物体中获取组织样本时，应遵循无菌操作原则，避免样本受到污染。

（2）固定：将组织样本迅速放入适当的固定液中，如福尔马林，以保持组织的形态和结构。

（3）脱水：通过梯度酒精脱水，去除组织中的水分。

（4）包埋：将脱水后的组织样本包埋在石蜡中，便于切片。

2、切片制作使用切片机将包埋好的组织切成薄切片，通常厚度为 4-6 微米。

切片应平整、完整，无褶皱和裂痕。

3、脱蜡和水化将切片放入二甲苯中脱蜡，然后依次经过梯度酒精进行水化。

免疫组化实验流程审批免疫组化实验是一种在生物学和医学研究中广泛应用的技术，它能够帮助我们深入了解细胞和组织中的蛋白质表达情况，对于疾病的诊断、治疗和研究具有重要意义。

为了确保实验的准确性、可靠性和安全性，需要对免疫组化实验流程进行严格的审批。

一、免疫组化实验的基本原理免疫组化实验的原理是基于抗原与抗体的特异性结合。

在实验中，我们首先将组织或细胞样本进行处理，使其暴露抗原位点。

然后，加入特定的抗体，这些抗体能够与我们感兴趣的抗原结合。

通过一系列的显色反应，我们可以观察到抗原在组织或细胞中的分布和表达情况。

二、免疫组化实验的流程1、样本采集与固定样本的采集必须遵循严格的操作规程，以确保样本的质量和完整性。

常见的样本包括组织切片、细胞涂片等。

采集后的样本需要立即进行固定，常用的固定剂有福尔马林等，固定的目的是保持细胞和组织的形态结构，防止抗原的降解和丢失。

2、脱水与包埋固定后的样本需要经过脱水处理，以去除组织中的水分。

然后，将样本包埋在石蜡或其他包埋剂中，以便后续进行切片。

3、切片与贴片使用切片机将包埋好的样本切成薄片，厚度一般在 4 6 微米。

切好的切片需要贴附在载玻片上，以便进行后续的实验操作。

4、脱蜡与水化贴片后的样本需要经过脱蜡处理，去除石蜡。

然后，进行水化，使样本恢复到正常的生理状态。

5、抗原修复由于在固定和处理过程中，抗原可能会发生部分变性或遮蔽，因此需要进行抗原修复，以暴露抗原位点。

常用的抗原修复方法有热修复、酶修复等。

6、封闭为了减少非特异性结合，需要在样本上加入封闭液，封闭非特异性结合位点。

7、一抗孵育加入特异性的一抗，使其与样本中的抗原结合。

一抗的选择和浓度需要根据实验的要求进行优化。

8、二抗孵育一抗孵育结束后，加入与一抗特异性结合的二抗。

二抗通常带有标记物，如荧光素、酶等，以便后续进行显色反应。

9、显色根据二抗所带的标记物，选择相应的显色方法。

常见的显色方法有DAB 显色、荧光显色等。