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实验十二 反相高效液相色谱法分析尼泊金酯一、目的要求1. 熟悉高效液相色谱仪器操作技术；2. 学习HPLC 保留值定性方法和归一化定量方法。
（了解定制报告编辑方法）。
二、基本原理尼泊金酯（对羟基苯甲酸酯）混合物中含有尼泊金甲、乙、丙、丁酯，均属于强极性化合物，可用反相HPLC 进行分析，选用非极性的C 18烷基键合固定相，甲醇水溶液作流动相。
在一定色谱条件下，酯类各组分t R 保持恒定，相同条件下可用t R 定性。
面积归一化法定量计算公式：%100%1⨯=∑=n i iiiAA p三、仪器、试剂1.恒流泵 Series Ⅲ2. 500型紫外检测器3. 高压六通进样阀（20ul ）4.分析之星色谱数据工作站5.超声波发生器、过滤器6.进样器 1ml7.10ug/ml 对羟基苯甲酸甲、乙、丙、丁酯甲醇溶液；混和试样。
四、实验条件1. 色谱柱：250mm ×4.6mm i.d 固定相：C 18烷基键合相 5um2. 流动相：甲醇：水（85：15） 1ml/min3. 检测器：紫外光度监测器，254nm ，灵敏度 0.024. 进样量 20ul 五、实验步骤1. 将过滤配好的85％甲醇开盖置于超声波发生器脱器15min 。
2. 按仪器操作规程打开数据工作站，据给定仪器条件启动HPLC 至基线平直。
3. 用甲醇清洗进样注射器、进样阀（10ml 容量瓶取甲醇适量，用干净的1ml 注射器操作）。
4. 取干净10ml 容量瓶5只，分别取10ug/ml 的对羟基苯甲酸甲、乙、丙、丁酯甲醇溶液及混合试样适量，贴标签，备用。
5. 用干净的1ml 注射器取样0.4～0.6ml ，排气泡，加过滤头，注入进样阀（LOAD 位），接着按仪器操作规程“10”进样操作。
各样重复进样3次，换样用甲醇清洗进样器、阀。
试样测定结果各Ai,积分后记录。
6. 实验完毕按仪器操作规程停机。
六、数据记录与处理1.标样分析表2.试样分析结果表。
反相色谱法测定尼泊金甲酯（防腐剂）一、实验目的1、了解反相色谱法测定试样中尼泊金甲酯的含量的实验原理和方法；2、掌握外标法进行色谱定性分析的方法和原理。
二、实验原理1、尼泊金甲酯的物理、化学性质又称对羟基苯甲酸甲酯（结构式如右图），又叫尼泊金甲酯，白色结晶粉末或无色结晶，易溶于醇，醚和丙酮，极微溶于水，沸点270-280℃。
主要用作有机合成、食品、化妆品、医药的杀菌防腐剂，也用作于饲料防腐剂。
2、外标法原理先测量一系列尼泊金甲酯标准溶液的色谱峰，得到峰面积。
然后用峰面积对溶度作图，得一标准曲线。
然后在相同实验条件下测定样品中尼泊金甲酯的峰面积，由标准曲线上找出该峰面积下所对应的溶度，从而算出试样中尼泊金甲酯的含量。
三、仪器与试剂：色谱柱：C18（十八烷基硅烷键合硅胶固定相为填充剂），柱长75mm ，柱径4.6mm ；10mg/ml 的尼泊金甲酯标样（储备液）流动相：甲醇：水=70:30 混合溶剂，流动相流速为1mL/min,检测器：紫外检测器，254nm四、 实验步骤：1 、标准溶液的配制：用流动相为溶剂，标样储备液为原液配制浓度为0.02mg/mL 、0.04mg/mL 、0.06mg/mL 、0.08mg/mL 、0.10mg/mL 一系列标准溶液。
2.标准曲线的制作：待仪器稳定后，依次进样20μL 已知浓度的标准溶液，记录色谱图（1-5）及保留时间t R ；3.样品分析：注入20μL 未知溶液，记录色谱图（6）及各组分保留时间t R ；五、数据处理： OHOO根据色谱图1-5中峰面积，绘出峰面积对浓度的标准曲线；根据步骤2中标样的保留时间确定未知样品中尼泊金甲酯的位置；根据色谱图（6）确定尼泊金甲酯的峰面积，然后在标准曲线上查出被测组分的浓度。
表一：一系列尼泊金甲酯标准溶液保留时间及其峰面积：进样量浓度 mg/mlt R /min 峰面积 0.021.223 2838968 0.041.225 4219146 0.061.252 7403238 0.081.247 9370584 0.10 1.251 126680060.020.040.060.080.102000000400000060000008000000100000001200000014000000吸收峰u v /s 进样量浓度 (mg/mL)根据表一中数据制得尼泊金甲酯的标准曲线图由图可求得标准曲线方程式：S(峰面积)= 1.24047E8*C--142845.8将未知液峰面积s=5421742代入上式得：未知液浓度c=0.053mg/ml六、思考题：外标法与内标法比较有什么优点？七、注意事项及实验反思1.仪器若长时间不用，用注射器抽洗阀门（上下两个）中的溶液，以减少泵的磨损；2.在实验操作过程中千万不能关闭系统；实验过程中进样是要快速；溶液的配制要精准；每次要润洗次数要足够多；为得到的数据线性关系更佳，可多测量几次。
食品中对羟基苯甲酸酯类的测定高效液相色谱法1 范围本标准适用于酱油、醋、果酱、糕点、腌制品、果酒及饮料等食品中对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯。
本标准检出限：对羟基苯甲酸甲酯：1.8 mg/kg；对羟基苯甲酸乙酯：1.2 mg/kg；对羟基苯甲酸丙酯：0.9 mg/kg；对羟基苯甲酸丁酯：1.3 mg/kg。
2 规范性引用文件本标准中引用的文件对于本标准的应用是必不可少的。
凡是注日期的引用文件，仅所注日期的版本适用于本标准。
凡是不注日期的引用文件，其最新版本（包括所有的修改单）适用于本标准。
3 原理试样用乙醇超声波提取，取上清液过滤，以高效液相色谱法分离，二极管或紫外检测器检测，外标法定量。
4 试剂和材料除非另有说明，所有试剂均为分析纯，水为GB/T 6682规定的一级水。
4.1 甲醇（色谱纯）。
4.2 乙酸铵（分析纯）。
4.3 20 mmol/L乙酸铵溶液：准确称取1.54 g乙酸铵（4.2）用水定容至1000 ml，过0.45μm 滤膜。
4.4 无水乙醇（分析纯）。
4.5 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯：99 %以上。
4.6 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯的标准储备溶液：准确称取对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯各0.050 g于50 mL容量瓶中，用甲醇（4.1）稀释至刻度，该溶液每毫升相当于1 mg的对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯。
4.7 对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯的标准工作溶液：将混合标准溶液用甲醇（4.1）依次稀释成1.0 μg/ml、10.0 μg/ml、25.0 μg/ml、50.0 μg/ml、100.0 μg/ml的系列标准溶液，使用前配制。
高效液相色谱法分离测定化妆品中凯松和对羟基苯甲酸酯李洁;赵珊;吴大南
【期刊名称】《环境与健康杂志》
【年(卷),期】2000(17)4
【摘要】采用反相高效液相色谱法 ,同时测定化妆品中凯松和对羟基苯甲酸甲酯、乙酯、丙酯、丁酯等 5种防腐剂。
色谱柱:10 μm YWG- C18柱 ;流动相 :甲醇 -四氢呋喃 -水(6 0∶ 5 0∶ 10 0 V/ V) ,紫外检测波长为 2 80 nm,样品用流动相超声提取 ,各组分回收率为 90 .4%～ 10 8.3% ,相对标准偏差为 1.0 %～ 7.5 %。
【总页数】2页(P238-239)
【关键词】高效液相色谱法;凯松;对羟基苯甲酸酯;化妆品
【作者】李洁;赵珊;吴大南
【作者单位】北京市卫生防疫站
【正文语种】中文
【中图分类】TQ658;O652.63
【相关文献】
1.高效液相色谱法定量分析化妆品中对羟基苯甲酸酯 [J], 陈黎明;田玉平;胡国胜;王虎;朱锡菊
2.高效液相色谱法测定化妆品中对羟基苯甲酸酯类防腐剂 [J], 王晓强;胡文炬;张军
3.高效液相色谱法测定化妆品中的保泰松 [J], 穆同娜;王浩;刘艳琴;杨红梅;史海良;郭启雷
4.高效液相色谱法测定化妆品中凯松和布罗波尔 [J], 李洁;赵金辉
5.高效液相色谱法测定化妆品中对羟基苯甲酸酯类、苯甲酸、山梨酸 [J], 刘秋华;王丽焱;吴百禄
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对羟基苯甲酸酯类混合物的反相高效液相色谱测定
一、实验目的
⒈学习高效液相色谱用保留值定性和用归一化法定量的技术。
⒉熟悉高效液相色谱分析操作。
3.掌握用高效液相色谱法测定食品中防腐剂的含量。
二、实验原理
高效液相色谱仪是一种色谱分析仪器，主要用于有机化合物的分析，可以对已知80%左右的有机化合物进行分离和分析。
特别适用于高沸点、大分子、强极性和热稳定性差的化合物以及生物活性物质的分离和分析。
液相色谱仪在医药、食品、农业、生命科学、化工和环保等领域都有广泛的应用。
液相色谱分析方法实质上是一种物理化学分析方法，又称色层法或层析法。
它是利用不同物质在两相（固定相和流动相）中具有不同的分配系数和吸附能力及其他亲和作用性能的差异为分离依据，当混合物中各组分随流动相移动时，在两相中反复进行多次分配，从而使各组分得到分离。
流动相为液体的色谱分析叫做液相色谱分析。
根据分离原理的差异，液相色谱通常分为以下几种类型：液固吸附色谱、液液分配色谱、离子交换色谱和离子对色谱、凝胶色谱。
在对羟基苯甲酸酯类混合物中含有对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯和对羟基苯甲酸丁酯，它们都是强极性化合物，可采用反相液相色谱进行分析，选用非极性的C-18烷基键合相作固定相，甲醇的水溶液作流动相。
在一定的色谱条件下，酯类各组分的保留值是恒定的，因而在同样条件下，记录纯酯类各组分和未知样品的色谱图，将测得的未知样品的各组分保留时间与已知纯酯类各组分保留时间对照，便可确定未知样品中各组分存在与否。
这种利用纯物质对照定性分析的方法适用于来源已知且组分简单的混合物。
本实验采用归一化法定量。
归一化法适用条件及计算公式与气相色谱法相同： Ci（%）=(fiAi)/(ΣfiAi)
在对羟基苯甲酸酯类混合物属同系物，具有相同的生色团和助色团，因此紫外光度检测器测量时，它们的校正因子相同，故上式便可检测为
Ci（%）=Ai/ΣAi×100％
三、仪器和试剂
仪器：高效液相色谱仪LC-20aT
试剂：对羟基苯甲酸甲酯、对羟基苯甲酸乙酯、对羟基苯甲酸丙酯、对羟基苯甲酸丁酯、甲醇、水（GB/T 6682规定的一级水）、乙酸铵（分析纯）
实验条件
1 色谱柱：长15cm、内径3mm，装填C-18烷基键合相、颗粒度为10um的固定相。
2 流动相：甲醇+20mmol/L乙酸铵溶液=60+40（体积比）。
3 检测器：紫外光度检测器，检测波长扫描范围 210nm—400nm，定量波长256nm。
4 进样量：10uL。
四、实验步骤
1、溶液的配制
标准储备液：分别于4个100mL容量瓶中，配制浓度为1000ug/mL的上述4种酯类化合物的甲醇溶液。
分别称取4种酯类0.1000g于50mL烧杯中溶解然后定容到100mL容量瓶中。
标准工作液：分别取上述4种标准储备液于4个10mL比色管中，配制浓度均为10ug/mL的4
种酯类化合物的甲醇溶液，摇匀备用。
取5mL浓度为1000ug/mL的上述4种酯类化合物的甲醇溶液稀释到100mL容量瓶中得浓度为50ug/mL的4种酯类化合物的甲醇溶液；分别取2mL浓度为50ug/mL的上述4种酯类化合物的甲醇溶液于10mL比色管中定容得到10ug/mL的标准工作液。
标准混合工作液：在一个10mL的比色管中，分别取2mL浓度为50ug/mL的4种酯类化合物的甲醇溶液定容得到浓度均为10 ug/mL的酯类混合的甲醇溶液，混匀备用。
2、实验操作
（1）将配制好的流动相甲醇水溶液置于超声波发生器上，脱气5min。
（2）根据实验条件，按照仪器说明书操作步骤将仪器调节至进样状态，待仪器液路和电路系统达到平衡，记录仪基线呈平直时，即可进样。
（3）依次分别吸取10uL四种标准工作液、标准混合工作液和未知试液进样，记录各色谱图，并各重复两次。
五、数据及处理
⒈记录实验条件，保存实验资料。
R
⒊一次测量标准混合物色谱图上各色谱峰的保留时间t R，然后与上表t R中对照。
确
（%），并将数据列于下表中。
⒈对色谱柱来说，在通常的分析条件下，可长时间使用，但如发生杂物吸附或由微粒引起的堵塞时，则其性能大大降低，为延长色谱柱寿命建议使用保护柱。
⒉若直接注入浑浊的试样或含有微粒的试样，则会成为流路或色谱柱堵塞的原因，请用
0.2～0.5um左右的圆盘过滤或离心沉淀来去除杂物。
⒊在流动相水溶液中含有眼睛所看不到的很多离子及微生物，如在此状态下直接使用时，则会造成过滤器及色谱柱的堵塞以至压力上升或色谱柱劣化，无法进行良好的分析，建议将流动相水溶液用0.22um的膜滤器减压过滤后使用。
⒋压力不能太大,最好不要超过30Mpa,防止过高压力冲击色谱柱。
⒌每次使用后要冲洗干净进样阀中残留的样品和缓冲盐,防止无机盐沉积和样品微粒磨损阀转子;使用完毕后须在记录本上记录使用情况。
⒍色谱柱若不用,在卸下前必须洗去缓冲液,并用大于10%的有机溶剂充满整个色谱柱,卸下柱后,用柱堵头将色谱柱首尾密封。
七、思考题
⒈高效液相色谱用于哪些物质的测定？
⒉高效液相色谱的基本检测原理是什么？
⒊在高效液相色谱中，为什么可以利用保留值定性？这种定性方法可靠吗？。
