抑菌研究

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试验菌种
黑曲霉金黄色葡萄球菌大肠杆菌
1、黑曲霉(Aspergillus niger,A. niger)
黑曲霉为一类有害、致病性丝状真菌[1],广泛存在于自然界。

黑曲霉菌丝体发达,具隔膜,多分枝,多核,有明亮的褐黑色。

富含丰富营养的食品、粮油等在温暖、潮湿的环境中极易由黑曲霉引起霉变,通过次生代谢途径合成黄曲霉毒素、单端孢菌毒素等,危及人、畜的安全和健康。

马铃薯培养基(PDA)
称取100 g洗净去皮后的新鲜马铃薯,用刀切碎放入大烧杯中,另加约500 mL蒸馏水,加热煮沸30 min,用纱布过滤,得滤液备用。

称取10 g 琼脂粉、10 g葡萄糖放入滤液中,加蒸馏水调至500 mL左右。

电热炉加热(在加热过程中注意用玻璃棒不断地搅拌以防止结底),待全部溶解后分装入锥形瓶中,并用封口膜封口,即为PDA培养基。

黑曲霉的培养:
1.黑曲霉菌种活化
斜面培养基PDA:将配好的PDA分装在三支试管中,每管约占1/3。

灭菌。

取约0.2ml菌体悬浮液接种在试管斜面培养基上,活化三天。

接在三个管子中。

2. 3d后,在超净工作台上将活化的菌种取分生孢子用无菌水制成菌
悬液,吸取一定量悬液用血球计数板在显微镜下计算出孢子浓度。

3.根据浓度取一定量的菌悬液注入冷却至50℃的已灭菌的PDA培养
基中,倒三个大平板。

4.抑菌试验:待平板凝固,将每个平板均分成六个部分,记号笔标注。

取六只已灭菌的牛津杯置于各部分中央,一次向杯中加入200μL灭菌过的丙酮溶液和不同浓度梯度的柠檬苦素-丙酮溶液,恒温培养箱(23-28℃)中培养6-7d。

通过比较抑菌圈大小、孢子形态、菌丝体形态的差异来评价抑菌效果。

抑菌圈直径比较:
利用直尺运用十字交叉法测量出各平板抑菌圈直径。

菌丝体和孢子囊形态显微观察:
分别取受最高浓度肉桂醛和柠檬醛作用的黑曲霉菌丝体和孢子囊,与对照组比较并拍照。

金黄色葡萄球菌
1. 菌种:金黄色葡萄球菌。

金黄色葡萄球菌 (Staphylococcus aureus ) 是人类的一种重要病原菌,隶属于葡萄球菌属(Staphylococcus),有“嗜肉菌"的别称,是革兰氏阳性菌的代表,可引起许多严重感染
2. 培养基:肉膏蛋白胨培养基。

肉膏蛋白胨培养基的配制
1)培养基成分:牛肉膏0.5g,蛋白胨1g,NaCl 0.5g,琼脂1.5~2g,水100 ml,pH 7.2。

2)配制方法
称量及溶化:取一干净小烧杯置于电子称上,去皮,分别称取蛋白胨和NaCl的所需量,用玻棒挑取牛肉膏刮于一小烧杯壁上,进行称量,然后加入少量蒸馏水,加热溶化后倒入搪瓷杯中。

将搪瓷杯置
于电炉上加热,用玻棒搅拌,使药品全部溶化。

定容:补充水量至所需体积。

调pH:待溶液冷至室温时,用1mol/L NaOH溶液调pH至7.0~7.2。

加琼脂:加入所需量的琼脂,加热溶化,补充失水(亦可不用溶化琼脂,pH调好后直接分装后,将所需琼脂装入三角瓶或试管中,注意琼脂要没入液体中,然后包扎灭菌)。

分装、加塞、包扎。

高压蒸汽灭菌:121℃灭菌15 min。

3. 其它物品:培养皿、无菌圆滤纸片、镊子、无菌水、无菌滴管、水浴锅。

4. 药品无菌水
(四)实验步骤
理化因素对微生物的影响:
(1) 将300 ml肉膏蛋白胨培养基溶化,并冷却至50℃左右后加入6 ml金黄色葡萄球菌菌悬液,迅速混匀,倾入无菌培养皿中,每皿约20 ml,倒 15 皿,冷凝,即制成含菌平板。

(2) 操作基本同上
(3) 将平板倒置于37℃温箱中,培养24h后观察结果,测量并记录抑菌圈的直径。

根据其直径的大小,可初步确定测试药品的抑菌效能。

大肠杆菌
1、LB液体培养基
每100mlNacl 1.0g
胰蛋白胨1.0g 酵母提取物0.5g。