实验室常用分离技术原理及操作共23页文档

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超离心机
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9.4微生物细胞的破碎与分离
分类 珠磨法
机械法
作用机理 固体剪切作用 液体剪切作用
适应性 可达较高破碎率，可较大规模操 作，大分子目的产物易失活 可达较高破碎率，可较大规模操 作，不适合丝状菌和革兰氏阳性菌
要分离和提取胞内产物，就必须进行细胞破 对酵母菌效果较差，破碎过程升温 超声破碎法 液体剪切作用 碎，使目标产物释放转入液相，然后进一步分离、 剧烈，不适合大规模操作 纯化。细胞破碎的方法很多，一般按是否使用外 具有高度专一性，条件温和，浆液 酶溶法 酶分解作用 加力分为机械法和非机械法两类。 易分离，溶酶价格高，通用性差
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•9.1.2生物物质分离的一般步骤 生物分离技术笼统的四步骤：
◊ 预处理和固液分离：过滤和离心操作常用于此过程。 如果产物在细胞内，收集细胞后就还要进行细胞的破碎 和细胞碎片的分离。 ◊ 杂质粗分(初步分离)：用吸附和溶剂萃取等方法。 ◊ 纯化：通常利用色谱法、膜过滤法等。 ◊ 精制：获得最终产品，通常采用结晶法。大部分产品 还必须进行干燥处理。
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•9.23调节pH
pH值直接影响发酵液中某些物质的电离度和电荷性质， 适当调节pH值便可改变其过滤特性。蛋白质属两性电解质， 两性电解质在溶液中的pH值处于等电点时分子表面净电荷为 零，导致赖以稳定的双电层及水化膜的消弱或破坏，分子间 引力增加，溶解度最小。因此，调节溶液的pH，使两性溶质 的蛋白质溶解度下降析出。如味精生产中就是利用等电点 (pI＝3.22)沉淀法提取谷氨酸的。
国家十一五规划教材《生物工艺学》（邱树毅主编）配套课件
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• • • • • • • • • • 第一章 绪论 第二章 工业微生物菌种选育、制备与保藏 第三章 工业培养基及其设计 第四章 生物工艺过程中的无菌技术 第五章 生物反应动力学 第六章 发酵过程原理 第七章 生物反应器及生物工艺过程的放大 第八章 生物反应过程参数检测与控制 第九章 生物产品分离及纯化技术 第十章 生物产品工艺学及应用

精馏装置原理精馏是一种重要的化学分离技术，它在广泛的应用中起着重要的作用。

精馏的原理是利用不同成分在特定温度和压力下的升华和凝聚来分离混合物中的组分。

精馏通常通过特定的装置来实现。

一般而言，精馏可分为简单精馏和复杂精馏。

这两种方法主要的区别在于它们的原理和操作上的差异，以及其中复杂精馏具有更好的分离效果和应用范围。

以下是具体的原理及操作介绍。

1. 简单精馏原理简单精馏是最基础的精馏方法，它适用于分离具有较小沸点差异的混合物。

原理是将混合物加热并使其升华，然后在冷凝器中冷却并使其凝结。

这样就可以将混合物中的不同成分根据其沸点进行分离。

简单精馏要求混合物的沸点差异不能太大，一般应在25℃以下。

2. 简单精馏操作步骤简单精馏的操作步骤如下：（1）将混合物倒入精馏瓶中，并添加适量木炭或活性炭以减少杂质的影响。

（2）将精馏瓶连同冷凝器、配件和鼓风机装置等连接在一起。

（3）将精馏瓶内的混合物加热并使其升华，利用鼓风机将升华的气体引入冷凝器中。

（4）在冷凝器中通过冷却液使升华的气体冷却并凝固，分离出不同成分。

（5）将分离出的组分逐一收集，保存并进行后续检测。

3. 复杂精馏原理相比简单精馏，复杂精馏需要更加先进的设备和技术，可以分离不同沸点差异更大的混合物。

在现代工业及实验室中广泛使用的复杂精馏方法主要包括气相色谱法、液相色谱法、毛细管电泳法等。

这些方法都依赖于不同升华和凝聚速度的成分表现出不同的行为。

4. 复杂精馏操作步骤由于不同的精馏方法和设备有其固有的特征，因此复杂精馏方法的具体操作方法也略有不同。

以下是通用的几个步骤：（1）首先将混合物装入特定的精馏装置。

（2）启动加热器升温，并在适当的温度下保持一段时间。

（3）如果需要进行软件和硬件调整，则在采集过程中把控温度和压力等因素。

（4）根据需要，考虑使用特定的分离方法，例如液相色谱法、气相色谱法或毛细管电泳法，以获得更好的分离效果。

（5）根据原材料和需要目的，进行必要的分离收集。

了解配位化合物在 化学、生物和环境 等领域的应用
学会利用配位化合 物分离技术进行实 验操作和数据分析
理解配位化合物分 离技合物分离技术实验所需的材料包括：分离剂、吸附剂、洗脱剂等。 实验材料的选择应根据分离对象的不同而有所差异。 实验材料的质量和纯度对实验结果的影响至关重要。 在实验过程中，应严格控制实验材料的使用量和配比，以确保实验结果的准确性和可靠性。
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数据分析：对实验数据进行了统计 分析，得出了配位化合物的热力学 稳定性、反应速率常数等重要参数。
结论总结：根据实验结果，总结出 配位化合物分离技术的优缺点，以 及在实际应用中的适用范围。
实验结果：分离出 目标配位化合物， 数据记录准确
结果分析：通过对 比实验数据，分析 分离效果与影响因 素
催化剂：配位化合物可用作催化剂，加快化学反应速率，提高产物的选择性。
药物合成：配位化合物可用于药物合成中，控制药物的释放和吸收，提高药物的疗效和降低副 作用。
环保领域：配位化合物可用于处理工业废水中的重金属离子，降低其对环境的危害。
药物分析：配位化合物分离技术用于分离和检测药物中的微量元素
生物成像：利用配位化合物分离技术提取生物体内的标记物，实现生物成像 疾病诊断：通过配位化合物分离技术检测生物样本中的标志物，辅助疾病诊断
实验结果分析：对实 验结果进行分析，比 较不同分离方法的优 缺点，总结实验经验。
实验过程中应及时记录数据 数据应准确无误，避免涂改 实验结束后，对数据进行整理和分析 数据处理时应注意误差分析和统计方法的使用
实验数据记录：准确记 录实验过程中的各项数 据，包括配位化合物的 含量、分离效率等。
结果处理：对实验数 据进行处理和分析， 计算分离效率、回收 率等指标。

常用的几种典型的病原菌分离方法1．斑点病原菌的分离从病斑部分切取每边3～5 mm的小块组织，在70％酒精中浸数秒钟后，移入0.1％的升汞水溶液中处理3～5 min，以灭菌水冲洗3次，移置培养皿的培养基中，然后培养。

2．维管束组织内病原菌的分离从根茎维管束组织分离病菌，可先将寄主病部表面用70％酒精擦拭消毒，将表皮组织用灭菌的解剖刀削去，然后切取其中小块变色的维管束组织，用升汞或漂白粉液消毒后。

，用灭菌水冲洗几次，移置培养基面上。

3．根腐病病原菌的分离根腐或基腐病的分离，由材料的大小决定。

材料小的可仿照斑点病的分离法，材料大的则可以用维管束组织内病原的分离法。

4．肉质组织中病原菌的分离多肉的根、茎及果实等，可以采用维管束组织内病菌分离法除去表面组织，切取小块病组织分离。

如有杂菌感染可采用“直接接种”法，待出现症状后，用此法再行分离。

5．种子内病原菌分离将整个种子或者种子的一部分进行表面消毒(升汞或漂白粉)，用灭菌水洗涤后，移置培养基上。

6．孢子分离法能产生大量孢子的病菌如青霉素、链格孢等，则可配制成孢子悬浮液以稀释法或划线法分离之。

7、土壤带菌分离法为了研究一些真菌在土壤中存活和分布的情形，从有病的土壤中分离它们是必要的。

分离方法是将土壤取出少许，配制成悬浮液，然后用稀释法或划线法分离。

附录2 真菌单孢子分离技术一、目的要求了解单孢分离技术的基本原理，掌握简便实用的单孢分离方法。

二、基本原理单孢分离的方法很多，如振落法、稀释法和直接挑取法。

振落法和稀释法的共同点都是采用某种方法，使真菌孢子较稀疏地分散在水琼脂平板上，然后在显微镜下检查寻找在水琼脂平板表面的单个孢子，一旦找到理想的单个孢子，就通过无菌操作将其(连同一部分培养基)移植到PDA斜面培养基上，置适温下培养，形成的菌落即为单孢系菌株。

直接挑取法是在实体解剖镜下直接挑取单个孢子进行分离纯化的方法。

三、材料、用具与仪器1．材料(依本地资源情况进行选择，下列材料供参考)(1) 稻瘟病叶、病节、病穗颈(Pyricolaria oryzae)。

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优点
操作简便，成本低。
缺点
分辨率较低，只能分离一种核酸。
聚合物沉淀法
原理
利用高分子聚合物将核酸从蛋白质等其他细胞组分中沉淀 出来。
优点
操作简便，对设备要求不高。
步骤
将细胞破碎后的混合物加入离心管，然后加入聚合物溶液 ，进行离心或搅拌，核酸会与聚合物结合形成沉淀，而蛋 白质等其他组分则留在上清液中。
将细胞破碎后的混合物加入离 心管，然后加入氯化铯溶液， 形成密度梯度，进行离心，核 酸会沉降到管底，而蛋白质等 其他组分则浮在上方。
分辨率高，可同时分离多种核 酸。
操作复杂，需要精密的设备。
密度梯度离心法
原理
利用连续的密度梯度将核酸与蛋白质等其他细胞组分分开。
步骤
将细胞破碎后的混合物加入离心管，然后加入密度梯度介质，进行离 心，核酸会沉降到管底，而蛋白质等其他组分则浮在上方。
样品特性
考虑样品的性质和组成，如蛋白质和核酸的分子 量、电荷密度和溶解度等。不同分离方法对不同 特性的蛋白质和核酸的分离效果可能有所不同， 因此需要根据实际情况进行选择。
实验条件
考虑实验室的条件和资源，如设备、空间和预算 等。如果实验室具备离心机和适当的离心管，则 可以选择离心法；如果实验室空间较为紧张，则 可能需要选择操作更为简便的方法。
总结词
其他不常用的蛋白质沉淀分离技术。
详细描述
除了上述三种常用的蛋白质沉淀分离技术外，还有一些不常用的蛋白质沉淀分离技术，如等电点沉淀 法、金属离子沉淀法、免疫沉淀法等。这些方法各有特点，但使用时需根据具体情况选择合适的分离 技术。
03
核酸沉淀分离技术
氯化铯不连续梯度离心法
原理
步骤

㈤、凝胶过滤层析技术
⒈ 基原理
概念（排阻层析，分子筛层析）： 当生物大分子通过装有凝胶颗粒 的层析柱时，根据它们分子大小 不同而进行分离的技术。 原理：凝胶颗粒内部具有多孔网 状结构，被分离的混合物流过层 析柱时，比凝胶孔径大的分子不 能进入凝胶孔内，在凝胶颗粒之 间的空隙向下移动，并最先被洗 脱出来； 比网孔小的分子能不同程度的自 由出入凝胶孔内外，在柱内经过 的路程较长移动速度较慢，最后 被洗脱出来。
⒊ 分配纸层析
纤维素吸附的水是固定相，展层用的有 机溶剂是流动相
层析时混合氨基酸在这两相中不断分配， 使他们分布在滤纸的不同位置上。
此项技术可用于氨基酸成分的定量定性 测定。
⒊ 分配纸层析
操作：点样→展层→显 色用茚三酮显色时，得到 一个滤纸层析谱。 定义：原点到氨基酸停 留点的距离与原点至溶剂 前沿之比称为Rf值。 只要把溶剂系统、温度、 滤纸型号等条件确定，则 每一种氨基酸的Rf值是一 个确定值。
⒊ 分析型超速离心机
XL-A分析型超速离 心机 主要技术指标： 检测波长范围 200nm800nm 转子最大转速 40000RPM
什么是酶的活性中心？ 三维结构上比较接近的少数特异的氨基酸残基参与底物的 结合与催化作用，这一与酶活力直接相关的区域称酶的活 性部位。 在很多酶的活性中心均有His残基参与，原因是什么? 酶蛋白分子中组氨酸侧链咪唑基pK值为6.0-7.0，在生理条 件下，一半解离，一半不解离，因此既可以做质子供体，也 可以做质子受体，可以作为广义酸碱共同催化反应。 胰凝乳蛋白酶活性中心的催化三联体是指哪三种氨基酸？
⑵ 按两相所处的状态分类 流动相有两种状态：
*液体作为流动相 *气体作为流动相 固定相也有两种状态： *固体吸附剂作为固定相 *以吸附在固体上的液体作为固定相

实验室常用分离技术原理及操作实验室中常用的分离技术包括离心法、层析法、电泳法、过滤法和蒸馏法等。

下面对这些常用的分离技术原理及操作进行详细介绍。

1.离心法离心法是利用离心机的离心力，将混合物中的组分按照不同密度分离开来的一种分离技术。

其原理是根据组分的密度差异来分离。

操作步骤如下：(1)将待分离的混合物均匀地倒入离心管中。

(2)将离心管盖紧，并放入离心机中。

(3)启动离心机，使之以一定的转速旋转一定时间。

(4)停止离心机并取出离心管。

(5)将管内上清液或下沉物取出即可。

2.层析法层析法是基于不同物质在固定相和移动相之间分配系数不同而实现分离的方法。

原理是通过移动相在固定相上的运动，使不同成分在两相之间分配，从而分离出不同组分。

操作步骤如下：(1)准备好层析柱，并充填固定相。

(2)将待分离的混合物溶解于适当的移动相中。

(3)在层析柱中加入适当的移动相，待流速稳定后，开始加样。

(4)加样后，根据不同组分的分配系数，它们在固定相和移动相之间的分配程度不同，从而实现分离。

(5)收集流出的组分，并进行后续分析或操作。

3.电泳法电泳法是将带电粒子在电场作用下进行运动而实现分离的方法。

根据带电粒子的运动方式和性质的不同，电泳法可以分为凝胶电泳、毛细管电泳和等电点电泳等不同类型。

以凝胶电泳为例，操作步骤如下：(1)准备好电泳槽和凝胶。

(2)在凝胶中形成电泳孔。

(3)将样品与适当的电泳缓冲液混合后，加载在电泳孔中。

(4)打开电源，开启电场，使带电的样品分子在电场作用下进行运动。

(5)根据带电粒子的大小和电荷以及凝胶孔道的大小，不同的组分将以不同的速度迁移，从而实现分离。

4.过滤法过滤法是通过孔隙较小的过滤介质，如滤纸、滤膜或滤芯等，将混合物中的固体颗粒或大分子物质与溶液分离的方法。

操作步骤如下：(1)准备好过滤介质并装入过滤设备中。

(2)将混合物倒入过滤设备中。

(3)混合物中的液体部分通过过滤介质，而固体颗粒或大分子物质被截留在过滤介质上。

实验三十四植物叶绿体色素的提取、分离、表征及含量测定摘自王尊本主编,综合化学实验(第二版),第226-244页,北京:科学出版社,2007年9月。

实验三十四植物叶绿体色素的提取、分离、表征及含量测定[1-27]一、叶绿体色素的提取(一) 实验目的1)掌握有机溶剂提取叶绿体色素等天然化合物的原理和实验方法。

2)了解皂化-萃取提取胡萝卜素的原理。

3)了解1,4-二氧六环沉淀法提取叶绿素的原理。

(二) 实验原理植物光合作用是自然界最重要的现象,它是人类所利用能量的主要来源。

在把光能转化为化学能的光合作用过程中,叶绿体色素起着重要的作用。

高等植物体内的叶绿体色素有叶绿素和类胡萝卜素两类,主要包括叶绿素a、叶绿素b、胡萝卜素和叶黄素四种。

它们所呈现的颜色和在叶绿体中含量大约比例见表34.1。

表34.1 高等植物体内叶绿体色素的种类、颜色及含量项目叶绿素类胡萝卜素叶绿素a 叶绿素b 胡萝卜素叶黄素颜色蓝绿色黄绿色橙黄色黄色在叶绿体内各色素含量比例 3 1 2 13 1 叶绿素chlorophylls是叶绿酸的酯,它在植物进行光合作用中吸收可见光,并将光能转变为化学能。

叶绿素是植物进行光合作用所必需的催化剂。

在绿色植物中叶绿素主要以叶绿素a(C55H72O5N4Mg)和叶绿素b(C55H70O6N4Mg)两种结构相似的形式存在,其差别仅是叶绿素a中一个甲基被叶绿素b中的甲酰基所取代。

叶绿素的基本结构见图34.1。

在叶绿素分子结构中含有四个吡咯环,它们由四个甲烯基联结成卟啉环,在卟啉环中央有一个镁原子,它以两个共价键和两个配位键与4个吡咯环的氮原子结合成内配盐,形成镁卟啉。

在叶绿素分子中还有两个羧基,其中一个与甲醇酯化成COOCH3,另一个与叶绿醇酯化成COOC20H39长链。

类胡萝卜素carotenoids是一类不饱和的四萜类碳氢化合物(例如胡萝卜素,carotenes,或它们的氧化衍生物(例如叶黄素类,xanthophylls。

分离方法探讨：萃取分离法的原理，特点、应用及进展摘要近年关于萃取技术研究进展很快，各种萃取方法层出不穷但各有其优缺点，现通过对几种比较流行的萃取方法进行总结归纳，并对未来萃取分离技术进展的特点做些分析。

随着科技水平发展以及对于各种科研需要关于萃取技术这方面的研究不断更新，新的方法不断研究出来，本文简单归纳介绍了以下几种常用方法：1.固相萃取技术2.亚临界水萃取技术3.液相微萃取技术。

另外补充说明近年来我国稀土工业发展中萃取技术的应用情况和未来的发展趋势。

关键词：萃取分离；分离过程；发展趋势引言分离过程是将混合物分成组成互不相同的两种或几种产品的操作[1]。

在化工生产中，分离操作一方面为化学反应提供符合质量要求的原料，清除对反应或催化剂有害的杂质，减少副反应和提高收率；另一方面对反应产物进行分离提纯，得到合格的产品，并且使未反应的物料循环利用，对生成的三废进行末端治理。

对于大型的石油工业和以化学反应为中心的石油化工生产过程，分离装置的费用占总投资的50％～90 oA。

因此，分离操作在提高石油化工生产过程的经济效益和产品质量中起着举足轻重的作用。

此外，分离操作也广泛应用于医药、材料、冶金、食品、生化、原子能和环境治理等领域。

传统的提取物质中有效成分的方法复杂，而且产品的纯度不高易含有有毒有害物质在其中。

萃取分离法是一种新型的分离技术，是将样品中的目标化合物选择性的转移到另一相中或选择性的保留在原来的相中，从而使目标化合物与原来的复杂基体相互分离方法。

通过萃取分离这个重要单元操作步骤，可以达到产品提纯率高，纯度好，能耗低等优点。

这种方法不仅在化工医药领域得到广泛应用，而且在食品，烟草，香料，稀土行业得到极大认可。

随着科技的更新和进步，萃取分离技术也在不断的改进优化，新型的萃取分离技术不断出现并完善，这项技术在未来具有广阔的发展前景。

文献研究综述1.1萃取原理萃取是利用系统中组分在溶剂中有不同的溶解度来分离混合物的单元操作，利用相似相溶原理，萃取有两种方式：1.1.1 液-液萃取液-液萃取，用选定的溶剂分离液体混合物中某种组分，溶剂必须与被萃取的混合物液体不相溶，具有选择性的溶解能力，而且必须有好的热稳定性和化学稳定性，并有小的毒性和腐蚀性。

3. 分类 – 与羧基、胺及杂环等含氮化合物结合；如Mn2+、Fe2 + 、Zn2 + 、 Cu2 +等 – 与羧基结合，不与胺及杂环等含氮化合物结合；如Ca2 + 、Ba2 + 、 Mg2 + 、Pb2 +等 – 与巯基结合；如Hg + 、Ag + 、Pb2 +等
3、特点
• 沉淀效果很好； • 选择性好 • 容易使生物分子变性 • 复合物难分解
• 丙酮（浓度40-50%） ：沉析作用更强，用量省，但毒 性大，应用范围不广；
• 特点：
– 介电常数小， 60%乙醇的介电常数是48
– 容易获取
40-50%丙酮的介电常数是22
4.有机溶剂沉淀的特点
• 分辨率高； • 溶剂容易分离，并可回收使用； • 产品洁净（有机溶剂易祛除）； • 容易使蛋白质等生物大分子变性失活； • 应注意在低温下操作； • 成本高
沉淀法分离蛋白质的特点有：
1 在生产的前期就可使原料液体积很快地减小10～50 倍，,从而简化生产工艺、降低生产费用；
2 使中间产物保持在一个中性温和的环境；
3 可及早地将目标蛋白从其与蛋白水解酶混合的溶液中 分离出来、避免蛋白质的降解，提高产物稳定性；
4 用蛋白质沉淀法作为色谱分离的前处理技术，可使色 谱分离使用的限制因素降到最低。
（七）选择性变性沉淀法
• 选择一定的条件使溶液中存在的某些杂质蛋白 变性沉淀下来，而与目的物分开，这种分离方 法就称为选择性变性沉淀法
• 在操作之前要对欲分离的物质中的杂蛋白等杂 质的种类、含量及其物理化学性质等有比较全 面的了解。
使用时需慎重！！！！
选择性变性的方法
• 选择性热变性：对于α-淀粉酶等热稳定性好 的酶，可以通过加热进行热处理，使大多数杂 蛋白受热变性沉淀而被除去。

氨基酸分离的主要技术及原理林锦池董越范雪雪摘要：本文对氨基酸分离提纯常用的沉淀法、离子交换法、萃取法、吸附法、毛细电渗析法、膜分离法以及结晶法等方法的技术原理及研究进行较全面的总结。

1 沉淀法沉淀法是最古老的分离、纯化方法，目前仍广泛应用在工业上和实验室中。

它是利用某种沉淀剂使所需要提取的物质在溶液中的溶解度降低而形成沉淀的过程。

该方法具有简单、方便、经济和浓缩倍数高的优点。

氨基酸工业中常用沉淀法有等电点沉淀法，特殊试剂沉淀法和有机溶剂沉淀法。

1．1 利用氨基酸的溶解度分离或等电点沉淀法在生产中常利用各种氨基酸在水和乙醇等溶剂中溶解度的差异，将氨基酸彼此分离。

如胱氨酸和酪氨酸在水中极难溶解，而其它氨基酸则比较易溶；酪氨酸在热水中溶解度大，而胱氨酸则无大差别。

根据此性质，即可把它们分离出来，并且互相分开。

另外，可以利用氨基酸的两性解离有等电点的性质。

由于氨基酸在等电点时溶解度最小，最容易析出沉淀，所以利用溶解度法分离氨基酸时，也常结合等电点沉淀法。

1．2特殊试剂沉淀法某些氨基酸可以与一些有机或无机化合物结合，形成结晶性衍生物沉淀，利用这种性质向混合氨基酸溶液中加入特定的沉淀剂，使目标氨基酸与沉淀剂沉淀下来，达到与其它氨基酸分离的目的。

较为成熟的工艺有：缬氨酸与苯甲醛在碱性和低温条件下，可缩合成溶解度很小的苯亚甲基精氨酸，分离这种沉淀，用盐酸水解除去苯甲醛，即可得精氨酸盐酸盐；亮氨酸与邻一二甲苯一4一磺酸反应，生成亮氨酸的磺酸盐，后者与氨水反应得到亮氨酸；组氨酸与氯化汞作用生成组氨酸汞盐的沉淀，再经处理就可得到组氨酸。

特殊试剂沉淀法虽然操作简单、选择性强，但是由于沉淀剂回收困难，废液排放污染严重，残留沉淀剂的毒性等原因已逐渐被它方法取代。

工业应用举例：选择性沉淀分离亮氨酸、精氨酸的方法该方法包括下述步骤：将二氯苯磺酸加入到毛发酸水解液中，所述二氯苯磺酸和所述水解液之间的重量/体积比为二氯苯磺酸∶水解液＝1∶5～20；搅拌所述毛发酸水解液；将生成的亮氨酸沉淀物进行分离以获取亮氨酸。

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6. 离子交换剂 葡聚糖凝胶离子交换剂 在 G—25或G—50葡聚糖凝胶上引入
羧甲基、磺乙基、磺丙基、二乙基氨乙 基及季铵乙基等而制成的既具凝胶的优 点又具离子交换性质的载体，在生化及 天然化合物方面得到广泛应用。
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7．硅藻土 硅藻土商品名 celite，是高度多孔的，比
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5．葡聚糖凝胶 分子筛的原理
(1) 亲水性葡聚糖凝胶
葡聚糖凝胶是由一定分子量的葡聚糖(右旋糖苷， dextran)悬浮于有机相中，加入交联剂使葡聚糖交联 聚合而成．其商品名为Sephadex，加入交联剂量不 同可制成不同交联度的凝胶．
交联度越大，网状结构越紧密，吸水时膨胀体积越 小．
(3) 离子交换薄层色谱 由含有交换活性基团的纤维素铺成薄层。
(4) 分子排阻薄层色谱 也称凝胶薄层。利用样品中分子大小 不同、受阻情况不同加以分离。
(5) 亲和薄层色谱 利用酶、受体、抗原抗体特异性识别作用。
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二、TLC 的技术参数 1. 比移值: 一个化合物在薄层板上上
溶液（0.5％）（1：3），研成糊状，倒入板上铺 布。
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0.5％CMC-Na配制： 取适量CMC-Na + 蒸馏水加热煮沸，完全融解，
放冷静置。铺板时取其上清液使用。
铺板时为了防止由于搅拌而带入气泡，常常加 入少量乙醇或丙酮或将吸附剂糊首先置于真空干 燥器中减压脱气，以免薄层表面出现气泡，影响 分离效果。
度，与传递阻滞有关；
表面积越大，表明其吸附力越大，有较强的保留。
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4）硅胶薄层板的厚度 普通薄层厚度为250μm, 高效薄层板为200μm， 制备薄层板厚度 0.5-2 mm

双水相萃取(aqueous two-phase partitioning) 是1896 年Beijerinck 把琼脂和 可溶性淀粉或明胶相混合时最早发现的。1956年，瑞典伦德大学的Albertsson重新 发现此体系并第一次用来提取生物物质。1979年，Kula和Kroner等人将双水相体系 用于从细胞匀浆液中提取酶和蛋白质，使胞内酶的提取过程大为改善。此后，对于 双水相体系的研究和应用逐步展开并取得很大进展。在提纯有生理活性的生物物质 方面，与其他提取方法相比，它具有许多优势。现在双水相萃取已被广泛用于蛋白 质、酶、核酸、病毒、细胞、细胞器等生物产品的分离和纯化，并逐步向工业化生 产迈进，展现了在食品工业、生物学研究和生物工程方面的巨大应用前景。 双水相现象是当两种聚合物或一种聚合物与一种盐溶于同一溶剂时，由于聚合物之 间或聚合物与盐之间的不相容性，当聚合物或无机盐浓度达到一定值时，就会分成 不互溶的两相。因使用的溶剂是水，因此称为双水相，在这两相中水分都占很大比 例(85％~95％)，活性蛋白或细胞在这种环境中不会失活，但可以不同比例分配于 两相，这就克服了有机溶剂萃取中蛋白容易失活和强亲水性蛋白难溶于有机溶剂的 缺点。
强碱性阴离子交换 这类树脂有两种，一种含三甲胺基称为强碱I型，另一种含二甲基-b羟基-乙基胺 基团，为强碱型。和强酸离子交换相似，活性基团电离程度较强且不受pH变化的 影响，在pH1—14范围内均可使用。 RN(CH3)3CI+NaOH→RN(CH3)3OH+NaCl
双水相萃取(Aqueous Two Phase Extraction)
相对液液萃取的优点：
回收率和富集倍数高
有机溶剂消耗量低，可减少对环境的污染
采用高效、高选择性的吸附剂，能更有效的将分析物与干扰组分分离

（2）有机溶剂法
有机溶剂能溶解细胞壁的脂类，从而改变细 胞通透性。
（3）表面活性物质
能溶解膜结构中的脂蛋白，使细胞通透性增加。
化学法的优缺点 优点 细胞外形保持完整，碎片少，浆液粘度低，
易于固液分离和进一步提取。
①通用性差； 缺点 ②时间长，效率低，一般胞内物质释放率 不超过 80％。 ③有些化学试剂有毒，后续工作需设法分 离除去。
纳豆激酶
1980年，日本心脑血管专家须见洋行博士， 从事溶解血栓药物研究工作
“下午两点半”实验 下午两点半：纳豆提取物加入到人工 血栓中；
下午五点半：血栓溶解2厘米
纳豆的制作
1、泡豆蒸豆
大豆，加水浸泡一夜后，蒸烂。
2、接种纳豆菌
纳豆菌用热水溶解后，加入到大豆中，搅拌均匀，分装。
3、在恒温下发酵14-36小时 4、后熟（活菌低温休眠）
洋葱质壁分离
2、冷冻-融化法
（1）方法：将细胞放在低温下冷冻，然后在 室温中融化，反复多次而达到破壁作用。 （2）原理：一方面破坏细胞膜的通透性，另 一方面胞内水结晶，形成冰晶粒，细胞液浓度 增高引起细胞溶胀而破裂。
大肠杆菌：可用液氮/37℃反复冻融法破壁
适用于细胞壁较脆弱的菌体，需反复 多次，速率慢，产量低，在冻融过程 中可能引起某些蛋白质变性。
（二）膨胀床分离技术
1、膨胀床的定义
（1）固定床：又称填充床，填充的固体物通常呈 颗粒状，堆积成一定高度的床层。床层静止不动， 流体通过床层进行分离纯化。 （2）流化床：当流体通过床层的速度逐渐提高到 某值时，填料颗粒出现松动，颗粒间空隙增大，床 层体积出现膨胀，但是颗粒仍逗留在床层内而不被 流体带出。床层的这种状态和液体相似称为流化床
（5）柱床的再生和清洗

jm）j）在之ij两比相mi：/（mj y，yxiix/）yxjj 中 的yyji /浓xxji度 之1 y比iyi ， 1 或xixi两，x个i 组xj 分 1的,yi相 y平j 衡1 常（数1（-1）mi， x和y分别为两相的浓度（摩尔分率）。
比如：当离子交换达到平衡时，两种反荷离子（counter ion，与交换 剂表面电荷符号相反的交换性离子） 在离子交换剂中的浓度比与在溶 液中的浓度比的比值称为选择性系数，式中，y，x分别为反荷离子在 离子交换剂和溶液中的平衡浓度分率，下标A，B分别表示反荷离子A和 反荷离子B。选择性系数是离子交换剂的重要特性参数之一，它反映对 一子种B优离先子交亲换和。力的大小，当αBA>1时，离子A优先交换，当αBA<1时，离
D A D
DAB2 A
rA
式中，rA——A组分的生成速率。
若混合物的总密度恒定，用物质的量浓度作单位，在无化学反 应的情况下，得到著名Fick第二定律，它是计算分子扩散的基 本方程：
cA
DAB
2cA x2
2cA y 2
2cA z 2
DAB2cA
27
Fick定律含义
表示扩散方向与浓度梯度方向相反
8
借助于流体在填充柱内的流向同某个明 显影响平衡关系的热力学参数（温度、 压力或酸度等）同步地作周期变化，实 现气体或液体混合物组分间的分离，是 一种属于传质分离过程的新分离技术。 参数泵分离能在小设备内连续操作，使 溶质在填充柱两端的浓度比达到很高的 数值。此分离技术目前尚处于实验室试 验阶段。
J A,
DAB
dC A dz
A 在 B 中的扩散系数 m2/s
扩散通量，kmol/m2s
相界面 气相
液相 传质方向

细菌分离培养及移植在细菌学诊断中，分离培养是不可缺少的一环。

分离培养的目的主要是在含多种细菌的病料或培养物中挑选出某种细菌。

在分离培养时应注意：选择适合于所分离细菌生长的培养基、培养温度、气体条件等。

同时应严格按无菌操作程序进行实验，并做好标记。

[ 目的要求](1) 掌握细菌分离培养的基本要领和方法。

(2) 掌握厌氧菌培养的原理及其方法。

[ 实验材料]菌种：大肠杆菌斜面、大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤等。

器械：剪刀、记号笔( 以上小组共用)。

培养基：普通肉汤和普通琼脂斜面、普通琼脂和鲜血琼脂平板、酒精灯、接种环( 以上每人一套) 。

[ 需氧性细菌分离培养法]1．划线分离培养法此法为常用的细菌分离培养法。

平板划线培养的方法甚多，可按各人的习惯选择应用，其目的都是达到使被检材料适当的稀释，以求获得独立单在的菌落，防止发育成菌苔，以致不易鉴别其菌落性状。

划线培养时须注意以下几点：二I u l:-._ L ; I . ' L i ：^1.\ (1)左手持皿，用左手的拇指、食指及中指将皿盖揭开呈20。

左右的角度(角度愈小愈好，以免空气中的细菌进入皿中将培养基污染)。

(2) 右手持接种环，从大肠杆菌与金黄色葡萄球菌混合培养肉汤中取少许材料涂布于培养基边缘，然后将接种环上多余的材料在火焰中烧毁，待接种环冷却后，再与所涂材料的地方轻轻接触，开始划线，方法如图(5-1)。

(3) 划线前先将接种环稍稍弯曲，这样易和平皿内琼脂面平行，不致划破培养基-：=日|•.二1 ⑷划线中不宜过多地重复旧线，以免形成菌苔。

(5)接种完毕，在皿底上作好菌名、日期和接种者等标记，平皿倒扣，置37C培养。

2•纯培养的获得与移植法将划线分离培养37C24h的平板从温箱取出，挑取单个菌落，经染色镜检，证明不含杂菌，此时用接种环挑取单个菌落，移植于琼脂斜面培养，得到的培养物，即为纯培养物，再作其他各项试验检查和致病性试验等。

具体操作方法如下：图5—3拔试管棉寒示意图图5—4斜面接种方法示意图（1）两试管斜面移植时，左手斜持菌种管和被接种琼脂斜面管，使管口互相并齐，管底部放在拇指和食指之间，松动两管棉塞，以便接种时容易拔出（图5—2）。

总论21世纪是生命科学的世纪,生物化学与分子生物学是当代生命科学领域中一门重要的基础学科,它涵盖的基础理论,基本知识,基本技术与医学研究各学科领域密切相关,其理论与技术的发展,推动了生命科学的发展,对人类的科技进步与文明产生巨大影响。

生物化学实验是医学院校学生必修的一门独立的基础实验技术课程，其研究技术的发展与应用是依据物理学、化学及生物学的基本理论和实验方法而建立起来的。

20世纪20年代微量分析的发展，30年代电子显微镜的出现，40年代层析技术和电泳技术的兴起，以及同位素示踪技术、各种光谱技术、核磁共振技术的应用，激光、超导等新技术的出现，电子计算机技术的突飞猛进，使生物化学实验手段提高到一个崭新的水平，掌握生物化学实验方法和研究技术，对医学院校学生来说是十分重要的。

本门课程主要侧重于给学生以基本的实验方法和技能的训练，让学生了解并掌握生物化学的四大基本实验方法，即：分光光度法、离心法、层析法和电泳法。

同时也注意引进一些新近发展起来的、重要的生物化学及分子生物学研究技术，作为学生学习其他专业课程和进入科学研究领域的准备。

一、实验要求1．实验前必须预习实验指导和有关理论，明确实验目的、原理、预期的结果，操作关键步骤及注意事项。

2．实验时要严肃认真专心进行操作，注意观察实验过程中出现的现象和结果，结果不良时，必须重做。

3．实验中，应及时将实验结果如实记录下来，并请老师当场审核。

根据实验结果进行科学分析，按时将实验报告交教师评阅。

二、实验时注意事项1．进实验室要穿好实验服，以免酸碱腐蚀衣服。

2．进实验室前准备好实验指导、课本、笔记、实验记录本、报告本、文具等。

3．要保持实验台整洁，试剂、仪器应整齐,按次序放置。

实验完毕要按各类仪器的清洗方法和要求将仪器清洗干净。

4．实验室是培养学生独立思考、独立工作能力及良好科学作风的重要场所，操作务必认真不得敷衍，室内应保持肃静，不得吸烟、玩闹，不得随地吐痰，乱丢纸屑。