肠道微生物的分离与鉴定方法

肠道微⽣物的分离与鉴定⽅法

⼀、有益菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，柔嫩梭菌，丁酸梭菌，芽孢杆菌（枯草、地⾐）。5种

有害菌：⼤肠杆菌，沙门⽒菌，产⽓荚膜梭菌，空肠弯曲杆菌。4种

⼆、厌氧菌：乳酸杆菌，双歧杆菌，产⽓荚膜梭菌，丁酸梭菌，柔嫩梭菌。5种

需氧菌：芽孢杆菌。1种

兼性厌氧菌：⼤肠杆菌，沙门⽒菌。2种

注：

境中⽣长最好。最适温度为37～42℃。在正常⼤⽓或⽆氧环境中均不能⽣长。

肠道正常菌群中95%以上为专性厌氧菌，兼性厌氧菌和需氧菌在正常菌群中所占⽐例较少。

三、⼀般检测菌株包括厌氧菌中的双歧杆菌、拟杆菌、优杆菌、消化性球菌、乳杆菌及梭菌。

需氧菌中的肠杆菌、肠球菌、葡萄球菌，及酵母菌等。

四、⽆氧环境的简易操作：1、⽅法来⾃⽂献《健康⽺驼粪球中主要正常菌群的分离与初步鉴定》

采⽤⼲燥器培养，1m3空间⽤焦性没⾷⼦酸10g、10%氢氧化钠溶液l00mL，按⽐例取10%的氢氧化钠液置于⼲燥器⽫底部，然后放置2到3个略⾼于液⾯的青霉素⼩瓶，再按⽐例称取焦性没⾷⼦酸⽤纸

包好，放在圆柱上。继⽽放上隔板,将接种完毕的培养基放于隔板上，同时放美蓝指⽰剂⼀管。盖上缸盖并⽤⽯蜡封闭。再轻轻摇动⼲燥器，使焦性没⾷⼦酸掉⼈氢氧化钠液中，反应后，⼲燥器内⽆氧，美蓝指⽰剂由蓝变⽩。置于温箱37℃培养24⼀48h观察结果。

2、⽅法来⾃⽂献《健康猪肠道菌群的分离培养与耐药性分析》

后者先拧紧瓶盖,放⼊密封性较好的玻璃罐(⽤凡⼠林封⼝)，通过蜡烛燃烧法制作简易厌氧装置。

五、CO2培养箱不可代替⽆氧培养箱

厌氧箱⼀般是组合⽓体90%氮⽓+5%氢⽓+5%⼆氧化碳，厌氧箱⾥⾯培养的微⽣物都是厌氧微⽣物；⽽⼆氧化碳培养箱⾥⾯是5%⼆氧化碳+95%空⽓，⾥⾯是有⼀部分氧⽓的。⼀般的研究认为严格厌氧菌的培养环境中O2的浓度必须⼩于1000ppm（千分之⼀），更严格的环境是⼩于300ppm（万分之三），本实验室CO2培养箱CO2浓度范围为280-2000ppm，所以CO2培养箱是不能⽤来培养严格厌氧菌。（1ppm即百万分之⼀）。

⽬前培养厌氧微⽣物的简便⽽⼜有效的技术包括有：厌氧箱培养技术；厌氧罐培养技术；厌氧袋培养技术；1.⼀般性的细菌培养标本若需延迟送检时，应置于4度冰箱保存，且不能超过24⼩时。

2.临床标本最佳运送时间取决于标本的量，少量液体（⼩于1ml）

或组织（⼩于1cm3）应在15~30分钟内送到实验室，较多量的标本置于运送培养基中可放12~24⼩时，厌氧培养标本原则上是床边接种，如延迟送检，需保存在厌氧运送培养基中，室温保存，不得超过24⼩时。低温对⼀些厌氧菌有害。1.采样和运输：同时间、同地点、同位置分别取两管平⾏粪样，可适量

多取，⼀管做需氧菌分离和提纯，另⼀管做厌氧菌的分离和提纯；需氧菌按原⽅案⽤冰块运输，厌氧菌放置于厌氧⽣物袋常温运输（⼀般认为，低温对某些厌氧菌有害，并且氧的溶解度较⾼）。2.保存: 标本送⾄实验室后，应尽快处理，最迟不超过24h。需氧菌放

置于4℃冰箱保存，厌氧菌放置于常温保存。3.分离、纯化：需氧菌按原计划进⾏。厌氧菌培养基中添加万分之五的

半胱氨酸或硫化钠做还原剂，消除培养⽫内部氧⽓。1.⼀般性的细菌培养标本若需延迟送检时，应置于4度冰箱保存，且

不能超过24⼩时。2.临床标本最佳运送时间取决于标本的量，少量液体（⼩于1ml）

或组织（⼩于1cm3）应在15~30分钟内送到实验室，较多量的标本置于运送培养基中可放12~24⼩时，厌氧培养标本原则上是床边接种，如延迟送检，需保存在厌氧运送培养基中，室温保存，不得超过24⼩时。低温对⼀些厌氧菌有害。

⽂献名称研

究

位

置

样

品培养基种类

培养

条件培养时间

培

养

温

度

微⽣

物种

类

胃肠道菌群和胃肠黏膜屏障的检测胃

肠

道

菌

粪

便

选择性培养基，具体

不详

需

氧，

厌氧 24-72h

检测

菌株

包

括：

双歧杆

菌，

拟杆

菌，

优杆

菌，

消化

性球

菌，

乳杆

菌及

菌，

肠杆

菌，

肠球

菌，

葡萄

球

菌，

及酵

母

菌。10种

贵州⼩型

猪胃肠道

正常菌群的初步检测肠

道

菌

粪

便10种菌的选择性培养

基和需氧、厌氧的⾮

选择性培养基

需

氧，厌氧

需氧

菌:24-48h,厌

氧菌:48-72h 37℃

双歧

杆

菌，

乳酸

菌，

拟杆

菌，

消化

球

荣球

菌，

梭

菌，

肠杆

菌，

肠球

菌，

葡萄

球

菌，

酵母

菌。10种

健康⽺驼

粪球中主

要正常菌

群的分离与初步鉴定肠

道

菌

粪

便普通琼脂培养基，⽢

油⾁汤浸液琼脂，EC

培养基，伊红美蓝培

养基，乳酸杆菌选择

培养基，⽣化试验⽤

培养基

需

氧，

厌氧 24-48h 37℃

双歧

杆

菌，

乳酸

杆

菌，

酵母

拟杆

菌，

芽孢

杆

菌。5

种

健康猪肠

道菌群的

分离培养与耐药性分析肠

道

菌

粪

便

麦康凯琼脂，MRS增

菌液，HYA琼脂，TYP

琼脂

需

氧，

厌氧需氧菌:24h,

厌氧菌:48h 37℃

⼤肠

杆

菌，

乳酸

杆

菌，

双歧

杆

菌。3

种

健康与腹泻幼⽝肠

道菌群数量差异分析研究肠

道

菌

粪

便

普通和SS琼脂培养

基，⽢油⾁汤浸液琼

脂培养基，MRS乳酸

菌、EC肠球菌、EMB

肠杆菌，TPY双歧杆

需

氧，

厌氧 24-48h 37℃

⼤肠

杆

菌，

沙门

⽒

菌选择培养基，麦康凯培养基，⽣化试验⽤培养基菌，肠球菌，乳酸杆菌，双歧杆菌。5种

健康鸽与

腹泻鸽肠道菌群⽐较研究肠

道

菌

取

肠

道MRS培养基，营养琼脂平板，双歧杆菌培

养基，麦康凯培养基，EC培养基，⽣化试验

培养基

需

氧，

厌氧 24-72h 37℃

芽孢

杆菌,

乳酸

杆菌,

双歧

杆菌,

⼤肠

杆菌,

肠球

菌。5

种

⽔貂粪便粪营养琼脂培养基，莫厌氧 48-72h 37℃乳酸

乳酸杆菌的分离与鉴定便匹罗星锂盐改良MRS

培养基，营养⾁汤培

养基，⽣化试验培养

基

杆

菌，

嗜酸

性乳

酸杆

菌，

⼲酪

乳酸

杆

菌。3

种

猪源益⽣芽孢杆菌的分离鉴定与⽣物学特性分析粪

便LB培养基，淀粉培养

基，酪素培养基，羧

甲基纤维素钠培养

基。

需

氧，

厌氧 18-24 h 37℃

嗜热

脂肪

芽孢

杆

菌，

地⾐

芽孢

杆

菌，

枯草

芽孢

杆

菌。3种厌氧菌在有氧的情况下不能⽣长。要培养厌氧菌，必须创造⼀个

环境中的游离氧，以降低氧化还原电势。如疱⾁培养基、硫基⼄酸钠培养基，⽜⼼脑浸液培养基等。常⽤的厌氧培养⽅法有许多，可根据实际情况选⽤。1.厌氧缸法：接种好标本的平板或液体培养基试管，可放⼊厌氧缸内培养，厌氧缸是普通的⼲燥缸，⽤物理化学的⽅法使缸内造成厌氧环境，从⽽将厌氧菌培养出来。2.厌氧袋：即在塑料袋内造成厌氧环境来培养厌氧菌。塑料袋透明⽽不透⽓，内装⽓体发⽣管、美兰指⽰剂管、钯催化剂管、⼲燥剂。放⼊已接种好的平板后，尽量挤出袋内空⽓，然后密封袋⼝。先折断⽓体发⽣管，后折断美兰指⽰剂管，命名袋内在半⼩时内造成⽆⽓环境。如不突变表⽰袋内已达厌氧状态，可以孵育。3.厌氧⼿套箱：是迄今为⽌国际上公认的培养厌氧菌最佳仪器之⼀。它是⼀个密闭的⼤型⾦属箱，箱的前⾯有⼀个有机玻璃做的透明⾯板，板上装有两个⼿套，可通过⼿套在箱内进⾏操作，故名。箱侧有⼀交换室，具有内外⼆门，内门通箱内先关着。欲放物⼊箱，先打开外门，放⼊交换室，关上外门进⾏抽⽓和换⽓达到厌氧状态，然后⼿伸⼊⼿套把交换室内门打开，将物品移⼊箱内，关上内门。箱内保持厌氧状态，也是利⽤充⽓中的氢在钯的催化下和箱中钱残余氧化合成⽔的原理。该箱可调节温度，本⾝是孵箱或孵箱即附在其内，还可放⼊解剖显微镜便于观察厌氧菌菌落，这种厌氧箱适于作厌氧细菌的⼤量培养研究，⼤量培养基可放⼊作预还原和厌氧性⽆菌试验。⾦属硬壁型厌氧箱的抽⽓、充⽓、厌氧环境和温度等均系⾃动调节。4.厌氧盒：原理同厌氧袋，有成品销售。

5.⽣物耗氧法：在⼀密闭的容器内放以⽣物，消耗氧⽓，同时产⽣⼆氧化碳，供细菌⽣长⽤。我没见过。

6.焦性末⾷⼦酸法：在⼀洁净的玻⽚上铺上纱布或滤纸，均匀撒上焦性末⾷⼦酸，然后再混⼊NaHCO3粉末或NaOH溶液，迅速将已接种细菌的平板倒扣在上⾯，⽤融化的⽩蜡封边，造成⼀个封闭空间。焦性末⾷⼦酸与碱反应后耗氧。该法⽤于厌氧不严格的厌氧菌的培养，简单。如有梭状芽孢杆菌。7.疱⾁培养基：本⾝就是⼀个不需特殊设备的厌氧培养法。疱⾁和⾁汤装⼊⼤试管，液⾯封凡⼠林，造成⽆氧环境。

厌氧菌标本采集与送检必须注意两点：标本绝对不能被正常菌群所污染;应尽量避免接触空⽓。1. 采集：

采集标本须注意：不被正常菌群污染，并尽量避免接触空⽓。采集深部组织标本时，需⽤碘酒消毒⽪肤⽤注射器抽取，穿刺针头应准确插⼊病变部位深部，抽取数毫升即可，抽出后可排出⼀滴标本于酒精棉球上。若病灶处标本量较少，则可先⽤注射器吸取1ml还原性溶液或还原性⾁汤，然后再抽取标本。在紧急情况下，可⽤棉拭取材，并⽤适合的培养基转送。厌氧培养最理想的检查材料是组织标本，因厌氧菌在组织中⽐在渗出物中更易⽣长医。

⽤于厌氧菌培养的标本不同于⼀般的细菌培养，多采⽤特殊的采集⽅法，如针筒抽取等，应严格⽆菌操作，严禁接触空⽓。

不同部位标本采集⽅法也各有不同特点。2.送检⽅法与处理

标本送到实验室后，应在20～30min内处理完毕，最迟不超过2 h，以防⽌标本中兼性厌氧菌过度繁殖⽽抑制厌氧菌的⽣长。如不能及时接种，可将标本置室温保存(⼀般认为，冷藏对某些厌氧菌有害，⽽且在低温时氧的溶解度较⾼)。1)针筒运送：⼀般⽤⽆菌针筒抽取标本后，排尽空⽓，针头插⼊⽆菌橡⽪塞，以隔绝空⽓，⽴即送检。这种⽅法多⽤于液体标本的运送，如⾎液、脓液、胸腹⽔、关节液等医.2)⽆菌⼩瓶运送：⼀般采⽤⽆菌的青霉素⼩瓶，瓶内加⼀定量的培养基和少量氧化还原指⽰剂，⽤橡⽪盖加铝盖固定密封，排除瓶内空⽓，充以C02⽓体。同时先观察瓶内氧化还原指⽰剂的颜⾊，以判断瓶内是否为⽆氧环境，如合格将⽤⽆菌注射器将液体标本注⼊瓶中即可。3)棉拭⼦运送⼀般不采⽤棉拭⼦运送，如果使⽤该⽅法，⼀定使⽤特制运送培养基，确保⽆氧环境，确保不被污染，确保快速送检。4)厌氧罐或厌氧袋运送将厌氧罐或厌氧袋内装⼊可有效消耗氧⽓的物质，确保⽆氧环境。该⽅法⼀般⽤于运送较⼤的组织块或床边接种的培养⽫等。

厌氧菌⼴泛存在于外界环境和⼈体的⼝腔、肠道和⼥性⽣殖道等部位，常引起内源性感染。据⽂献报道，约60 % 的临床感染有厌氧菌参与，且⼤多数是与需氧菌混合感染，故开展厌氧菌的检验对感染的诊断、治疗都有重要意义。

⼀、厌氧菌样品的采集Collection of anaerobic bacteria' s speci mens

标本避免正常菌群污染和氧接触，采⽤下列⽅法：(1) 脓胸及未破溃的脓肿：⽪肤消毒后，以⽆菌注射器抽取(排尽空针及针头内的⽓体) ，将针头插⼊⽆菌橡⽪塞内送检。

(2) 肺分泌物和痰标本：⽤⽀⽓刷采取或环甲膜穿刺术。

(3) 尿液标本：⽤⽆菌注射器从耻⾻上缘⾏膀脱穿刺术抽取。

(4) ⾎液标本：可⽤两端接有⽆菌针头的塑料袋或橡⽪导管，将⼀端针头刺⼊静脉，待⾎液流出后将另⼀端针头⽴即插⼊培养瓶内(瓶内负压) ，使⾎液直接流⼊培养瓶内。(5) 窦道、深部脓肿等的标本:可⽤特别采样器采取。