·研究论文·摘 要：非洲猪瘟病毒（ASFV ）p54蛋白由晚期基因E183L 编码，是主要的结构蛋白之一。
为了获得免疫原性强的p54蛋白，本研究将E183L 基因克隆至pFastBac1载体中，取1 µg 重组质粒转座DH10Bac 感受态细菌，经三轮蓝白斑筛选后，获得重组Bacmid-p54。
将提取的Bacmid-p54质粒DNA 转染Sf9细胞，出现明显病变后，收获细胞培养上清，在正常Sf9细胞中传三代，获得的杆状病毒命名为rBac-P54。
利用SDS-PAGE 检测rBac-P54感染后昆虫细胞的蛋白表达情况，并通过间接免疫荧光（IFA ）和Western-blot 鉴定p54蛋白的免疫原性。
结果显示，在感染的Sf9细胞中，p54蛋白能获得高效表达，并可被ASFV 阳性血清特异性识别。
这表明杆状病毒系统表达的p54蛋白具有良好的免疫原性，为后续开展非洲猪瘟血清学诊断和p54功能研究奠定基础。
关键词：非洲猪瘟病毒；p54蛋白；昆虫细胞表达系统；免疫原性中图分类号：S852.651 文献标志码：A 文章编号：1674-6422（2023）04-0164-06Expression and Identifi cation of African Swine Fever Virus p54 by BaculovirusExpression SystemAO Qingying 1,2, ZHONG Qiuping 2, SHI Xinjin 2, WEI Changqing 2, LIU Yingnan 2, LIAO Xinxin 2,XIE Zhenhua 2, QIAN Yingjuan 1, ZHENG Longsan 1, CHEN Hongjun 2(1. Key Lab of Animal Bacteriology, Ministry of Agriculture and Rural Affairs and MOE Joint International Research Laboratory of Animal Health and Food Safety College of V eterinary Medicine, Nanjing Agricultural University, Nanjing 210095, China; 2. Shanghai V eterinary ResearchInstitute, CAAS, Shanghai 200241, China)收稿日期：2021-04-30基金项目：十三五国家重点研发专项资助项目（2018YFC08400400，2017YFD0502300）；自然科学基金联合基金项目重点支持项目-区域创新发展联合基金项目（U19A2039）作者简介：敖清莹，硕士研究生，预防兽医学专业通信作者：陈鸿军，E-mail：***************.cn；郑龙三，E-mail：***************.cn非洲猪瘟病毒p54蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫原性分析敖清莹1,2，钟秋萍2，史馨瑾2，魏常青2，刘英楠2，廖欣欣2，谢振华2，钱莺娟1，郑龙三1，陈鸿军2（1.南京农业大学动物医学院 教育部动物健康与食品安全国际合作联合实验室 农业农村部细菌学重点实验室，南京210095；2.中国农业科学院上海兽医研究所，上海200241）Abstract: African swine fever virus (ASFV) p54 protein is encoded by the late gene E183L and is one of the major structural proteins. In order to obtain the high expression of ASFV p54 protein, the E183L gene was cloned into the pFastBac1 vector and 1µg of recombinant plasmid transposable was taken into DH10BAC competent bacteria. After two rounds of blue-white spot screening, the recombinant baculovirus rBac-p54 was obtained. The Bacmid-p54 plasmid DNA was transfected into Sf9 cells. When obvious CPE appeared, the supernatant of cell culture was harvested and passed into normal SF9 cells for three generations. The baculovirus rBac-p54 was used to infect insect cells and the protein expression was examined in SDS-PAGE, indirect immunofl uorescence and Western blot. The resultsChinese Journal of Animal Infectious Diseases中国动物传染病学报2023,31(4):164-169· 165 ·敖清莹等：非洲猪瘟病毒p54蛋白在昆虫细胞中的表达及其免疫原性分析 第31卷第4期showed that the recombinant baculovirus rBac-p54 was expressed for a large number of p54 protein in SF9 cells, which was specifi cally recognized by the positive serum of ASFV . The results indicated that the p54 protein expressed by baculovirus system had good reactivity, which laid a foundation for further study on the function of ASFV p54 protein.Keywords: African swine fever virus; p54 protein; insect cell expression system; immunogenicity非洲猪瘟（African swine fever, ASF）是由非洲猪瘟病毒（African swine fever virus, ASFV）引起的一种急性、热性、高度接触性猪传染病。
非洲猪瘟病毒的基因特征谢春芳1,2，于瑞嵩1,2，董世娟1,2，陈冰清1,2(1.上海市农业科学院畜牧兽医研究所，上海 201106；2.上海市农业遗传育种重点实验室动物遗传工程实验室，上海 201106)非洲猪瘟病毒(African Swine Fever Virus，ASFV)是非洲猪瘟病毒科(Asfarviridae)非洲猪瘟病毒属(Asfivirus)唯一的成员，是双链DNA 大分子病毒，基因组长度介于170 kb ～193 kb，编码150～167个蛋白，其基因组从DNA 的两条链上读取，基因紧密间隔，病毒基因组末端由碱基不完全配对的发夹环共价闭合。
发夹环以两种形式存在，互补并相互反转，与终端相邻的是多种串联的反向重复序列。
大多数ASFV 毒株的基因组GC 含量*为38％，GC 含量相对较低的区域位于基因组两端的左可变区(Left Variable Region，LVR)和右可变区(Right Variable Region，RVR)，容易发生基因变异的多基因家族(Multigene Family，MGF)分布于LVR 和RVR [1-2]。
1 与复制和转录相关的基因细胞被ASFV 感染后，病毒DNA 开始在细胞核周围复制，F1055L 蛋白在复制的起始时结合DNA，并与DNA 起始酶融合。
病毒基因组编码病毒基因转录和复制所需的酶、参与DNA 碱基切除修复(Base Excision Repair，BER)途径的酶、逃逸免疫的酶、多基因家族蛋白(MGF360、MGF110、MGF100、MGF505)、功能性蛋白、结构蛋白和许多目前未知的蛋白。
ASFV 编码基因有150多个，ASFV 基因编码早期表达的蛋白主要包括与基因组复制相关的蛋白、后期转录因子及与免疫逃逸相关的MGFs 蛋白；ASFV 结构蛋白主要在感染后期表达[3-6]。
ASFV 的转录机制类似于真核RNA 聚合酶Ⅱ(RNA polymerase Ⅱ，RNAP Ⅱ)系统，包括一个(8-亚基)ASFV RNAP 和TATA 结合蛋白(TATA Binding Protein，TBP)、转录起始因子Ⅱ B(Transcription Initiation Factor Ⅱ B，TF ⅡB)、延伸因子(Transcription Elongation Factor Ⅱ，TF Ⅱ)以及DNA 结合蛋白pA104R 和拓扑异构酶Ⅱ pP Ⅱ92R [3,7-9]。
这为非洲猪瘟病毒的检测提供了新技术，李兴旺（山东省武城县畜牧渔业发展中心，山东德州 253300）非洲猪瘟（asf）是家猪或野猪被非洲猪瘟病毒（asfv）感染而出现病变现象的一种疾病，为出血性病毒病的一种。
被asfv感染的猪多表现为呼吸受到明显限制、外部皮肤、内部器官不同程度的出血等，可给养猪业带来极大地冲击。
针对asf暂且没有很好的防治方法，世界动物卫生组织（oie）将该疾病列入通报名录中。
1 非洲猪瘟病毒早在20世纪初期非洲猪瘟就已出现过。
2018年8月，中国沈阳也发现1例疑似疫情，经检测确诊为非洲猪瘟病毒。
随之而来的是中国大面积爆发非洲猪瘟疫情。
作为动物传染病的一种，相较于其他传染病，非洲猪瘟的危害最大，致死率达100%。
现在还没有找到更好的防治措施。
非洲猪瘟病毒是一种dna病毒，且是双股线性的，分子组成复杂，具有极高的变异性能且蛋白极其丰富。
dna是双链单分子线状结构，且末端是共价闭合的，构成了非洲猪瘟病毒的基因组，其长度因毒株的不同而有所差异，范围在170～190kb，ore多达151个，可编码蛋白数量达到150～200种。
非洲猪瘟病毒在机体内的传播主要通过在巨噬细胞内进行复制来躲避机体产生自我免疫，从而使机体受到伤害。
非洲猪瘟具有多种基因型，具有极高的顽强力，温度和ph变化都不会对它产生影响，如果对其进行灭活处理，则需60℃的温度，时间为20 min。
病毒的存活在不同的寄宿环境中存活时间也不相同。
它可以在排泄物、尸体、新鲜肉类和其他肉类产品中寄生。
非洲猪瘟病毒对生存温度适应性极高。
无论是常温、低温、高温都有相当长的寿命。
存活时间在常温、4℃以下、冻肉中分别为6个月、1年、数年。
非洲猪瘟在猪群中的发病顺序通常是公猪、母猪、育肥猪和仔猪。
猪感染非洲猪瘟的发病特点是初期高热。
这时候农民就会误诊误治发热。
这样一来，病猪的死亡率会加快，打针会导致长期出血。
此时可以初步确定为非洲猪瘟。
比较明显的症状是肉眼观察身体表征发生变化，耳朵出现紫色，体表出现大面积紫色斑点。
浅谈非洲猪瘟病毒基因作者：章燕红，龚志成，周波，张其彬，蒋兵来源：《中国动物保健》2022年第06期摘要：非洲猪瘟病毒（ASFV）具有双链、线性的DNA基因组，基因可多达200多个。
虽然ASFV基因组整体突变率很低，但是ASFV的可变区基因和基因间区域不仅可能发生多个单核苷酸变化，部分基因可能发生基因重组、基因缺失、基因复制、序列分化等，表现为基因多样性。
本文就ASFV基因组、主要基因等进行综述，以期为科学防控非洲猪瘟提供参考。
关键词：非洲猪瘟病毒;基因组;基因;多样性非洲猪瘟病毒（African swine fever virus，ASFV）是非洲猪瘟病毒科的DNA病毒，病毒颗粒较大，直径为200～300nm，有囊膜，呈二十面体，具有五层结构，由内到外依次为基因组、内核心壳、内囊膜、衣壳、外囊膜[1，2]。
根据衣壳蛋白（p72）编码基因B646L序列的差异，可将ASFV分为24种基因型，不同基因型ASFV交叉保护率低，且基因组大小差异较大[1]。
1 基因组基因组（genome）是指一个生命单元（细胞或病毒等）所拥有的全部遗传物质（包括核内和核外遗传信息），其本质是DNA或RNA。
各种生物体基因组大小、所包含的基因数和种类有所不同。
病毒基因组可看作游离的基因，变化较大，可能是单链或双链，线状或环状，有些病毒基因可相互重叠，而ASFV的基因组是双链、线性的DNA基因组[3]。
根据NCBI （National Center for Biotech-nology Information）公布的ASFV基因组数据显示，ASFV基因组长度为169.931～193.886kb，最小的是2019年在越南河内市分离的毒株ASFV/Hanoi/2019，长度为169.931kb，最大的是1950年在肯尼亚分离的毒株ASFV/Kenya/1950，长度为193.886kb，大部分毒株基因组长度在189.37kb左右。
