基因克隆及在大肠杆菌中的表达

KGF-2基因克隆及在大肠杆菌中的表达1引言角质形成细胞生长因子-2 ( Keratinocyte Growth Factor-2，KGF-2)，又称为成纤维细胞生长因子-10 (Fibroblast Growth Factor-10，FGF-10)，是FGFs超家族中角质细胞生长因子家族的一员。

1.1 KGF-2的来源和基因结构KGF-2主要是由成纤维细胞及其他间充质来源的细胞分泌，如成纤维细胞、损伤修复中的肉芽组织以及上皮组织周围的γδT细胞均可分泌KGF-2。

此外，上皮组织的损伤还可上调KGF-2的表达。

人kgf-2基因位于染色体的5p12-p13区域，其基因为单拷贝，由3个外显子和2个内含子组成。

1997年，Emoto等[1]克隆了人的kgf-2的cDNA，其编码的蛋白质由208个氨基酸组成，N端有39个氨基酸组成的疏水信号肽，成熟蛋白含169个氨基酸，其中4个半胱氨酸形成2对二硫键，另一个折叠在肽中。

理论相对分子质量为19.3KD，对肝素具有较强的亲和作用。

Kgf-2的立体结构与其它FGF家族成员相似，为β三叶草型。

1.2 KGF-2的功能KGF-2通过与上皮细胞细胞膜上受体作用特异性促进上皮细胞的增殖、分化和迁移，是胚胎器官发育中重要的多功能信号分子。

KGF-2能够通过刺激表皮细胞的增殖、迁移和分化直接促进伤口的愈合，在组织的重塑过程中起趋化作用[2]。

KGF-2通过与损伤位点黏膜的表皮细胞上的受体结合，引起细胞向受伤处迁移，保护角质细胞免受ROS诱导的细胞凋亡，由此来加快伤口的愈合。

此外，KGF-2同时也能通过刺激其它在组织修复和再生过程中有着非常重要作用的细胞因子(如血小板衍生生长因子，转化生长因子和成纤维细胞生长因子)的表达来间接作用于组织的重塑[3]。

KGF-2有两种细胞膜表面受体：FGFR1Ⅲb和FGFR2Ⅲb。

KGF-2与FGFR2Ⅲb的亲和力高，是其特异性配体。

KGF-2与受体结合后，促使受体处于细胞内的Ｃ端酪氨酸残基磷酸化，磷酸化的受体具有酪氨酸蛋白激酶活性，并与一系列靶蛋白发生作用，引发信号级联反应，发挥生物学功能[4,5]。

在脊椎动物器官形态发生过程中，KGF-2 在间充质-上皮相互作用中十分关键，如在四肢形成过程中，KGF-2在侧板中胚层的有限区域表达，它诱导尖外胚层嵴细胞的分化，刺激细胞增殖导致肢芽形成[6]。

脊椎动物器官的分支状形态发生也与FGFs家族相关，研究表明在小鼠肺的发育过程中，KGF-2可能是一个十分关键的生长因子和趋化物质[7]。

其它经历分支状发生的器官，像泪腺和胰腺，KGF-2在其发育过程中也发挥一定作用[8,9]。

另外，KGF-2几乎参与颅面区所有的结构发育，无论是早期的形成过程，还是后期的生长调节，KGF-2/KGFR2b 信号通路都是十分关键的[10]。

在生殖系统的发育过程中，KGF-2 也起着重要的作用。

在前列腺的发育过程中，间充质通过分泌KGF-2 等细胞因子来诱导前列腺上皮细胞发育。

Donjacour等研究FGF-10雄性小鼠模型时发现，大多数这种小鼠出生时雄性第二性器官缺失或萎缩，包括前列腺、精囊、尿道球腺和尾部输精管[9]。

另外，Yucel等利用基因敲除小鼠模型证实，KGF-2 等生长因子在生殖结节的正常发育过程中协同其他细胞因子起着非常重要的作用[10]。

这些研究结果说明KGF-2可能在前列腺和其他附属性器官发育中起十分重要的作用。

目前已经发现KGF-2在脊椎动物四肢、牙齿和毛发（羽毛），以及肺、耳、盲肠、颌下腺、胰腺和前列腺等器官的形成过程中起着极为重要的作用[11]。

KGF-2也有辐射防护作用[12]。

KGF-2可以提高辐射后小鼠的肠干细胞的存活率，并对辐射引起的气道上皮细胞的通透性升高具有拮抗作用。

Knan等人应用离子微集落刺激法发现，KGF能显著降低辐射引起的肠道损伤。

Waters 和Savla等人用测定荧光素异硫氰酸盐标记的牛血清白蛋白（FITC-BSA）的外渗来反应培养的Calu-3和16HBE140单层细胞的通透性，结果发现在同等剂量的辐照条件，KGF（50ng/ml）预处理的培养单层细胞对FITC-BSA的通透性明显下降，而KGF对未辐射过的单层细胞的通透性无影响。

通过激活蛋白激酶C（PKC），KGF可以加速辐射诱导的DNA 损伤修复，并维持细胞骨架蛋白F-肌纤蛋白的稳定和保护细胞间连接。

1.3 Kgf-2在大肠杆菌中的表达优势近年来的研究发现kgf-2基因在毕赤酵母中表达时，目的产物容易遭受宿主蛋白酶的降解[13]。

大肠杆菌表达系统具有容易操作、能高效表达的特点，而且就重组蛋白的生物学活性而言，两种方式表达的重组蛋白均具有类似天然蛋白的生物学功能，其刺激NIH/3T3细胞增殖能力也几乎相当。

因此本研究希望利用大肠杆菌表达系统来实现该基因的高效稳定表达。

2 主要仪器及原料2.1 材料2.1.1 菌株来源BL21菌株由军事医学科学院馈赠2.1.2 寡核苷酸引物实验所需引物由上海生工公司合成pet28kgf(+)：CGGAATTCGGTCAAGACATGGTGTCACCpet28kgf(-)：CGCTCGAGTTATGAGTGTACCACCATTGGA2.1.3 试剂PCR反应体系：dNTP溶液，Taq酶，XhoⅠ，Mg2+溶液DNA电泳体系：琼脂糖，MarkerⅢ，6×loading Buffer ，TAE 缓冲液，Goldview蛋白电泳体系：10%过硫酸铵，TEMED，巯基乙醇，30% 胶母液，分离胶缓冲液（pH 8.8），浓缩胶缓冲液（pH6.8），10×电极缓冲液（pH 8.3），2 ×上样缓冲液，染色液，脱色液试剂盒：质粒提取试剂盒，PCR产物回收试剂盒培养基：LB液体培养基，LB固体培养基溶液：60mmol/L氯化钙溶液抗生素：卡那霉素，氨苄青霉素2.2 实验仪器PCR仪：Eppendorf公司DNA电泳仪：北京六一蛋白电泳仪：北京六一低温离心机：美国Beckman公司摇床：ZHWY2008B制冰机：SIM-F124（SANYO）恒温水浴锅：GFL1002超低温-20冰箱：MDF-U5410（SANYO）4 ℃冰箱：BCD-257SLB漩涡混匀器：VORTEX-GENIE2超净工作台：HD-1360新型格兰仕WD750ASL23微波炉电转化仪3 实验方法[14,15]3.1 质粒DNA的提取分别取BL21（pET28a）和BL21（pET22b kgf-2）菌液接种于5ml(含氨苄青霉素和卡那霉素)的LB培养基中，37℃振荡培养过夜，各自用试剂盒法提取质粒DNA ，步骤如下：（1）将5 ml菌液13 000rpm离心30s，收集沉淀。

（2）倒掉上清，将沉淀完全悬浮于100μl悬浮液（溶液Ⅰ）中。

（3）加入150μl裂解液（溶液Ⅱ）轻柔地颠倒混匀10次左右，溶液逐渐变得粘稠清亮。

（4）加入150μl中和液（溶液Ⅲ），轻柔地颠倒混匀10次左右。

（5）13 000rpm离心8-10分钟左右，将上清液小心转移入一个新的1.5 ml离心管中，加入等体积的（约400μl）结合液，颠倒混匀。

（6）将混合液吸入离心纯化柱中，静置至少3分钟，13 000rpm离心30 s，倒掉收集管中的废液。

（7）将纯化柱重新套入废液收集管中，加入600μl 80% 的异丙醇，13 000rpm离心1分钟，倒掉收集管中的废液。

（8）取出纯化柱，将其套入一个干净的1.5 ml 离心管，开盖放置2-3分钟，加入50μl 双蒸水于硅胶膜上，不能粘在管壁上，室温下放置5分钟后，13 000rpm离心1分钟。

（9）将洗脱液重新吸入纯化柱中，再洗脱一次，这样可获得较高产量的质粒DNA。

（10）离心管中收集的液体即是洗脱下来的质粒DNA。

模板pET22b 重组子质粒电泳确认后准备进行PCR，pET28a质粒电泳确认后4℃保存准备酶切。

3.2 PCR扩增目标基因（1）取一个PCR管，在其中按顺序添加以下各成分反应液反应液：正链引物pet28kgf(+) 1μl负链引物pet28kgf(-) 1μldNTP 1μlBuffer 5μl模板pET22b重组子1μl双蒸水40μlTaq酶1μl总体积50μl（2）稍作离心。

（3）将反应管放入PCR仪中，按下列条件设计好程序，进行PCR 反应。

（4）反应程序：94 ℃条件下模板DNA预变性5分钟变性94 ℃30s退火52℃30s延伸72 ℃2min30个循环后，72 ℃条件下延伸10min补平单链。

（5）PCR反应结束后取2μl反应液用1.2% 琼脂糖凝胶进行电泳，鉴定PCR产物是否存在以及大小。

（6）电泳确认后，余下的PCR产物用试剂盒法进行纯化。

3.3 酶切A PCR产物酶切体系ddH2O 33μlPCR回收产物10μlEco RⅠ1μlXhoⅠ1μlXhoⅠ缓冲液5μl定容50μlB pET28a 酶切体系第一次酶切：ddH2O 34μlpET28a10μlEco RⅠ1μlEco RⅠ缓冲液5μl定容50μl酶切产物经回收后，进行第二次酶切第二次酶切：ddH2O 34μlpET28a 10μlXhoⅠ1μlXhoⅠ缓冲液5μl定容50μl（1）用手指轻弹管壁使溶液混匀，用离心机甩一下，使溶液集中在管底。

（2）混匀反应体系后，将Eppendorf管插于泡沫塑料板上，37 ℃水浴下反应6-8小时。

（3）酶切完全后用试剂盒法纯化产物。

（4）取2μl纯化后产物进行1.2 %琼脂糖凝胶电泳，确认酶切是否完全。

3.4 连接（1）在一1.5mlEppendorf 管中加入2μl酶切后的载体pET28a和6μl 酶切后的PCR产物片断。

（2）添加1μl的10 ×DNA缓冲液以及1μl的DNA连接酶。

即PCR产物6μlpET28a 2μl10×连接缓冲液1μlT4连接酶1μl总体积10μl（3）混匀后用离心机将液体全部甩到管底。

（4）16℃条件下保温过夜。

（5）利用宿主的感受态细胞进行转化实验。

3.5 转化3.5.1细菌感受态的制备（1）取5μl的BL21菌种接种于5 ml的LB培养基中，37℃振荡培养过夜。

（2）取100μl培养液转接于5 ml的LB液体培养基中37℃振荡培养2-2.5小时左右，使A600达0.4左右。

（3）将培养液1.5ml移至Eppendorf 管中，冰浴20分钟，使其停止生长。

（4）4℃条件下，3 000r/min离心5分钟，弃取上清液。

（5）添加0.75 ml预冷的60mmol/L氯化钙溶液，用枪轻轻吹打。

（6）冰浴20-30分钟后，4℃条件下，3000r/min离心5分钟，尽可能弃取上清液。