基因工程制胰岛素(生工版)资料

基因工程获取胰岛素的主要步骤胰岛素是一种由胰岛β细胞分泌的蛋白质激素，对调节血糖水平起着重要作用。

胰岛素的分子结构由两个多肽链组成，分别为A链和B链，通过二硫键连接在一起。

A链含有21个氨基酸残基，B链含有30个氨基酸残基。

胰岛素的结构决定了它的生物活性和稳定性。

基因工程是一种利用DNA技术对目标基因进行修饰和重组的方法，可以大规模生产胰岛素。

以下是基因工程获取胰岛素的主要步骤：1. 基因克隆：首先需要从人体或其他来源中获得胰岛素基因的DNA 序列，然后使用PCR技术扩增所需基因片段。

扩增后的基因片段将被插入到一个载体中，如质粒或病毒。

质粒是一种环状DNA分子，可以在细菌中进行复制和表达。

2. 转化宿主细胞：将质粒或病毒载体导入宿主细胞中，使其拥有胰岛素基因。

最常用的宿主细胞是大肠杆菌，因为大肠杆菌具有较高的转化效率和易于培养的特点。

3. 表达胰岛素基因：在宿主细胞中，胰岛素基因将被转录成mRNA，随后翻译成胰岛素蛋白。

为了提高胰岛素的表达水平，可以使用启动子和增强子等调控元件来增强基因的表达。

4. 纯化与结构修饰：经过表达后，胰岛素蛋白可以通过离心、层析和过滤等手段进行纯化。

纯化后的胰岛素蛋白需要进行结构修饰，如对A链和B链进行二硫键的形成，以及其他可能的糖基化修饰。

5. 活性检测与质量控制：获取的胰岛素蛋白需要进行活性检测，以确保其具有正常的生物活性。

同时，还需要进行质量控制，如测定蛋白的纯度、含量和杂质的检测。

6. 大规模生产与制剂开发：经过活性检测和质量控制后，胰岛素蛋白可以进行大规模生产。

生产过程中需要考虑生产工艺、设备的选择和合理的工艺优化。

同时，还需要开发适合临床使用的胰岛素制剂，如注射剂、胰岛素泵等。

通过基因工程获取胰岛素的方法使得胰岛素的大规模生产成为可能，不仅能够满足临床需求，还能够提高胰岛素的纯度和质量稳定性。

基因工程技术的不断发展也使得胰岛素的生产成本逐渐降低，更加便于患者的使用。

胰岛素制备原理
胰岛素的制备原理主要基于生物合成技术和基因工程技术。

传统的胰岛素制备方法是从动物（如猪或牛）的胰腺中提取胰岛素，但这种方法存在纯度较低、含有杂质等问题。

随着生物技术的发展，人们开始使用基因工程技术来生产胰岛素。

具体来说，将人胰岛素基因转移到细菌或酵母菌中，利用发酵工艺大规模生产胰岛素。

这种方法的优点是能够大规模生产高纯度的胰岛素，是目前最主要的胰岛素制备方法。

此外，第三代胰岛素类似物的制备原理是在第二代人胰岛素的基础上，通过改造氨基酸顺序来生产。

这些类似物在结构和功能上与天然胰岛素相似，具有更好的药代动力学特性和治疗效果。

总的来说，胰岛素的制备原理主要包括提取、基因工程和发酵工艺等技术手段，通过这些方法可以生产出高纯度、高效的人胰岛素及其类似物。

基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典] 基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的工艺一，背景知识1，基因工程科技名词定义中文名称:基因工程英文名称:genetic engineering;gene engineering其他名称:重组脱氧核糖核酸技术(recombinant DNA technique) 定义1:狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因;广义的基因工程则指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。

如用重组DNA技术，将外源基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的产品;将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因动物;用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。

定义2:将在体外进行修饰、改造的脱氧核糖核酸分子导入受体细胞中进行复制和表达的技术。

扩充:基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。

上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技术);而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。

一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有:(1)外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。

这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分;(2)适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组;(3)外源基因的导入;(4)外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选;(5)外源基因表达产物的生理功能的核实;(6)转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析;(7)生态与进化安全保障机制的建立;(8)消费安全评价。

基本操作步骤(上游技术)提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。

如植物的抗病(抗病毒抗细菌)基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。

要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。

生物技术制药参考资料基因工程制备胰岛素一、胰岛素的定义胰岛素是由胰岛β细胞受内源性或外源性物质如葡萄糖、乳糖、核糖、精氨酸等的刺激而分泌的一种蛋白质激素。

二、目前临床使用的胰岛素来源1、动物胰岛素：从猪和牛的胰腺中提取，两者药效相同，但与人胰岛素相比，猪胰岛素中有1个氨基酸不同，牛胰岛素中有3个氨基酸不同，因而易产生抗体。

2、半合成人胰岛素：将猪胰岛素第30位丙氨酸，置换成与人胰岛素相同的苏氨酸，即为半合成人胰岛素。

3、重组人胰岛素（现阶段临床最常使用的胰岛素）：利用生物工程技术，获得的高纯度的生物合成人胰岛素，其氨基酸排列顺序及生物活性与人体本身的胰岛素完全相同。

三、目前，国际上生产医用重组人胰岛素(recombi—nant human insulin，rhI)的方法1、用基因工程大肠杆菌escherichia coli，E．CO一)分别发酵生产人胰岛素(human insulin，hi)的A、B链，然后经化学再氧化法，使两条链在一定条件下重新形成二硫键，得到hI。

这一方法缺点较多，目前已较少使用；2、用基因工程E．coli发酵生产人胰岛素原(hu—man peoinsulin，hPI)，后经加工形成hI。

E．coli系统表达量高，但缺点是不利于表达hI这样的小蛋白，产物易降解，故常采用融和蛋白形式将hPI连接在一个较大的蛋白质后，表达产物需经过一系列复杂的后加工才能形成有活性的hi；3、通过基因工程酵母菌发酵生产hPI，经后加工形成hI。

酵母系统下游后加工比细菌表达系统简单，但缺点是生产慢，生产周期长，且重组蛋白分泌量少(1～50 mg／L)，产量低。

因此，虽然rhI投放市场已久，但人们一直在努力寻求和探索更加有效的表达系统和高效的表达策略I2 J，尤其是对E．CO一尻表达系统的研究更是越来越深入，用E．coli系统表达hPI的策略也越来越多。

另一方面，在胰岛素的基因工程生产中，下游处理非常复杂，复杂的下游处理极大地降低了胰岛素的最终收率。

胰岛素能降低人体血糖的含量。

糖尿病患者是由于胰腺的β细胞不能分泌胰岛素，使患者血糖过高，继而带来吃得多、喝得多、尿得多、体重减少(即三多一少)的一系列临床症状。

糖尿病的死亡率仅次于心脏病和癌症。

19世纪以前，糖尿病像妖魔一样肆意夺走人们的生命，那时糖尿病患者的平均生存时间仅4．9年，面对这旷日持久的大浩劫，人类一筹莫展。

1921年，加拿大医生班廷(Banding)取两条狗的胰脏，将之搅碎过滤，并收集少量液体注射到一只已经出现糖尿病昏迷的小狗身上，奇迹发生了，昏迷的小狗血糖开始下降，当液体注射完毕，世界上第一只从糖尿病昏迷状态下苏醒过来的小狗就站起来跑开了。

从狗胰脏收集的“神奇”液体，就是我们现在使用的胰岛素。

1922年1月班廷第一次使用从牛胰脏中提取的胰岛素，对一个患糖尿病2年，已被医生放弃的男孩进行治疗，结果“药到病除”。

全世界为这个划时代的医学成果而欢呼!班廷也由此荣获1923年诺贝尔生理学和医学奖。

胰岛素治疗糖尿病至今仍然是临床上最有效的方法。

过去，胰岛素主要靠从猪等大家畜胰腺中提取。

从一头猪的胰腺中只能提取出300单位胰岛素，而一个病人每天就需要40单位胰岛素，因此远远不能满足需要。

图7-1 胰岛素生成图大肠杆菌说：给我一个基因，我将源源不断给你药物”基因工程技术一问世，科学家就想到利用该技术来解决胰岛素药源不足的问题。

他们首先要找到胰岛素基因，在人的胰岛细胞里有一段特定结构的DNA分子指挥着胰岛素的合成，然后又找到在人的大肠里存在对人体无害的大肠杆菌。

把人的胰岛素基因转入到大肠杆菌的细胞中，随着大肠杆菌的繁殖，胰岛素基因也一代代的遗传下去。

大肠杆菌繁殖速度相当快，大约20分钟就能繁殖一代，把它放到大型的发酵罐里进行人工培养，就可以大量繁殖，并且生产出大量人的胰岛素(图7．1)。

实际上这种大肠杆菌是经过改造已经带上新的遗传性状的细菌，称为基因工程菌。

1978年美国的吉尔伯特研究组用此方法成功地生产了鼠胰岛素，随后依塔库拉研究组用相同方法生产出了人的胰岛素。

基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的
研究
基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的研究是利用基因工程
技术将人类胰岛素基因导入大肠杆菌细胞中，并使其表达和分泌人类
胰岛素。

研究的具体步骤如下：
1. 克隆：将人类胰岛素基因插入到大肠杆菌中的表达载体上，构建重
组胰岛素的基因工程菌株。

2. 表达：将重组胰岛素基因工程菌株进行培养和诱导表达，启动胰岛
素基因的转录和翻译，使其合成胰岛素多肽链。

3. 折叠：由于胰岛素中存在多肽链的结构，其需要正确折叠形成活性
结构。

通过培养条件的调控和辅助分泌蛋白的表达帮助胰岛素多肽链
正确折叠。

4. 分泌：经过折叠的胰岛素多肽链进入细胞分泌途径，通过胞外酶切，胰岛素分泌至外部培养液中。

5. 纯化：将培养液中的胰岛素进行纯化，去除其他杂质，得到纯度较
高的重组人胰岛素。

这种方法相比其他表达系统有以下优势：
1. 大肠杆菌生长快速且易于培养，并且具有可高效表达外源基因的能力。

2. 人类胰岛素的基因序列已经大量研究，其表达也相对成熟和稳定。

3. 大肠杆菌发酵工艺相对简单，易于工业化生产。

4. 经过纯化的重组胰岛素具有较高的活性和纯度，适用于临床应用。

基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素[宝典] 基因工程大肠杆菌发酵生产重组人胰岛素的工艺一，背景知识1，基因工程科技名词定义中文名称:基因工程英文名称:genetic engineering;gene engineering其他名称:重组脱氧核糖核酸技术(recombinant DNA technique) 定义1:狭义的基因工程仅指用体外重组DNA技术去获得新的重组基因;广义的基因工程则指按人们意愿设计，通过改造基因或基因组而改变生物的遗传特性。

如用重组DNA技术，将外源基因转入大肠杆菌中表达，使大肠杆菌能够生产人所需要的产品;将外源基因转入动物，构建具有新遗传特性的转基因动物;用基因敲除手段，获得有遗传缺陷的动物等。

定义2:将在体外进行修饰、改造的脱氧核糖核酸分子导入受体细胞中进行复制和表达的技术。

扩充:基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。

上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建(即重组DNA技术);而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。

一个完整的、用于生产目的的基因工程技术程序包括的基本内容有:(1)外源目标基因的分离、克隆以及目标基因的结构与功能研究。

这一部分的工作是整个基因工程的基础，因此又称为基因工程的上游部分;(2)适合转移、表达载体的构建或目标基因的表达调控结构重组;(3)外源基因的导入;(4)外源基因在宿主基因组上的整合、表达及检测与转基因生物的筛选;(5)外源基因表达产物的生理功能的核实;(6)转基因新品系的选育和建立，以及转基因新品系的效益分析;(7)生态与进化安全保障机制的建立;(8)消费安全评价。

基本操作步骤(上游技术)提取目的基因获取目的基因是实施基因工程的第一步。

如植物的抗病(抗病毒抗细菌)基因，种子的贮藏蛋白的基因，以及人的胰岛素基因干扰素基因等，都是目的基因。

要从浩瀚的“基因海洋”中获得特定的目的基因，是十分不易的。