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题 目 菌种传代操作规程 编码： 页序/
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制 定 审 核 批 准
制订日期 审核日期 批准日期
颁发部门 质量部 生效日期
分发部门 化验室
一、 目的：为使菌种传代操作规范化、制度化，故建立此规程
二、 适用范围：菌种传代须按本规程执行。
三、 责任者：微生物限度检查化验员，质量检测中心主任。
四、 正文：
1、培养基的制备
按微生物限度检查用稀释剂、培养基配制操作规程及斜面配制操作规程配制好相应培养基。大肠埃希菌、金黄色葡萄球菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、沙门菌、用胰酪大豆胨琼脂斜面培养基，白色念珠球菌、黑曲霉用沙氏葡萄糖琼脂斜面培养基，制备好的培养基预培养48小时后，确认无菌落生长方可使用。
2.菌种传代
2.1菌种传代前应准备好适于该菌种生长的培养基和培养设备，所有操作均应在符合生物安全保护的生物安全柜内进行。
2.2点燃酒精灯，在火焰上部操作，将原有的菌种斜面（简称菌种管）与待接种的新鲜斜面培养基（简称接种管）持在左手拇指、食指及中指之间，菌种管在前，接种管在后，使试管内斜面向上，两支试管口平齐，应斜持试管呈45°角，以免管底凝集水浸湿培养基表面。用右手在火焰旁转动两支试管胶塞，以便接种时易于拨取。再用右手持接种环的柄端，垂直或稍斜地把接种环在火焰上灼烧。将接种环烧红约30s，随后将接种棒金属部分在火焰上烧灼，以彻底灭菌。用右手的小指和手掌之间以及无名指与小指之间，在火焰旁分别拔除两支试管的胶塞，持住。在将试管口在火焰上通过以杀灭管口的细菌，但勿烧的过热，将烧灼的接种环插入菌种管内，先接触无菌苔生长的培养
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题
目 菌种传代操作规程 编码： 页序/总页：2/2
基上，如有溶印则表明接种环未冷却，待冷后，再从斜面上挑取少许菌苔。取出时接种环不能通过火焰，应在火焰旁迅速插入接种管，在斜面上由下而上划 “Z”字型曲线，当接种完毕，立即将管口通过火焰灭菌，右手到火焰旁塞上胶塞，不要将管口离开火焰旁去迎接右手的胶塞。最后将接种环烧灼灭菌放置备用。
菌种传代与保藏作业指导书
1.标准菌的来源
标准菌株必须购买具备资质的菌种保藏中心提供的冷冻干燥菌种（0代）（提供菌种证书）。
2.标准菌的验收
从菌种保藏中心购买的原始菌种管是玻璃安瓿装的冻干菌，接收同时应检查是否有随菌种附有的相关资料。接收菌种时应检查安瓿的数量和名称，和每一支安瓿的完整性。在相应的菌种接收记录上记上所有的关于菌种的信息，如名称、数量和接收日期等。在菌种安瓿及菌种管上粘贴标签，内容包括：菌种名称、菌种代号、代次、接收日期、接收人、贮存条件、有效期至。新购入的0代原始菌种储存于－20℃，有效期为三年。购买的已接种好的菌种斜面（3代）应检查菌种管是否完好。储存于2～ 8 ℃，有效期为3个月。
3. 标准菌的复苏、复壮及标准储备菌株的制备
3.1物品及试剂：接种针、酒精灯、移液管、75%酒精及75%酒精棉球
3.2培养基
改良马丁琼脂培养基:用于霉菌复苏、复壮.
营养肉汤培养基:用于金黄色葡萄球菌、枯草芽孢杆菌、大肠埃希菌、乙型副伤寒沙门菌、短小芽孢杆菌、铜绿假单胞菌复苏、复壮。
3.3操作步骤：
a.打开洁净工作台。 b.在安瓿的外表面用75%的酒精擦拭并让其自然风干。
c.用一小砂轮在安瓿的上部划一条线，用手轻轻将安瓿掰开（开启安瓿时必须小心，因为安瓿遇热时可能会破裂）。
d.以无菌方法用一无菌吸管从已准备好的上述液体培养基中移取0.5～0.8 ml到安瓿中。
e.轻轻地旋转安瓿以使冻干菌种和液体培养基充分混合并完全溶解。
f.用无菌吸管将安瓿内菌液全部转接到相应的液体培养基。
g.根据安瓿上所标明的不同菌种类型而将其培养于相应的温度（细菌培养温度30～35℃，培养18～24小时；真菌培养温度23～28℃，培养3～5天。观察是否浑浊，浑浊说明菌种复苏生长；若不浑浊，细菌应延长培养时间至7天，真菌应延长培养时间至14天，若仍未浑浊，灭菌处理。
h.取经复苏后的上述细菌菌液8-10ml至液体培养基中按g项操作对菌种进行复壮。以无菌技术向复壮后的菌种中加入100ml20%的无菌甘油混匀，1-2ml/管分装于冻存管。每个菌种制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。黑曲霉的h项下洗脱液按h项下方法进行复壮，制成复壮后的孢子悬液20ml。以无菌技术向复壮后的菌种中加入20ml 、30%的无菌甘油混匀，1-2ml/管封存于冻存管。制备10支，按顺序进行编号，最后一支做为质控管进行质量控制，即进行相应的确认。其余作为储备管。将上述制备好的冻存管逐支粘贴标签。内容包括：菌种名称、菌种代号、编号、代次、制备日期、制备人、贮存条件、有效期至等。
文件名称
（英文名称） 检测用菌种保藏传代标准操作规程
SOP for testing bacterial strain’s storage and passage method 上海凯茂生物医药有限公司
SHANGHAI CHEMO WANBANG
BIOPHARMA CO. , LTD 文件编号 CWB-SOP-QC-173 版本号 2.0
生效日期 页数/页码 共 2 页 第 1 页
起草人： 审核： QA审核： 批准人：
日期： 日期： 日期： 日期：
1. 目的：
为确保实验用菌种保藏传代操作的正确性，特制定本规程。
2. 适用范围：
实验用菌种。
3. 引用标准：
《中国人民共和国药典》2010年版三部。
4. 职责：
由相关技术人员操作并互检，主管审核。
5. 工作流程：
5.1. 本实验室所使用的菌种均为检验用菌毒种，应从国家药品检定机构或国务院药品监督管理部门认可的单位（如各省市药品检定所）购买。购买的菌毒种应为3代以内（包括3代），从中国药品生物制品检定所购买的冻干菌粉为0代。
5.2. 菌、毒种管上应有牢固的标签，标明菌毒种的编号、代次、传代日期。
5.3. 不同属或同属菌毒种的强毒株及弱毒株不得同时在同一洁净室内操作。
5.4. 使用菌种，实行专人保管，专人使用，负责菌种的验收、保藏、定期传代，销毁、并做好记录。
5.5. 在使用中如发现菌毒种、细胞染杂菌或形态与形状发生改变应马上停止使用。
5.6. 菌种传代：
5.6.1. 用接种环经火焰灭菌后，冷透进入保藏菌种斜面取菌，接种于营养琼脂斜面（或改良马丁琼脂斜面），分别接种保藏菌种斜面（传代用）和工作菌种斜面（日常试验用）；同时接种营养琼脂平板或改良马丁琼脂平板，从平板上部引种，向下波浪型划线，进行分离，经30C～35C或20～25C培养一定时间后，取出2～8C冰箱保存。
5.6.2. 菌种传代要求：保藏菌种每月都要传代，同时进行菌种纯度检查，纯度检查合格后方可使用新代菌种，销毁旧代菌种。
4.1 菌种是从事微生物学及生命科学研究的基本材料，在医学领域中，诊断制品的制备，菌苗的生产、微生物致病性研究，药物的抑菌试验及药品微生物检验等都有一套完整的菌种、微生物具有生命活力，在传代过程中易发生变异甚至死亡，因此菌种传代与保藏是一项重要的基础工作。
4.2 菌种代号
国内药品微生物检验所用的菌种代号是CMCC(F)或CMCC(B)，CMCC--中国医学菌种保藏中心， 、，B——代表细菌，F——代表真菌。
金黄色葡萄球菌CMCC(B)26003大肠杆菌CMCC(B)44102 枯草芽孢杆菌CMCC(B)63501 白色念珠菌CMCC(F)98001 黑曲霉CMCC(F)98003
4.3 传代和接种
4.3.1 菌种冻干粉复苏
4.3.1.1把冻干菌种管、灭菌1ml滴管、双碟、镊子、营养肉汤培养基、营养琼脂斜面数支，移入接种室或净化台。
4.3.1.2 先用砂轮将冻干菌种安瓿瓶颈部挫出挫痕，再将冻干菌种管外壁用75%酒精擦洗消毒，稍干，用75%乙醇棉擦净，放在灭菌双碟内，待干。点燃酒精灯，将菌种管的封口一端在火焰上烧灼红热，用灭菌滴管吸取营养肉汤培养基，滴在灼热的菌种管封口一端，是骤冷而炸裂。
4.3.1.3取灭菌镊子，在火焰旁，将炸裂的管口打开，放入灭菌双碟内，领取一只灭菌滴管，在火焰旁吸取营养肉汤少许，加至菌种管底部，将冻干菌搅动促使溶解，随即吸出管内菌液，分别接种至营养琼脂斜面及普通肉汤内，并将滴管及菌种管投入消毒液内，将已接种的营养肉汤及营养琼脂斜面进行培养。
4.3.2菌种斜面传代操作
4.3.2.1 培养基应新鲜制备，如斜面已无冷凝水者，不宜再使用。标签上注明菌种名及菌种编号。至冰箱取出的菌种斜面，应在室温放置约30分钟，待温度平衡后再移入接种室或超净工作台。
4.3.2.2点燃酒精灯，用左手握住菌种斜面，将管口靠近火焰旁，右手拿接种棒后端，将接种环烧红30秒，随后将全部接种棒金属部分在火焰上烧灼，往返通过3次。左手将管口在火焰上旋转烧灼，右手无名指，小指及掌部夹住棉塞，拨开棉塞，将接种环深入管内先在近壁的琼脂斜面上靠一下，稍冷却再移至菌苔上，刮去少量菌苔，随即取出接种环，并将菌种管口移至火焰旁。
