C0508 磷酸钙法细胞转染试剂盒

上海常用转染试剂配方
1.将磷酸钙和HEPES缓冲液混合，pH值调整至7.05。

2. 加入NaCl和葡萄糖并充分混合。

3. 用无菌纯水将体积加至所需体积。

2. 聚乙烯亚胺（PEI）转染试剂配方
材料：
- 聚乙烯亚胺（PEI）25kDa
- 无菌纯水
步骤：
1. 将PEI加入无菌纯水中，充分混合。

2. 调整pH值至7.4。

3. 用无菌纯水将体积加至所需体积。

3. 脂质体转染试剂配方
材料：
- DOPC 100mg/ml
- DOPE 20mg/ml
- Cholesterol 20mg/ml
- 无菌纯水
步骤：
1. 将DOPC、DOPE和胆固醇混合，充分混合。

2. 用无菌纯水将体积加至所需体积，并充分混合。

4. Lipofectamine 2000转染试剂配方
材料：
- Lipofectamine 2000转染试剂
- 无菌纯水
步骤：
1. 将Lipofectamine 2000转染试剂加入无菌纯水中，充分混合。

2. 用无菌纯水将体积加至所需体积。

注意事项：
以上试剂配方仅供参考，具体使用时应根据实验需要进行调整。

在使用前，应确保试剂完全溶解，并进行无菌处理。

在转染实验中应注意操作规范，避免对人体和环境的伤害。

腺病毒操作资料说明
1、AdEasy™ Adenoviral Vector System.pdf：这是过表达腺病毒（用于基因过表达）的操作说明书，作为操作指南；
2、AD-293 Cells.pdf：腺病毒包装细胞说明书，作为操作指南；
3、病毒滴度测定-针对有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定方法，作为操作指南；
4、病毒滴度测定-针对没有绿色荧光蛋白标记的病毒.doc：病毒滴度测定方法，作为操作指南；
5、Adeno-X Expression System 1 User Manual.pdf：这是过表达腺病毒（用于基因过表达）的操作说明书，作为操作指南；
6、腺病毒扩增和纯化手册.pdf：腺病毒扩增和纯化方法，作为理论学习
7、腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染.doc：腺病毒包装、扩增、纯化、滴度测定及感染操作指南；
8、C0508磷酸钙法细胞转染试剂盒.pdf：磷酸钙转染方法；。

Lipo6000TM转染试剂产品简介：Lipo6000TM转染试剂(Lipo6000TM Transfection Reagent)是一种非常高效的新型转染试剂，达到了国际最主流转染试剂的转染效果。

适用于把质粒、siRNA或其它形式的核酸包括DNA、RNA、寡核苷酸、以及核酸蛋白复合物或带负电荷的蛋白转染到真核细胞中，也可以用于活体动物的核酸转染以用于基因治疗。

Lipo6000TM转染试剂对于常见的哺乳动物细胞具有非常高的转染效率、重复性好、操作简单、无明显的细胞毒性，并且对于贴壁细胞和悬浮细胞都适用。

Lipo6000TM转染试剂的使用方法和常用的Lipofectamine®2000Reagent完全一致。

并且经过对HEK293T、Hela、NIH3T3、HEK293FT、CHO等细胞的测试，转染效率也和Lipofectamine® 2000 Reagent相当甚至略高。

Lipo6000TM转染试剂不仅适用于质粒、siRNA等单一成分的细胞转染，也适合多个质粒或者质粒与siRNA等的组合转染。

Lipo6000TM转染试剂转染过表达质粒后，通常24-48小时后达到较高的蛋白表达水平，并且很多情况下蛋白表达量在转染后48小时显著高于转染后24小时；转染siRNA通常3-5天后对于目的基因的下调水平会比较理想。

Lipo6000TM转染试剂转染细胞时，基本不受细胞培养液中的血清和抗生素的影响，即可以在血清和抗生素存在的情况下进行细胞转染。

但为了取得最佳的转染效果，推荐转染时使用不含抗生素的含血清的细胞培养液。

Lipo6000TM转染试剂的转染效果可以通过转染表达EGFP等荧光蛋白的质粒进行快速鉴定。

Lipo6000TM转染试剂与Lipofectamine® 2000Reagent转染效果比较请参考图1-6。

图1. Lipo6000TM转染试剂与Lipofectamine® 2000Reagent转染效率的比较。

磷酸钙转染方法的优化程腾;李佳佳;贺小英;刘希宇;陈珊;李文达;马利兵【摘要】通过比较293T细胞的接种密度、质粒DNA的量以及 CO2浓度对磷酸钙转染方法的影响，确定最佳的转染条件。

以各单因素试验的最适条件为依据，设计三因素三水平的正交试验。

结果表明，磷酸钙介导质粒DNA转染，当293T细胞的接种密度为5×105/mL、质粒 DNA 的量为30μg、细胞培养环境 CO2浓度为3%时，转染效果最佳。

%In this study,the effects of seeding density of 293T cells,as well as the amount of plasmid DNA and the concentration of CO2 in culture environment,on the efficiency of calcium phosphate transfec—tion were compared,optimum transfection condition was confirmed.On the basis of optimum condition obtained from single factor experiments,orthogonal tests in three levels of three factors were designed and performed.The results showed that the highest transfection efficiency was obtained when the seeding den—sity of 293T cells was 5×105/mL,the amount of plasmid DNA was 30μg and the concentration of CO2 in culture environment was 3%.【期刊名称】《内蒙古师范大学学报（自然科学汉文版）》【年(卷),期】2014(000)006【总页数】5页(P776-780)【关键词】磷酸钙;质粒DNA转染;293T细胞;接种密度【作者】程腾;李佳佳;贺小英;刘希宇;陈珊;李文达;马利兵【作者单位】内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010;内蒙古科技大学数理与生物工程学院，内蒙古包头 014010【正文语种】中文【中图分类】Q987.2近年来关于诱导性多潜能干细胞(induced pluripotent stem cells,iPSCs)的研究[1-4]是生物技术研究领域的热点之一,在iPSCs的研究中,应用最多的载体是逆转录病毒载体和慢病毒载体,二者都能获得很高的诱导效率.将逆转录病毒载体和包装质粒一起转染到293T细胞后培养一段时间即可制备逆转录病毒颗粒.采用质粒DNA 转染293T细胞的方法有多种,应用较为广泛的有脂质体法、磷酸钙法、电穿孔法等.用以转染的脂质体多为商业化的脂质体,性质稳定,转染效率高,但价格昂贵.电穿孔法操作简单,但是需要对相应实验条件进行摸索,同时细胞在转染时的致死率大.磷酸钙应用成本低,对具体的体系加以优化后也能获得比较高的转染效率和病毒滴度.本实验采用磷酸钙转染的方法,从293T细胞的接种密度、质粒DNA的量及CO2浓度三方面进行研究,确定最佳的转染条件,以便为后续诱导人的iPS细胞进行准备.1.1 试剂和溶液试剂:胰蛋白酶、台盼蓝购于Amresco公司,EDTA,胎牛血清(fetal bovine serum,FBS)购于杭州四季青公司,DMEM(高糖)培养基购于Gibco公司,青霉素、链霉素购于华北制药,其余试剂均购于国药集团化学试剂有限公司,重组逆转录病毒载体p EYK-E4由内蒙古科技大学王建英教授惠赠,其病毒包装载体p LP1、p LP2、p LP/VSVG购于Invitrogen公司.溶液:D-Hanks液、胰蛋白酶消化液(0.25%胰蛋白酶、0.05%EDTA)、0.4%台盼蓝染液、含10%FBS的DMEM(高糖)培养液(青霉素100IU/m L、链霉素100μg/m L)、含不同浓度FBS的各种培养液、细胞冷冻液.除非特别说明,文中所用相应溶液的配制方法均参见文献[5].1.2 磷酸钙介导质粒DNA转染和包装病毒的生产、收集转染前24 h,通过胰酶消化收集对数期生长的293T细胞,以适宜的密度接种于100 mm培养皿.加入10 m L完全培养液,于5%CO2、饱和湿度、37℃的培养箱过夜培养细胞.取适量超螺旋质粒DNA溶于0.5 m L 0.25 mol/L CaCl2,混匀,然后将其加至0.5 m L 2×BES缓冲液中,室温下孵育10～20 min.重组逆转录病毒载体质粒和包装质粒的比为p EYK-E4∶p LP1∶p LP2∶p LP/VSVG=1∶0.45∶0.45∶0.8.滴加CaCl2-DNA-BBS溶液于细胞中,轻轻旋转以混匀.放入适宜CO2浓度、饱和湿度、37℃的培养箱中培养细胞12～16 h.吸去培养液,用培养液洗涤细胞2次.加10 m L新鲜的完全培养液.于5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱培养32～36 h.转染48 h后细胞培养液中已含有病毒,可以收集含病毒的培养液.1.3 转染条件的优化1.3.1 磷酸钙介导质粒DNA转染中293T细胞的接种密度对病毒包装效率的影响以5×104,1×105, 5×105,10×105,50×105个/m L将293T细胞接种于100 mm 培养皿中,每皿加10 m L细胞悬液,转染时质粒DNA量为30 g、CO2浓度为5%.转染后测定滴度,以确定转染时293T细胞的最优接种密度.1.3.2 磷酸钙介导质粒DNA转染中质粒DNA的量对病毒包装效率的影响采用1.3.1中所得的最佳接种密度,设置细胞培养环境CO2浓度为5%,质粒DNA的量为10,20,30,40,50μg,转染后测定滴度,以确定转染时质粒DNA的最佳用量.1.3.3 磷酸钙介导质粒DNA转染中细胞培养环境CO2浓度对病毒包装效率的影响采用上两步骤中所得的最佳接种密度和最佳质粒DNA的量.转染时细胞培养环境CO2浓度设置1%、2%、3%、4%、5%5个梯度.转染后测定滴度,确定转染时最优的细胞培养环境CO2浓度.1.3.4 磷酸钙介导的质粒DNA转染条件中影响病毒包装效率因素的正交实验根据最优条件设计三因素三水平的正交实验,以确定三因素中的主次关系及病毒包装的最优化转染条件.1.4 逆转录病毒颗粒滴度的测定将收集的含病毒的培养基,转入15 m L离心管中,4℃4 500 r/min离心5 min沉淀细胞碎片,吸取上清液,以0.45μm滤膜的滤器过滤上清液.取相应体积的液体进行病毒滴度的测定.其他的则以2 m L的量分装在冷冻管里,置于-80℃下保存备用.提前24 h在6孔板中接种293T细胞,每孔接种2×105个,培养过夜汇合度达到20%～50%.取病毒上清液分别加入新鲜的培养液稀释102、103、104、105、106倍,同时加入Polybrene浓缩液,使Polybrene浓度达到6μg/m L.移去孔中的培养基,以D-Hanks溶液冲洗两次后,每孔加入1 m L稀释液,并设置不加病毒上清液的空白对照孔.置于5%CO2、饱和湿度、37℃培养箱中吸附5 h,移去培养液,加入10%FBS的DMEM (高糖)完全培养液,同时向全部的孔中加入博莱霉素浓缩液,终浓度为200μg/m L.每2～3 d换液一次,同时观察处理孔和对照孔的细胞状态,包括细胞死亡的状况和抗性集落的出现.第13 d对各孔中的集落数目进行计数.取数量适中且细胞集落比较清晰的孔的数据进行计算:病毒滴度(CFU/m L)=细胞集落个数×稀释倍数/加入的病毒液体积.2.1 293T细胞接种密度对病毒包装效率的影响以5×104,1×105,5×105,10×105, 50×105个/m L接种293T细胞,转染时质粒DNA量为30μg、细胞培养环境CO2浓度为5%,所获得的病毒的滴度如图1所示.由图1可知,293T细胞的接种密度对病毒包装效率具有一定影响.在接种密度达到5×105个/m L时,所获得的病毒的滴度是最大的,能达到6 500 CFU/m L;接种密度在1×105个/m L、10×105个/m L时,所获得的病毒的滴度分别为6 100 CFU/m L和5 900 CFU/m L,相比之下差异显著(P＞0.05);接种密度为5×104个/m L和50×105个/m L时,病毒的滴度不理想,只能达到4 700 CFU/m L和4 200 CFU/m L.因此在进行磷酸钙介导的质粒DNA转染时,293T细胞的接种密度以5×105个/m L为宜.2.2 质粒DNA的量对病毒包装效率的影响采用5×105个/m L的293T细胞接种密度,设置CO2浓度为5%,转染时质粒DNA的量设置为10, 20,30,40,50μg,转染后测定滴度,所获得的病毒的滴度如图2所示.由图2可知,质粒DNA用量从10μg到20μg,病毒滴度有上升的趋势,在20μg时病毒的滴度最大,为7 300 CFU/m L,而10μg时仅能达到5 900 CFU/m L,虽然质粒DNA量为30μg时病毒的滴度有所下降,但是也能达到6 900 CFU/m L,与前一个梯度差异不显著(P＞0.05).继续加大质粒DNA的量时,病毒的滴度呈现比较大幅度的下降.当质粒DNA量为40μg和50μg时,病毒的滴度分别为5 300 CFU/m L和5200 CFU/m L,二者差异不显著(P＞0.05),说明此时质粒DNA量并不再足以影响病毒的包装效率.因此质粒DNA的量在20μg时比较适宜.2.3 细胞培养环境CO2浓度对病毒包装效率的影响293T细胞的接种密度以5×105个/m L、质粒DNA的量为20μg,转染时细胞培养环境CO2浓度设置1%、2%、3%、4%及5%,转染后测定的病毒滴度,结果如图3所示.由图3可知,细胞培养环境CO2浓度对对病毒包装效率的影响是比较明显的,从1%到3%呈现快速上升的态势,在细胞培养环境CO2浓度为3%时,病毒的滴度达到了最大值,为1.46×104CFU/m L,随后细胞培养环境CO2浓度逐渐增高,所获得的病毒的滴度也在下降.细胞培养环境CO2浓度为1%时病毒滴度只能达到5 600 CFU/m L,为最低值;细胞培养环境CO2浓度为2%可达到9600 CFU/m L,低于细胞培养环境CO2浓度为4%时的1.20×104CFU/m L,但要比细胞培养环境CO2浓度为5%时的7000 CFU/m L要高.因此比较适宜的范围为2%～4%,本文选择3%为适宜条件.2.4 正交实验根据各单因素试验(293T细胞的接种密度、细胞培养环境CO2浓度、质粒DNA 的量)的最适条件为依据,设计三因素三水平的正交试验,见表1,所得结果如表2所示.由表2中的极差分析可知,影响病毒包装效率的磷酸钙介导质粒DNA转染三个因素的主次关系为B＞C＞A,即细胞培养环境CO2浓度＞质粒DNA的量＞293T细胞接种密度,最优水平的组合为A2B2C3,即转染的最佳条件为293T细胞的接种密度5×105个/m L、细胞培养环境CO2浓度3%、质粒DNA的量30μg.使用磷酸钙介导的质粒DNA转染293T细胞制备逆转录病毒颗粒时,最佳的条件为293T细胞的接种密度为5×105个/m L、细胞培养环境CO2浓度为3%、质粒DNA的量为30μg,此条件下可获得1.9×104CFU/ml的病毒滴度.本实验参照的是文献[6]中改进型的磷酸钙介导质粒DNA转染真核细胞的方法,这种方法相对于传统方法的效率要高出很多.本实验以转染中最为关键的影响因素对转染体系做了相应的优化.293T细胞是本次实验中所使用的包装细胞系.这种细胞是最适合磷酸钙法转染的细胞之一,在优化后的转染条件中能达到很高的病毒滴度.而293T细胞接种密度对本实验的影响不仅仅限于转染的进行,还包括病毒生产的过程.Kotani等[7]认为逆转录病毒的滴度和使用的包装细胞数量是相关的,而杨生玺等[8]的研究称逆转录病毒的滴度随包装细胞(PA317)密度上升而上升.但本实验使用的100 mm培养皿的最适的接种密度为5×105个/m L,细胞的接种密度过小或过大都会影响实验结果.低的接种密度在进行转染时,细胞的绝对数量达不到,相应的被转染的细胞数量也就少;由于293T细胞生长很迅速,当接种密度过大时,在进行转染时,细胞的汇合度就会很大,细胞的生长活动会受到抑制,同时293T细胞的贴壁性不强,汇合度大的细胞在转染和病毒制备的过程中会成片的浮起,极大影响病毒的制备.而且293T细胞的生长状态也很重要,进行转染和病毒生产的细胞一般都要是生长旺盛的细胞,而293T细胞汇合度很高时,其细胞的生长状态会受到抑制,长满后的细胞明显衰退,抑制了病毒的生产.有研究[9]使用无CO2和低温的环境来减缓已经长满后的细胞的衰退,从而提高病毒分泌效率.而本实验中,生长状态好的293T细胞接种24 h汇合度能达到50%左右,进行转染、病毒生产后,细胞则基本长满培养皿底部,细胞状态和数量均能达到最佳状态.质粒DNA的量会影响磷酸钙-DNA沉淀的性质.实验中只有质粒DNA量在20μg 和30μg时转染效率和病毒的包装效率比较高.DNA的量在实验中是以质粒DNA 的浓度来体现的,DNA最佳浓度的范围较窄,合适的DNA浓度形成的磷酸钙-DNA 沉淀会更易形成细致的沉淀,利于转染.同时质粒DNA的纯度、形式也会对转染效率有影响.由于细菌污染的抑制作用,不纯的质粒DNA转染的效率极低;线性质粒DNA转化效率的也是很低的,因为其与磷酸钙形成沉淀的速度慢,DNA与胞内核酸酶接触时间比较长[10-11].所以本实验中使用的质粒DNA都是使用高纯度质粒DNA提取试剂盒提取的,其的值都在1.8～1.9,经过电泳检测抽提到的质粒基本上都是超螺旋状态的.CO2浓度对病毒包装效率的影响是通过影响培养液p H环境而实现的.也有研究[9]使用了无CO2培养条件和32℃的低温,称获得的病毒滴度能提高10倍,而这种条件影响的不仅包括p H,还有细胞的生长状态,与普通的磷酸钙转染体系差别很大.一般细胞培养使用的培养液中都会有Na HCO3,通过HCO-3/CO2缓冲系统维持p H于7.2～7.4之间的稳定,而与之相配的CO2气体环境一般在5%才能补偿外溢的CO2,以防止其碱化.但磷酸钙-DNA沉淀形成的缓慢过程中,则需要微酸的p H,最佳的p H为6.96[6].所以2×BES的在配制的时候,p H值严格要求在6.96,然后就要采用适宜的CO2浓度来维持p H的稳定.从实验结果来看,1%CO2浓度则显然过低,其获得的病毒滴度也是最低的.最为常用的5%CO2浓度并不适合于磷酸钙介导的质粒DNA转染,其维持的培养液的p H相对来说还是偏碱性的.最适条件3%CO2浓度中所能获得病毒的滴度是5%CO2浓度环境中的2倍以上,低CO2浓度的培养,能显著的提高病毒的包装效率.本实验确定的最优化的转染条件所获得的病毒滴度是较高的,达到了1.9×104CFU/m L,并不低于其他报道[8,9,12-13]中逆转录病毒载体包装时所得到的病毒滴度.有研究称单个质粒转染的效率要高于多质粒共转染,采取单个质粒分批次转染的方式有时可以获取更高的病毒滴度.本实验采用的多质粒共转染的方式,这主要是因为单质粒分批转染时间长、操作环节多,加之293T细胞生长速度快、细胞贴壁性不好,转染操作也会对其造成损伤,使得后续质粒转染效果会受到影响,也易对细胞培养体系造成污染.【相关文献】[1] Takahashi K,Yamanaka S.Induction of pluripotent stem cells from mouse embryonic and adult fibroblast cultures by defined factors[J].Cell,2006,126(4):663-676.[2] Takahashi K,Tanabe K,Ohnuki M,et al.Induction of pluripotent stem cells from adult human fibroblasts by defined factors[J].Cell,2007,131(5):861-872.[3] Yamanaka S.Elite and stochastic models for induced pluripotent stem cell generation[J].Nature,2009,460(7251):49-52.[4] Trokovic R,Weltner J,Manninen T,et al.Small molecule inhibitors promote efficient generation of induced pluripotent stem cells from human skeletal myoblasts[J].Stem Cells Dev,2013,22(1):114-123.[5] 马利兵,赵秀娟.动物细胞工程[M].长春:吉林大学出版社,2011.[6] [美]萨姆布鲁克J,拉塞尔D W.分子克隆实验指南[M].黄培堂,译.北京:科学出版社,2002:1286-1287.[7] Kotani H,Newton P B,Zhang S,et al.Improved methods of retroviral vector transduction and production for gene therapy[J].Hum Gene Ther,1994,5(1):19-28.[8] 杨生玺,蒋虹.重组逆转录病毒载体的包装及病毒滴度影响因素[J].第四军医大学学报,2005,26(14):261.[9] 单路娟,刘越坚,吴泰华.逆转录病毒滴度测定新方法的实验研究[J].大连医科大学学报,2010,32(4):483-485.[10] 邓虎平,庄然,贾卫,等.人CD22分子胞膜外区D1和鉴定和D2真核表达载体的构建、表达[J].免疫学杂志,2007, 23(5):499-501.[11] Zheng L H,Bao Y L,Wu Y,et al.Cantharidin reverses multidrug resistance of human hepatoma Hep G2/ADM cells via down-regulation of P-glycoprotein expression[J].Cancer Lett,2008,272(1):102-109.[12] 许建.基于逆转录病毒载体的高效表达系统的建立和应用[D].北京:中国人民解放军军事医学科学院,2008.[13] 满朝来,张庆,陈岩,等.逆转录病毒的高效包装及转基因技术平台的建立[J].生物医学工程学杂志,2007,24(5): 1111-1117.。

磷酸钙转染[实验目的]1 了解细胞转染技术原理和基本方法2 磷酸钙沉淀法的基本技术要点[实验原理]磷酸钙沉淀法是基于磷酸钙-DNA复合物的一种将DNA导入真核细胞的转染方法，磷酸钙被认为有利于促进外源DNA与靶细胞表面的结合。

磷酸钙-DNA复合物粘附到细胞膜并通过胞饮作用进入靶细胞，被转染的DNA可以整合到靶细胞的染色体中从而产生有不同基因型和表型的稳定克隆。

这种方法首先由Graham和van der Ebb使用，后由Wigler修改而成。

可广泛用于转染许多不同类型的细胞，不但适用于短暂表达，也可生成稳定的转化产物。

[仪器、材料和试剂]1 呈指数生长的真核细胞（如HeLa,BALB/c 3T3,NIH 3T3,CHO,或鼠胚胎成纤维细胞）2 完全培养液（依所用的细胞系而定）3 CsCl纯化的质粒DNA （10～50μg/次转染，二次纯化）4 2×HEPES缓冲盐水(HeBS)(pH6.95～7.05) 50.0mmol/L HePes;280mmol/L NaCl;10mmol/L KCl;1.5mmol/L葡萄糖。

用0.5mmol/L NaOH调pH至6.95～7.05,过滤除菌后,-20℃保存备用。

5 2.5mol/L CaCl2过滤除菌,-20℃保存备用。

6 磷酸缓冲盐水（PBS）7 37℃，5%CO2的加湿培养箱8 100mm组织培养平板9 15ml锥形管[方法与步骤]1 传代细胞准备细胞在转染前24ｈ传代,待细胞密度达50%～60%满底时即可进行转染。

加入沉淀前3～4h，用9ml完全培养液培养细胞。

2 DNA沉淀液的准备首先将质粒DNA用乙醇沉淀（10～50μg/10cm 平板），空气中晾干沉淀，将DNA沉淀重悬于μL无菌水中，加50μL2.5mol/L CaCl2。

3 用巴斯德吸管在500μL 2×HeBS中逐滴加入DNA-CaCl2溶液，同时用另一吸管吹打溶液，直至DNA-CaCl2溶液滴完，整个过程需缓慢进行，至少需持续1～2min。

冻存转染试剂配方引言冻存转染试剂是一种常用的生物学实验试剂，用于将冷冻保存的生物样品转染到细胞中进行后续的实验分析。

正确的冻存转染试剂配方能够确保转染的效果和稳定性。

本文将详细介绍冻存转染试剂的配方和制备方法。

试剂配方冻存转染试剂的配方通常包括几个关键成分，如转染缓冲液、冻存液和转染剂等。

下面将详细介绍每个成分的配方和制备方法。

转染缓冲液配方转染缓冲液是用于稀释和溶解冻存液的缓冲溶液，其目的是提供适当的pH和离子浓度来促进转染。

以下是一种常用的转染缓冲液配方：•DMEM/F12培养基：450 ml•无血清胎牛血清：50 ml• 1 M HEPES缓冲液（pH 7.4）：5 ml将上述成分按照给定的比例混合均匀，可以获得一定体积的转染缓冲液。

冻存液配方冻存液是用于保存生物样品的缓冲液，通常富含保护剂和冷冻保护剂。

以下是一种常用的冻存液配方：•FBS：50%•DMSO：40%•10x DPBS：10%将上述成分按照给定的比例混合均匀，可以获得一定体积的冻存液。

转染剂配方转染剂是用于增加细胞膜通透性以便于冻存样品的转染。

以下是一种常用的转染剂配方：•Lipofectamine 2000：1.5 μl•转染缓冲液：100 μl将上述成分按照给定的比例混合均匀，可以获得一定体积的转染剂。

制备方法冻存转染试剂的制备方法相对简单，以下是一般的制备步骤：1.首先准备好所需的材料和试剂。

2.根据上述配方，按照给定的比例准确称取相应的药品和试剂。

3.将药品和试剂依次加入容器中，并充分混合均匀。

4.混合好的试剂可以直接使用，也可以根据实验需求进行分装和冻存保存。

注意事项在制备冻存转染试剂时，需要注意以下几点：1.所有试剂和材料必须严格按照配方和制备方法进行操作，避免误差和污染。

2.制备过程中要保持清洁和无菌，避免细菌和其他污染物的影响。

3.制备好的试剂可以根据实验需求进行分装和冻存保存，冻存温度通常为-20°C或-80°C。

一个基因被克隆后，人们总希望将其导入不同类型细胞内，以研究基因调控、基因表达、分离特定蛋白质产物等。

要完成这些目的，都必须将DNA有效地导入细胞。

磷酸钙法是当前较为常用的将DNA导入真核细胞的方法之一。

此法成功的关键在于制备理想的磷酸钙—DNA共沉物。

磷酸钙—DNA共沉物能在饱和溶液中自动生成，但要制备出具有高效转染的共沉物非常困难。

只有在很苛刻的理化条件下，严格控制共沉物的起始及生成条件下才能得到高效转染的共沉物。

因为众多的参数影响而使其制备困难，如质粒的质量、CaCl2、Na2HPO4的浓度、HEPES的pH值、反应温度、反应时间等均能影响共沉物的生成，影响溶液中DNA结合到共沉物上，明显影响转染效率。

本文介绍一种提高质粒质量的方法以制备理想共沉物。

1材料与方法1.1质粒制备将乙肝病毒表面抗原(HBsAg)类主蛋白的编码基因S插入真核细胞表达质粒PRC／CMV中CMV启动子的下游，所获得的重组质粒转染真核细胞可高效表达HBsAg主蛋白。

将此质粒转化大肠杆菌HB101，大量扩增后碱裂解法抽提质粒，酚／氯仿／异戊醇法纯化质粒，灭菌重蒸水溶解并定容至1Μg/lΜl备用。

1.2DNA磷酸钙共沉物的制备取10Μg质粒(10Μl)，加入到eppendorf管中，于管中加入2mol/L CaCl262Μl，混匀，此时可见有混浊出现，将此eppendorf管12000r/m离心10min，取上清液加入438Μl水中，此为DNA—CaCl2溶液。

另取一支试管，加入2×HEPES缓冲液(280mmol/lNaCl, 1.5mmol/l Na2HPO4，50mmol/lHEPES, pH 7.03)500Μl，在HEPES缓冲液中吹气混匀方式下缓慢滴入DNA—CaCl2溶液，加完后将试管于37℃水浴箱中孵育2—3min，此时可见溶液变为乳白色混浊，将此溶液倒入10cm细胞培养板中进行转染或将此溶液倒入eppendorf管中，10000r/min 离心3min，弃上清液，加入适量灭菌生理盐水混匀终止反应。

磷酸钙法细胞转染试剂盒简介：外源基因导入真核细胞的方法有很多种，如磷酸钙转染法、DEAE-葡聚糖转染法、脂质体法、电穿孔法、显微注射法等。

Leagene 磷酸钙法细胞转染试剂盒(Calcium Phosphate Cell Transfection Kit)是在传统的磷酸钙细胞转染方法的基础上进行了改良，提高了转染效率，并降低了毒性，可用于磷酸钙法转染细胞，不仅可以瞬时表达，也可以筛选稳定株。

本转染试剂盒主要适合于大多数贴壁细胞的转染，也可于一些悬浮细胞的转染，一般要求DNA 浓度在10～50μg 为宜，Hela 、BALB 等细胞沉淀放置16h ，CHO 、DUKX 、B Ⅱ等细胞可以通过甘油、DMSO 进行热休克处理以提高转染效率。

组成：操作步骤(仅供参考)：(一)贴壁细胞转染：1、 在转染前24h 用胰蛋白酶消化培养细胞，取适量对数期细胞转移至新的培养器皿中，待细胞密度大70～80%满时即可进行转染。

2、 在加入DNA 之前加入2ml 不含抗生素的完全培养液，置于37℃ 5% CO 2培养箱培养。

3、 取2～6μg DNA(体积不宜超过20μl)加入100μl Calcium chloride solution ，混匀，即为DNA-CaCl 2溶液。

4、 取BBS solution 100μl ，用移液器一边吹打BBS solution ，一边逐滴加入DNA-CaCl 2溶液。

5、 室温静置20～30min ，即为DNA-CaCl 2-BBS 溶液，此时可能出现极其微小颗粒沉淀。

6、 取DNA-CaCl 2-BBS 溶液底部物质均匀加入到6孔板细胞中，轻轻晃动混匀。

7、 置于37℃ 5% CO 2培养箱培养。

如果培养细胞为CHO 、DUKX 等，可以DMSO 或甘油进行休克处理，转染效率会大大增加，用2ml 含10%甘油或20%DMSO 的完全培养液替换当前培养液，室温下静置，加5ml PBS 摇动混匀。

磷酸钙转染：
磷酸钙转染具有转染简单，所需质粒少，转染效率高，转染成本低等特点，我在转染HEK293T细胞时，使用的都是磷酸钙法，转染效率可达到80%，足以满足一般
的实验需要。

实验步骤：
1，分细胞：在转染前一天分细胞，使得转染时细胞的密度在30-70%之间；
2，换液：在转染前3-6小时，给细胞换新鲜培养液，使得细胞生长状态达到最好；6，转染：目的DNA用250mM CaCl2按比例在1.5ml管中混匀(DNA/CaCl2/Well ：4ug/170ul/10cm, 2ug/85ul/6well, 0.5ug/22ul/24well)；随后，在1.5ml管放在震荡器上震荡时，逐滴加入等体积的2XHBS；用枪头将混好的“CaCl2+2×HBS”直接加入到细胞培养皿中，晃动混匀；
４，DMSO处理：加有―CaCl2+2×HBS‖的细胞，在培养箱中37℃培养4-6小时后, 吸去培养基，加入可以覆盖细胞表面的适量10-15% DMSO，室温孵育2分钟；再吸去DMSO，加入新鲜培养基。

一般在转染后的1-2天后收细胞。

溶液配制：
无菌水：高压灭菌，分装
250mM CaCl2：用水配置成2M CaCl2母液，使用时，用水稀释到250mM，室温保存；
2×HBS：50mM HEPES, 280mM NaCl, 1.5mM Na2HPO4, 12mM glucose,
pH 7.10-7.40, 按0.05配置一个梯度，然后分别检测相应的转染效率，最好的一批分装后冻存在-20℃。

两种溶液都通过过滤除菌；
10%-15% DMSO：DMSO用1×PBS稀释即可。