高效液相色谱分析法概述

高效液相色谱分析技术及其新的发展与应用余建军(陕西科技大学生命科学与工程学院，西安710021)1 高效液相色谱法概述高效液相色谱法（high performanc，liquid chromatography，HPLC）是在经典液相色谱法基础上发展起来的一种新型分离、分析技术。

经典液相色谱法由于使用粗颗粒的固定相，填充不均匀，依靠重力使流动相流动，因此分析速度慢，分离效率低。

新型高效的固定相、高压输液泵、梯度洗脱技术以及各种高灵敏度的检测器相继发明，高效液相色谱法迅速发展起来[1]。

高效液相色谱法与经典液相色谱法比较，具有下列主要特点：（1）高效由于使用了细颗粒、高效率的固定相和均匀填充技术，高效液相色谱法分离效率极高，柱效一般可达每米104理论塔板。

近几年来出现的微型填充柱（内径lmm）和毛细管液相色谱柱（内径0.05umm），理论塔板数超过每米105，能实现高效的分离。

（2）高速由于使用高压泵输送流动相，采用梯度洗脱装置，用检测器在柱后直接检测洗脱组分等，HPLC完成一次分离分析一般只需几分钟到几十分钟，比经典液相色谱快得多。

（3）高灵敏度紫外、荧光、电化学、质谱等高灵敏度检测器的使用，使HPLC 的最小检测量可达10-9～10-11g（4）高度自动化计算机的应用，使HPLC 不仅能自动处理数据、绘图和打印分析结果，而且还可以自动控制色谱条件，使色谱系统自始至终都在最佳状态下工作，成为全自动化的仪器。

（5）应用范围广（与气相色谱法相比）HPLC 可用于高沸点、相对分子质量大、热稳定性差的有机化合物及各种离子的分离分析。

如氨基酸、蛋白质、生物碱、核酸、甾体、维生素、抗生素等。

（6）流动相可选择范围广它可用多种溶剂作流动相，通过改变流动相组成来改善分离效果，因此对于性质和结构类似的物质分离的可能性比气相色谱法更大。

（7）馏分容易收集更有利于制备2 色谱法分类高效液相色谱法按固定相不同可分为液-液色谱法和液-固色谱法；按色谱原理不同可分为分配色谱法（液-液色谱）和吸附色谱法（液-固色谱）等[2]。

根据固定相与流动相极性的不同，液-液色谱法又可分为正相色谱法和反相色谱法，当流动相的极性小于固定相的极性时称正相色谱法，主要用于极性物质的分离分析；当流动相的极性大于固定相的极性时称反相色谱法，主要用于非极性物质或中等极性物质的分离分析。

2.1 液-固色谱法（液-固吸附色谱法）固定相是固体吸附剂，它是根据物质在固定相上的吸附作用不同来进行分配的。

（1）液-固色谱法的作用机制吸附剂：一些多孔的固体颗粒物质，其表面常存在分散的吸附中心点。

流动相中的溶质分子X(液相)被流动相S带入色谱柱后，在随载液流动的过程中，发生如下交换反应：X(液相)+nS(吸附)<==>X(吸附)+nS(液相)其作用机制是溶质分子X(液相)和溶剂分子S(液相)对吸附剂活性表面的竞争吸附。

吸附反应的平衡常数K为：K值较小：溶剂分子吸附力很强，被吸附的溶质分子很少，先流出色谱柱。

K值较大：表示该组分分子的吸附能力较强，后流出色谱柱。

发生在吸附剂表面上的吸附-解吸平衡，就是液-固色谱分离的基础。

（2）液-固色谱法的吸附剂和流动相常用的液-固色谱吸附剂：薄膜型硅胶、全多孔型硅胶、薄膜型氧化铝、全多孔型氧化铝、分子筛、聚酰胺等。

一般规律：对于固定相而言，非极性分子与极性吸附剂(如硅胶、氧化铜)之间的作用力很弱，分配比k较小，保留时间较短；但极性分子与极性吸附剂之间的作用力很强，分配比k大，保留时间长。

对流动相的基本要求：①试样要能够溶于流动相中②流动相粘度较小③流动相不能影响试样的检测常用的流动相：甲醇、乙醚、苯、乙腈、乙酸乙酯、吡啶等。

2.2 液-液色谱法（1）液-液色谱法的作用机制溶质在两相间进行分配时，在固定液中溶解度较小的组分较难进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较快；在固定液中溶解度较大的组分容易进入固定液，在色谱柱中向前迁移速度较慢，从而达到分离的目的。

液-液色谱法与液-液萃取法的基本原理相同，均服从分配定律：K=C固/C液。

K值大的组分，保留时间长，后流出色谱柱。

（2）正相色谱和反相色谱正相分配色谱用极性物质作固定相，非极性溶剂(如苯、正己烷等)作流动相。

反相分配色谱用非极性物质作固定相，极性溶剂(如水、甲醇、己腈等)作流动相。

一般地，正相色谱是固定液的极性大于流动相的极性，而反相色谱是固定相的极性小于流动相的极性。

正相色谱适宜于分离极性化合物，反相色谱则适宜于分离非极性或弱极性化合物。

（3）液-液色谱法的固定相常用的固定液为有机液体，如极性的β，β′氧二丙腈(ODPN)，非极性的十八烷(ODS)和异二十烷(SQ)等。

缺点：涂渍固定液容易被流动相冲掉采用化学键合固定相则可以避免上述缺点使固定浓与担体之间形成化学键，例如在硅胶表面利用硅烷化反应：形成Si—O—Si—C型键，把固定液的分子结合到担体表面上，如下图：优点：①化学键合固定相无液坑，液层薄，传质速度快，无固定液的流失②固定液上可以结合不同的官能团，改善分离效能③固定液不会溶于流动相，有利于进行梯度洗提2.3 离子交换色谱法[3]（1）离子交换色谱法的作用机制聚合物的分子骨架上连接着活性基团，如—SO3－，—N(CH3)3+等。

为了保持离子交换树脂的电中性，活性基团上带有电荷数相同但正、负号相反的离子X，称为反离子。

活性基团上的反离子可以与流动相中具有相同电荷的被测离子发生交换：离子交换色谱的分配过程是交换与洗脱过程。

交换达到平衡时：K值越大，保留时间越长（2）溶剂和固定相两种类型：多孔性树脂与薄壳型树脂。

多孔性树脂：极小的球型离子交换树脂，能分离复杂样品，进样量较大；缺点是机械强度不高，不能耐受压力。

薄壳型离子交换树脂：在玻璃微球上涂以薄层的离子交换树脂，这种树脂柱效高，当流动相成分发生变化时，不会膨4.凝肤色谱法（空间排阻色谱法）凝胶是一种多孔性的高分子聚合体，表面布满孔隙，能被流动相浸润，吸附性很小。

凝胶色谱法的分离机制是根据分子的体积大小和形状不同而达到分离目的。

2.4 凝胶色谱法（1）凝胶色谱法的作用机制凝胶色谱法是一种按分子尺寸大小的顺序进行分离的一种色谱分析方法[4]。

体积大于凝胶孔隙的分子，由于不能进入孔隙而被排阻，直接从表面流过，先流出色谱柱；小分子可以渗入大大小小的凝胶孔隙中而完全不受排阻，然后又从孔隙中出来随载液流动，后流出色谱柱；中等体积的分子可以渗入较大的孔隙中，但受到较小孔隙的排阻，介乎上述两种情况之间。

（2）凝胶色谱法的固定相软质凝胶、半硬质凝胶和硬质凝胶三种。

缺点是但柱子容量小，进样量不宜太多。

3 仪器装置及主要器件高效液相色谱仪种类繁多，但不论何种类型的高效液相色谱仪，基本上都分为四个部分：高压输液系统、进样系统、分离系统和检测系统。

此外，还可以根据一些特殊的要求，配备一些附属装置，如梯度洗脱、自动进样、自动收集及数据处理装等。

如下图是高效液相色谱仪的结构示意图，其工作过程如下：高压泵将贮液罐的溶剂经进样器送入色谱柱中，然后从检测器的出口流出。

当待分离样品从进样器进入时，流经进样器的流动相将其带入色谱柱中进行分离，然后已先后顺序进入检测器，记录仪将进入检测器的信号记录下来，得到液相色谱图。

高效液相色谱仪的结构示意图3.1 高压输液系统由贮液罐、脱气装置、高压输液泵、过滤器、梯度洗脱装置等组成。

（1）贮液罐由玻璃、不锈钢或氟塑料等耐腐蚀材料制成。

贮液罐的放置位置要高于泵体，以保持输液静压差，使用过程应密闭，以防止因蒸发引起流动相组成改变，还可防止气体进入。

（2）流动相流动相常用甲醇-水或乙腈－水为底剂的溶剂系统。

流动相在使用前必须脱气，否则很易在系统的低压部分逸出气泡，气泡的出现不仅影响柱分离效率，还会影响检测器的灵敏度甚至不能正常工作。

脱气的方法有加热回流法、抽真空脱气法、超声脱气法和在线真空脱气法等。

（3）高压输液泵是高效液相色谱仪的关键部件之一，用以完成流动相的输送任务。

对泵的要求是：耐腐蚀、耐高压、无脉冲、输出流量范围宽、流速恒定，且泵体易于清洗和维修。

高压输液泵可分为恒压泵和恒流泵两类，常使用恒流泵（其压力随系统阻力改变而流量不变）。

3.2 进样系统常用六通阀进样器进样，进样量由定量环确定。

操作时先将进样器手柄置于采样位置（LOAD），此时进样口只与定量环接通，处于常压状态，用微量注射器（体积应大于定量环体积）注入样品溶液，样品停留在定量环中。

然后转动手柄至进样位置（INJECT），使定量环接入输液管路，样品由高压流动相带入色谱柱中。

3.3 色谱柱由柱管和填充剂组成。

柱管多用不锈钢制成。

柱内填充剂有硅胶和化学键合固定相。

在化学键合固定相中有十八烷基硅烷键合硅胶（又称ODS柱或C18柱）、辛烷基硅烷键合硅胶（C8柱）、氨基或氰基键合硅胶等，在中药制剂的定量分析中，主要使用ODS柱。

由于ODS属于非极性固定相，在分离分析时一般使用极性流动相，所以属反相色谱法。

常用流动相有甲醇－水或乙腈－水等，洗脱时极性大的组分先出柱，极性小的组分后出柱。

3.4 检测器在高效液相色谱法中主要使用紫外检测器（UVD），可分为固定波长、可变波长和二极管阵列检测器三种类型，以可变波长紫外检测器应用最广泛。

检测器由光源、流通池和记录器组成，其工作原理是进入检测器的组分对特定波长的紫外光能产生选择性吸收，其吸收度与浓度的关系符合光吸收定律。

4 高效液相分析技术的新发展在20世纪90年代以来HPLC已发展到可与GC相近的程度，在分析仪器的销售中已提高到首位。

其突出成果有几以下几个方面。

4.1 新型固定相的研制（1）耐高压、高交联度的球形微粒聚合物固定相，如单分散、全多孔的苯乙烯基苯共聚微球（粒径10μm、孔径10～100nm）（2）为完全消除硅醇基的吸附效应，研制了具有立体阻碍或静电屏蔽效应的新型单齿和双齿硅胶键合固定相。

③制备了具有大的流通孔尺寸/骨架尺寸比值的整体色谱柱，实现了快速分析。

4.2 新型流动相的使用20世纪90年代末期出现了用120～220℃超热水作为流动相的HPLC，它利用超热水具有较低的介电常数来增强其洗脱强度，又称绿色流动相。

4.3 新型检测器的扩展应用和HPLC仪器自动化程度的迅速提高20世纪90年代蒸发光散射检测器，由于具有以质量检测的通用性质，迅速扩展了的多肽、蛋白质、核酸等生物大分子分析中的应用。

于单板机的广泛应用和个人用计算机功能的扩展，使HPLC仪器配备了自动进样器，色谱操作参数的自动控制，智能化的数据和谱图处理功能大大提高了HPLC仪器的自动化水平。

4.4 全新分析方法的涌现（1）使用“并列整体载体结构”的微芯片制作技术，并采用电渗泵，扩展了纳米液相色谱技术的使用。