实验三-琼脂糖凝胶电泳检测DNAppt课件

实验三-琼脂糖凝胶电泳检测DNA
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操作步骤
1、凝胶准备：用0.5×TBE配制1％琼脂糖凝胶。 ① 称1g琼脂糖置三角瓶中，加100ml 0.5×TBE； ② 微波炉加热大约1分钟，熔化琼脂糖； ③熔化的琼脂糖自然冷却到60～70℃时，加入EB（终浓度0.5μg/ml），并轻轻混
匀。
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DNA分子在琼脂糖凝胶中泳动时，有电荷效应与分子筛效应。不同DNA的分 子量大小及构型不同，电泳时的泳动率就不同，从而分出不同的区带。
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3. 溴化乙锭（EB）是一种吖啶类染料，它在紫外灯照射下能发射荧光，当DNA 样品在琼脂糖凝胶中电泳时，琼脂糖凝胶中的EB就插入DNA分碱基对子中形成 荧光络合物，使DNA发射的荧光增强几十倍，电泳后就可直接紫外灯照射下检 测琼脂糖中的DNA。
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10、电泳结束后，切断电源，取出凝胶 （手套拿取凝胶）。 11、电泳结果分析：
紫外检测仪直接观察电源条带；凝胶成像分析系统处理。
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影响迁移率的因素 DNA分子的大小 琼脂ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ凝胶的浓度 DNA的构象 所加电压 一般5V/cm 电场方向 染料的存在与否 电泳缓冲液的组成
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2、胶床准备： ①取出洗净并晒干的胶床和梳子 ②将梳子垂直插入到胶床的小凹槽内，梳齿底端和床面有1mm的间隙。 ③将胶床放在调整好的水平台上。
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3、铺胶：将冷却致60℃的凝胶倒入准备好的胶床内，凝胶厚度3～5mm。 4、室温下静置1小时左右，凝胶固化。将带凝胶的胶床置于电泳槽中，并使样品孔
在碱性环境下，不同的核酸分子由于具有相同的磷酸戊糖结构，几乎具有 相同的电荷密度，其电泳行为线性分子在凝胶中的迁移率与其所含碱基对数目 的对数值成反比。可以近似用于估算分子的大小。
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2. 琼脂糖介质结构均一，含水量大（98-99%），可通过调整琼脂糖的浓度改变孔 径的大小，起到分子筛的作用。 琼脂糖凝胶电泳 200bp—50kb（分离范围广、方便）
EB结构与核酸碱基相似，容易插入DNA中，因而其有强的致癌性。
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器材与试剂
1.实验器材 电泳仪、电泳槽、凝胶紫外透射仪、解剖刀、台式高速离心机、Eppendorf管、移液 抢、恒温水浴锅、一次性手套、三角烧瓶
2.试剂 琼脂糖：根据需要用电泳缓冲液配成不同浓度。
本实验配制 1％ Agrose： 1g Agrose、 50～100ml 0.5×TBE、
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核酸样品 DNA marker DL2000 电泳缓冲液：本实验选用TBE
6×上样缓冲液（ Loading buffer ）： 4℃贮存。增加样品密度，使样品带颜色，起指示作用。 0.25% 溴酚蓝、0.25% 二甲苯青FF、30％ 甘油水溶液
10mg/ml 溴化乙锭（EB）：贮存液，棕色瓶室温保存。终浓度是0.5μg/ml。
实验三 琼脂糖凝胶电泳检测DNA
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实验目的
1.掌握琼脂糖凝胶电泳检测DNA的原理和方法。 2.检测PCR结果。
实验原理
1. DNA分子在碱性缓冲液中带负电荷，在外加电场作用下向正极泳动。
核酸为两性分子，在pH 3.5时，碱基上的氨基解离而磷酸基团中只有第一 个磷酸解离，整个分子带正电； pH 8左右时，碱基几乎不解离，而磷酸全部解 离，整个分子带负电。
思考题
1.影响核酸在琼脂糖凝胶电泳中迁移速率的因素有哪些？
2.电泳中加入Loading buffer的作用是什么？
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位于电场负极。 5、轻轻拔出固定在凝胶中的梳子。
原梳齿处 (样品孔) 即被缓冲液充满，如发现有气泡，应设法去除。
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6、向电泳槽中加入0.5×TBE电泳缓冲液，以越过凝胶表面1～2mm为宜。
7、样品准备：向核酸样品中加入约为样品体积1/6的上样缓冲液，用加样器轻轻 混匀。例如，5微升的DNA样品+1微升的上样缓冲液，以此类推。
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8、上样：用加样器吸取样品，轻轻的加入到凝胶的样品孔中。加样量一般10～ 30μl。
9、盖上电泳槽，接通电源，开始电泳。
开始电泳前，再次确认凝胶样品孔处于电场的负极。电泳条件：接通电泳槽与电 泳仪的电源，调节电压100V 30min,当溴酚蓝染料移动到距凝胶前沿1-2cm处，停 止电泳。
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注意事项
1. 倒胶时把握好胶的温度，不要高于60℃ ，否则温度太高会使 凝胶盘变形。 2. 胶一定要凝固好才能拔梳子，方向一定要竖直向上，不要弄坏 点样孔。 3.点样时枪头下伸，点样孔内不能有气泡。 4.EB有毒，切勿用手接触，更不要污染环境，胶勿乱扔，紫外线 照射不宜太久。