Klebsiellaoxytoca发酵木糖生产2_3_丁二醇的研究

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地衣芽孢杆菌高产2,3-丁二醇菌株的选育和发酵研究

·研究报告·生物技术通报BIOTECHNOLOGY BULLETIN2014年第8期2，3-丁二醇是一种重要的化工原料，广泛用于食品、化妆品、药物、塑料、卫生保健和能源等领域［1］。

2，3-丁二醇脱水形成的甲乙酮是有效的燃料添加剂，并且其自身具有极高的燃烧值（27 198 J/g），优于甲醇（22 081 J/g）和乙醇（29 005 J/g），因此有望成为新能源的替代品［2，3］，但其化学合成工艺繁琐、污染严重，不符合绿色化工和低碳环保的要求。

微生物法生产2，3-丁二醇是一种新型工业发展模式，收稿日期：2014-01-23作者简介：郭文逸，女，硕士研究生，研究方向：工业微生物育种；E -mail: guowenyi000@ 通讯作者：杨洪江，男，博士，教授，研究方向：工业微生物育种；E -mail: hongjiangyang@地衣芽孢杆菌高产2，3-丁二醇菌株的选育和发酵研究郭文逸孙庆惠宋丽娜高松松杨洪江（天津科技大学生物工程学院工业微生物教育部重点实验室天津市工业微生物重点实验室，天津 300457）摘要：目前2，3-丁二醇生产菌株大部分为致病菌，对人类健康和环境具有一定威胁。

从牛奶样品中分离到1株产2，3-丁二醇的芽孢杆菌127-7，分析其16S rRNA 基因序列，确定该菌株为地衣芽孢杆菌（Bacillus licheniformis ）。

进一步对菌株127-7进行紫外诱变，筛选耐受高浓度葡萄糖和高产乙偶姻的菌株。

摇瓶发酵结果显示，突变株BL41的2，3-丁二醇产量较出发菌株127-7提高了41.1%。

对发酵副产物分析发现，不控制发酵液pH 可以显著降低乳酸产量，2，3-丁二醇产量在72 h 达到81.4 g/L。

进一步调整补糖策略，维持最低残糖浓度为30 g/L，菌株BL41产2，3-丁二醇83.4 g/L，最高产率为1.9 g/L·h，发酵时间缩短至46 h。

木质纤维素原料发酵法生产23丁二醇的研究进展

司阳等以玉米桔秆作为初始原料，研究了预处理、纤维素酶解、单批发酵、分批补料发酵、等各环节的关键技术参数。
杨洋等采用稻草纸浆作为原材料，以纤维素酶对稻草纸浆水解条件进行优化，从而利用肺炎克雷伯氏杆菌对稻草酶水解液进行发酵。
7 展望
石油等非再生资源短缺，木质纤维原料发酵法生产2, 3-BD顺应社会追求可持续发展的趋势。
其中以克雷伯氏菌属和芽孢杆菌属研究的最多。其底物范围很宽, 适应环境能力较强；并且产生副产物乙醇的量很少；是最具工业化潜力的热门菌株之一。
4 发酵条件
1
温度
.
12 pH .
13 溶解氧浓度 .
14 外源因子 .
酶活力很大程度上依赖于温度, 会影响各种酶反应的速率。产2, 3-BD的最适温度范围是30~38℃。
张根林等利用脱毒后的棉秆稀酸水解液为底物发酵制备2,3BD，发现补料批式发酵工艺可以缓解棉秆水解液对微生物生长与代谢的抑制作用。
清华大学Ke-Ke Cheng等以玉米芯酸水解液为原料，通过 Klebsiella oxytocaACCC 10370发酵产2,3-BD。考察了水解液中的醋酸以及pH的影响。
参考文献
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微生物发酵法生产2_3_丁二醇瓶颈因素分析

3． Shandong Research and Design Institute of Food and Fermentation Industries，Jinan 250013，China）
Abstract 2，3 － butanediol is a kind of chemical material and liquid fuel with huge value and is applied widely． It can be produced by many microbes through metabolic processes，but its yield varies significantly． In this paper，the production progress of 2，3 － butanediol through fermentation was reviewed from several aspects as follows： fermentation strains，metabolic pathway，substrate，separation and extraction methods； the limiting factors during 2，3 － butanediol production were also discussed． It was pointed out that the breeding of ideal strains and the kinetics study of certain enzymes in the metabolic pathways should be targeted at to optimize the fermentation process． Then the application of the derivatives from 2，3 － butanediol should be further explored to decrease the cost and increase the yield．

耐高糖高产2,3-丁二醇产酸克雷伯氏杆菌的选育

耐高糖高产2,3-丁二醇产酸克雷伯氏杆菌的选育
近年来，2,3-丁二醇作为一种重要的化工原料受到了广泛的关注，而克雷伯氏杆菌在其生产中扮演了非常重要的角色。

为了提高2,3-丁二醇的产量，需要选育出高效率、高糖耐受性和高
产2,3-丁二醇的克雷伯氏杆菌。

首先要根据生产需求和条件，选定适合生产的克雷伯氏杆菌菌株。

在选择菌株的过程中，需要考虑到需要使用的基质种类和生产条件等一系列因素。

一般情况下，高糖耐受性以及较高的2,3-丁二醇产酸能力是导致克雷伯氏杆菌受到选择的重要因素。

选定菌株后，需要对其进行优化培养条件的调查。

克雷伯氏杆菌的生长条件是非常复杂的，需要确定其最适生长条件，并探寻不同生长阶段所需的营养情况，以改善其生长状况。

其中，探索其厌氧生长机制及调控代谢物产生的基因和途径有助于克雷伯氏杆菌生产2,3-丁二醇的提升。

接着，需要进行基于遗传方法的杂交和突变筛选来获得较为理想的菌株。

这些方法主要包括基因修复、信号传导和代谢回路调控等方面。

采用这些方法可以有效提高油酸棕榈酸产酸菌的产酸能力，从而提高2,3-丁二醇的产量。

最后，对于得到的优良菌株，可以进行反复培养进行稳定性测试，以确保其长时间的生产表现。

这样才能确保克雷伯氏杆菌的选育工作是真正成功的。

总而言之，耐高糖高产2,3-丁二醇产酸克雷伯氏杆菌的选育需
要深入研究克雷伯氏杆菌的生长条件和代谢调控机制，采用适当的遗传方法来改进菌株的生产性能。

该过程需要专业技术和严密的实验测试，但最终是值得的，因为高效的2,3-丁二醇生产是对我们经济、环境和能源的一种重要的贡献。

木糖母液发酵生产2

ＦＳ４Ｈ０００ＬＭｎ０＂Ｈ０００ＬＺＳ４７００１。ｅＯ＂２．５ｇ，Ｓ４２．５／，ｎ０￣Ｈ２．Ｌ在优化后的发酵培养基中进行摇瓶发酵，２ｈLeabharlann 酵７０／７０ｇ０７
２３丁二醇浓度为３．ｇ，，一５Ｌ比优化前增加了７Ｌ２３丁二醇得率达到了理论得率的９％。７／．ｓ，，－５／２关键词：菌种筛选；糖母液；，－二醇；养基优化木２３丁培
摘要：对４株２３丁二醇生产菌株利用木糖的能力进行比较，其中肺炎克雷伯氏茵（ｌｓＵｐｅｍｎａＩＣ，一ＫｅｉａｎｕｏｉＣＣｂｅｅ
１０１具有最佳的发酵性能，以该茵为出发茵株对其利用木糖母液发酵２３丁二醇进行研究。０１）并，一首先通过单因素试
ｃｍｏｉｏａｓｏｏｓｘｌｅｍｔｅｉｏ０ｇ，ＳＰ１ＬＫＨ０ｇ，ＨＰ４Ｌ（Ｈ）０ｏｐｓｉｗｓｌｗ：ｙｓｏｒｌｕｒ／ＣＬ２ｇ，２Ｐ４／Ｋ２０ｇ，４Ｓ４ｔｎａｆｌｏｈｑ９Ｌ／７Ｌ２／Ｎ２
２，－３ＢｕｔｎｄｏｏｃｉｎｉｇＸｙｏｅＭｏｈｅｑｕｒａｅｉｌＰｒｄｕｔｏＵｓｎｉｓｔｒＬｉｏＷＡＮＧｎ — ｈｎ，ＤｏｇｓｅｇＺＨＡＮＧｉｙｎｇＰＣｕ－ｉ，ＥＮＧａ－ｅ，ＸｉｏｐｉＺＨＯＵｅ，ＡＯｎ —ｇａｇＬｉＸＩＤｏｇｕｎ

产酸克雷伯氏杆菌发酵产2_3_丁二醇的培养基优化

第7卷第1期2009年1月生　物　加　工　过　程Chinese Journal of B i op r ocess Engineering Vol .7No .1Jan .2009收稿日期:2008204224基金项目:国家自然科学基金资助项目(20606018);国家重点基础研究发展计划(973计划)资助项目(2007CB707805);国家高技术研究发展计划(863计划)资助项目(2006AA02Z244);江苏省博士后科研资助计划项目(0701035B )作者简介:杜　军(1983—),男,湖北丹江口人,硕士研究生,研究方向:发酵工程;黄　和(联系人),教授,E 2mail:bi otech@njut .edu .cn产酸克雷伯氏杆菌发酵产2,3-丁二醇的培养基优化杜　军,纪晓俊,黄　和,胡　南,任　潇,聂志奎,李　霜(南京工业大学　制药与生命科学学院,材料化学工程国家重点实验室,南京210009)摘　要:采用不同设计方法相结合的策略对耐高糖产酸克雷伯氏杆菌(Klebsiella oxytoca )ME 2UD 2324发酵产2,3-丁二醇的培养基进行优化。

首先在单因素实验的基础上采用Plackett 2Bur man 设计法对影响ME 2UD 2324发酵产2,3-丁二醇的相关因素进行研究,筛选到3种有显著效应的因素(P <0105):葡萄糖、玉米浆和MgS O 4・7H 2O 。

然后利用响应曲面法(Res ponse Surface Methodol ogy,RS M )对这3种因素的最佳水平范围进一步探讨;对得到的回归模型进行分析,得最佳条件(g/L ):葡萄糖220、玉米浆19和MgS O4・7H 2O 014;在最佳条件下,发酵80h,2,3-丁二醇产量从原来的5713g/L 提高到8611g/L,生产强度由0172g/(L ・h )提高到1108g/(L ・h )。

关键词:2,3-丁二醇;产酸克雷伯氏杆菌;Plackett 2Bur man 设计;响应面法中图分类号:T Q923 文献标志码:A 文章编号:1672-3678(2009)01-0034-05O ptim i za ti on of ferm en ta ti on m ed i u m for producti on of2,32but aned i ol by Klebsiella oxytocaDU Jun,J I Xiao 2jun,HUANG He,HU Nan,REN Xiao,N I E Zhi 2kui,L I Shuang(College of L ife Science and Phar maceutical Engineering,State Key Laborat ory of Materials 2O riented Che m ical Engineering,Nanjing University of Technol ogy,Nanjing 210009,China )Abstract:An integrated op ti m izati on strategy involving a combinati on of different designs was used t o op 2ti m ize the p r oducti on of 2,32butanedi ol by Klebsiella oxytoca ME 2UD 24which t olerated high concentrati on of glucose .Based on experi m ental design of a single fact or,the t w o 2level Plackett Bur man design was used t o evaluate the effects of 10variables related t o the p r oducti on of 2,32butanedi ol .Glucose,corn steep liquor,and MgS O 4・7H 2O were identified as the most significant fact ors (P <0105).Res ponse surface methodol ogy was used t o deter m ine the op ti m al levels of these fact ors f or 2,32butanedi ol p r oduc 2ti on .By analyzing the regressi on model,the op ti m al conditi ons of these variables were deter m ined as f ol 2l ows (g/L ):glucose 220,corn steep liquor 19,MgS O 4・7H 2O 014.After 80h of fer mentati on in flask,the concentrati on of 2,32butanedi ol increased fr om 5713g/L t o 8611g/L,and the p r oductivity increased fr om 0172g/(L ・h )t o 1108g/(L ・h ).Key words:2,32butanedi ol;Klebsiella oxytoca ;Plackett 2Bur man design;res ponse surface methodol ogy 2,3-丁二醇作为一种重要的化工原料,在聚酯、染料、药物合成、炸药等领域有着广泛的应用前景[1-2]。

发酵条件对产2,3-丁二醇Klebsiella pneumoniae代谢的影响

发酵条件对产2,3-丁二醇Klebsiella pneumoniae代谢的影响孙丽慧;戴建英;王旭东;修志龙【摘要】通过批式发酵实验考察了通气量和pH对产2,3-丁二醇的Klebsiella pneumoniae CICC 10011代谢特性的影响,确定了发酵2,3-丁二醇的最适条件为:通气量0.10 vvm,pH值5.8.在该条件下发酵8 h,目标产物浓度达到15.76 g/L,产物得率为0.32 g/g葡萄糖,生产强度为1.97 g/(L·h).对发酵过程中细胞生长和主要代谢产物的形成进行分析,结果表明,早期乙酸的形成有利于目标产物2,3-丁二醇的积累,后期有机酸用作底物维持细胞生存.调节底物浓度、通气量和pH,使细胞尽早产生足够的乙酸,维持较长的对数生长期是发酵生产2,3-丁二醇的关键.【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2010(036)008【总页数】6页(P6-11)【关键词】2,3-丁二醇;发酵;代谢特性【作者】孙丽慧;戴建英;王旭东;修志龙【作者单位】大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁,大连,116024;大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁,大连,116024;大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁,大连,116024;大连理工大学生命科学与技术学院,辽宁,大连,116024【正文语种】中文2，3-丁二醇(2，3-butanediol，2，3-BD)是一种非常重要的化工原料和液体燃料，被广泛应用于化工、食品、医药、燃料以及航空航天等多个领域［1－3］。

2，3-丁二醇的生产方法有化学法和生物转化法。

由于其结构的特殊性，采用化学法合成比较困难，成本较高，因而很难实现大规模的工业化生产。

生物转化法即以可再生资源为原料，通过微生物代谢将单糖转化为目标产物［4－5］。

相比化学合成法而言，生物转化法既符合绿色化工的要求，又可避免化学合成的困难，同时可以实现人类社会生产由传统的以不可再生化石资源为原料的石油炼制向以可再生生物质资源为原料的生物炼制转型。

木糖发酵产2,3-丁二醇培养基的优化

ａｌｗ：ｙｏｅ３／，ｅｓｐｗｅ２．ｇＫＨＰ４０ｇＬＫ２Ｐ４．，２Ｏｇ，ｏｉｍｃｒｔ４ｇＬＭｇＯ。Ｈ２．５／，ｓｏｏｓｘｌｓ８．ｇｙａｔｏｄｒ０３ｍ，２Ｏ／，ＨＯ２（ｆｌ４Ｌ１７ＮＳ４／ｓｄ２Ｌｕｉａ／，Ｓ４７０００Ｌｔｅｇ
ａｄｅｐｎｅｕｆｃｔｏ（ｕｃｏｓｎｒｅｌｅｓＴｅｅｕｔｓｏｄｈｔｈｐｉｍｃｍｐｓｉｎｆｈｒｎｔｎｍｅｉｍｒｎｓｏｓｒｅｈｄｆｒａｔｄｔｅｖｌ．ｈｓｌｗｅａｔｅｔｒｓａｍｅｏｆｒａｈｅ）ｒｓｈｔｏｍｕｏｏｉｏｓｔｅ￣ｍｅｔｉｄｕｗｅｔｏａｏｅ
ＡｂｔａｔＴｈｆｃｓｏｙｏｅｎ￣ｏｅｏｒｅｉｏｇｎｃｓｌａｄｍｅａｏｓｏ，一ｕａｅｉｌｉｌｒｎｅｔａｅｙｓｇｅｆｃｏｅｉｎｓｒｃ：ｅｅｅｔｆｘｌｓ，ｉｇｎｓｕｃ，ｎｒａｉａｔｎｔｌｎｎ２３ｂｔｎｄｏｅｄｗｅｅｉｖｓｉｔｄｂｉｌａｔｒｓｉｙｇｎｄｇ
ＸＩＡＯｎ－ｕｎ，ＤｏｇｇａｇＨＡＮｎ－ｉｇＺＮｉｇｎｎ，ＨＡＮＧｕ — ｉｇａｄＧＵＯｅｗｕＣｉｎｎｙＸｕ —
（ｅａｆｎｕｔａＭｉｏｉｌｇ，ｎｓｙｆｄｃｔｎＴａｊｄｓｉｌｃｏｉｌｙａ，ｏｌｅｆＫｙＬｂＩｄｓｉｌｃｂｏｙＭｉｉｒＥｕａｉ，ｉｉＩｕｔａＭｉｂｏｏＫｅｂＣｌｇｏｒｒｏｔｏｏｎｎｎｒｒｙｇＬｅｏＢｏｅｈｏｏ，ｉｊｎｖｒｉｆｃｎｅｎｅｈｏｇ，ｉｊ０４７Ｃｉ）ｉｔｃｎｌＴａｉＵｉｓｙｏｉｃｄＴｃｎｌｙＴａｉ３０５，ｈｎｙｇｎｎｅｔＳｅａｏｎｎａ

微生物发酵法生产2，3-丁二醇的研究

微生物发酵法生产2，3-丁二醇的研究蒋丽群;郭峰;方真;龙运多;张帆【期刊名称】《化学与生物工程》【年(卷),期】2011(28)6【摘要】Production of 2,3-butanediol from glucose by Klebsiella oxytoca fermentation was optimized u-sing response surface methodology (RSM). Based on the Plackett-Burman experiment, urea and acetic acid were identified as the most significant factors. Steepest ascent experiment and central composite experiment were employed to determine their optimal levels with urea concentration of 5. 13 g · L-1 and acetic acid concentration of 0. 703 g · L-1. Under the optimal medium, 2,3-butanediol yield was 0. 456 g · g-1, which was equivalent to 91. 2% of the theoretical value and was 23. 2% higher than that obtained under the initial conditions. In this work, a relatively high yield was achieved by using urea as sole nitrogen source that was less expensive, and the process may find practical applications for 2,3-butanediol production.u00002%采用响应面法(RSM)对产酸克雷伯氏菌发酵葡萄糖生产2，3-丁二醇的培养基进行了优化。

【精品】2-3-丁二醇的生产工艺

2-3-丁二醇的生产工艺2,3-丁二醇的微生物工艺摘要：2，3-丁二醇是一种重要的化工原料和液体燃料，被广泛应用于化工、食品、医药、燃料及航空航天等多个领域，其生产方法主要为生物转化法。

目前生物转化法生产2，3-丁二醇大多数用葡萄糖作为碳源，而葡萄糖的价格较高，且存在与人争粮、与粮争地的问题。

此外，由于2，3-丁二醇具有较强的亲水性和较高的沸点，且发酵液成分复杂，因而该产品下游分离比较困难。

原料成本高、产品分离困难已经成为2，3-丁二醇大规模工业化生产的瓶颈。

因而迫切需要采用新的工艺，并且利用新的廉价的非粮原料作为底物发酵。

关键词：2，3-丁二醇；生物转化法；发酵工艺12，3-丁二醇概况2，3-丁二醇（CH3CHOHCHOHCH3,英文名称2，3-Butanediol,缩写2，3-BD），也成2，3-双羟基丁烷，二亚甲基二醇。

因其分子中含有两个手性碳原子，所以存在三种旋光异构体，分别为D-（-）-2，3-丁二醇、L-（+）-2，3-丁二醇和meso-2,3-丁二醇，它们的结构如图1-1所示。

图1-1 2，3-丁二醇立体异构体Fig1-1 The stereoisomers of 2,3-butanediol2,3-丁二醇在常温下是一种无色无味透明的液体，具有吸湿性；相对分子量为90.12g/mol；bp为178~182℃；mp为23~27℃；燃烧值为2.7198kJ/g;与水混溶，溶于乙醇、乙醚。

22，3-丁二醇的生产方法生产2，3-丁二醇的方法主要有化学法和生物转化法。

目前化学法生产2，3-丁二醇主要以石油裂解产生的四碳类碳氢化合物在高温、高压下水解得到的。

该方法难度大，生产成本高，过程繁琐，不易操作，所以一直很难实现大规模工业化生产，从而也限制了2，3-丁二醇用途的充分开发。

而生物转化法生产2，3-丁二醇采用可再生资源作为原料，通过微生物代谢将单糖转化为目标常务，生物转化法相比化学合成法而言，既符合绿色化学的要求，又可以避免化学合成法的困难，同时可以实现人类社会生产由传统的以不可再生化石能源为原料的石油炼制向可再生物质能源为原料的生物炼制转型，逐渐减少对日益枯竭的石油资源的依赖。

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第29卷第1期2009年2月林　产　化　学　与　工　业Che m istry and I ndustry of Forest Pr oductsVol .29No .1Feb .2009Klebsiella oxytoca 发酵木糖生产2,3-丁二醇的研究收稿日期:2008-01-05 作者简介:冯燕青(1983-),女,山东威海人,硕士生,主要从事生物化工方面的研究　3通讯作者:夏黎明,博士生导师,主要从事可再生资源利用方面的研究。

FE NG Yan 2qing 冯燕青,夏黎明3(浙江大学化学工程与生物工程系,浙江杭州310027)摘　要:　利用一株克雷伯氏菌(Klebsiella oxytoca Z U-03)发酵木糖生产2,3-丁二醇,并对主要发酵工艺参数进行了优化。

实验结果表明:在木糖质量浓度90g/L 、玉米浆质量浓度6g/L 、接种量10%(体积分数)、初始pH 值5.5、30℃的条件下发酵96h,木糖利用率为89%,2,3-丁二醇的质量浓度为36.22g/L,得率为0.45g/g,达到了理论值的90%。

关键词:　2,3-丁二醇;木糖;半纤维素;发酵中图分类号:T Q92;Q932 文献标识码:A 文章编号:0253-2417(2009)01-0103-04Pr oducti on of 2,32Butanedi ol fr o m Fermentati on of Xyl ose byKlebsiella oxytoca Z U 203FENG Yan 2qing,X IA L i 2m ing(Depart m ent of Che m ical Engineering and B i oengineering,Zhejiang University,Hangzhou 310027,China )Abstract:The p r oducti on of 2,32butanedi ol was carried out fr om fer mentati on of xyl ose by Klebsiella oxytoca Z U 203,in which xyl ose was the main reducing sugar in he m icellul osic hydr olysate .Under op ti m ized conditi ons:xyl ose mass concentrati on 90g/L,corn liquor mass concentrati on 6g/L,inoculu m 10%(volu me fracti on ),initial pH value 5.5and 30℃,concentrati on of 2,32butanedi ol reached 36.22g/L and yield of 2,32butanedi ol fr om xyl ose was 0.45g/g .Key words:2,32butanedi ol;xyl ose;he m icellul ose;fer mentati on2,3-丁二醇是石油替代战略中的一种新型平台化合物,可广泛应用于燃料、航空航天、化工、食品等领域[1-3]。

随着化石能源的日益枯竭,可再生的生物能源备受关注[4]。

木糖是木质纤维原料水解产物中含量仅次于葡萄糖的一种单糖,由半纤维素水解生成,含量可达植物纤维水解糖类的35%以上[5]。

传统的酒精酵母不能发酵木糖[6],对于半纤维素的利用一直是国内外关注的热点之一[7]。

作者研究了利用Klebsiella oxytoca Z U-03发酵木糖生产2,3-丁二醇。

1　材料和方法1.1　菌种Klebsiella oxytoca Z U -03,本实验室保藏菌种。

1.2　培养基斜面培养基:蛋白胨10g/L,酵母膏5g /L,葡萄糖10g/L,pH 值5.5。

液体种子培养基:葡萄糖10g/L,酵母膏5g/L,K 2HP O 4　4g/L,pH 值5.5。

初始发酵培养基:木糖90g/L,蛋白胨6g/L,K 2HP O 4　8g/L,MgS O 4　0.5g/L,FeS O 4　0.1g/L,pH 值5.5;以上培养基均在121℃下灭菌15m in 。

1.3　发酵条件250mL 摇瓶装液量60mL,摇床转速150r/m in,发酵温度30℃。

发酵过程中定时取样,检测木糖104　林　产　化　学　与　工　业第29卷和2,3-丁二醇的质量浓度。

1.4　分析方法发酵液中的木糖及2,3-丁二醇质量浓度均用高效液相色谱法测定。

色谱柱为Transgenom ic I C Sep I CE-Coregel87H(300mm×7.8mm),柱温60℃,流动相为超纯水,流速为0.4mL/m in,检测器为Spectra-Physics6040XR示差折光检测器,外标法定量。

2　结果与讨论2.1　木糖质量浓度对发酵的影响从表1中可以看出,初始木糖质量浓度低于110g/L时,木糖利用率基本稳定,接近90%,而当初始木糖质量浓度继续升高时,木糖利用率明显下降,菌体生长受到一定的抑制作用[8]。

而随着初始木糖质量浓度的升高,2,3-丁二醇的得率先增加后减少,在90g/L时达到最大,为0.45g/g,而在130g/L时降到了0.39g/g,下降了13%。

可见利用木糖发酵的生产过程中存在着底物抑制作用。

表1　木糖质量浓度对发酵的影响Table1　Effect of xylose ma ss concen tra ti on s on2,32but aned i ol producti on木糖质量浓度/(g・L-1)xyl ose mass concn.发酵时间/hti m e残留木糖质量浓度/(g・L-1)residual xyl osemass concn.木糖利用率/%xyl ose utilizati on rate2,3-丁二醇质量浓度/(g・L-1)2,32butanedi olmass concn.2,3-丁二醇得率/(g・g-1)2,32butanedi olyield5048 6.398717.900.4170608.878726.080.4390729.718936.220.451108413.238839.630.411309629.447739.130.392.2　氮源种类以及质量浓度对木糖发酵的影响2.2.1　氮源种类的影响　分别以质量浓度为6g/L的蛋白胨、酵母膏、玉米浆、豆饼粉为氮源,发酵96h。

从表2可以看出,以蛋白胨、玉米浆为氮源时,木糖的利用率均较高,接近或达到90%,2,3-丁二醇的得率也达到0.45g/g。

而玉米浆价格低廉,对实际生产中降低成本更有价值,因此,选择以玉米浆作为2,3-丁二醇发酵的氮源。

2.2.2　氮源质量浓度的影响　改变发酵培养基中玉米浆的质量浓度,发酵96h,以探讨氮源质量浓度对木糖发酵生产2,3-丁二醇的影响。

由表2可知随着玉米浆质量浓度的增加,木糖利用率升高;而2,3-丁二醇质量浓度及得率先随玉米浆质量浓度的增加而增大,到玉米浆质量浓度超过6g/L时,则随着玉米浆浓度的增加呈现下降的趋势。

当玉米浆质量浓度较低(2g/L)时,菌体生长受限,不利于2,3-丁二醇的发酵,木糖利用率及2,3-丁二醇的得率均较低。

而当氮源质量浓度过高(>6g/L)时,木糖利用率没有明显提高,但2,3-丁二醇质量浓度有所下降。

究其原因可能是氮源过于充足时菌体大量利用底物进行生长活动,因而其次级代谢产物2,3-丁二醇产量减少。

玉米浆质量浓度为6g/L时,2,3-丁二醇质量浓度及得率均达到最大值,因此以下实验均选用6g/L为适宜的氮源质量浓度。

2.3　pH值对木糖发酵的影响发酵过程中,pH值不仅影响细菌的生长,而且对其代谢过程也有重要作用[9]。

不同pH值条件下发酵96h的结果亦见表2。

从表中可以看出,当pH值为5.5时木糖的利用率及2,3-丁二醇的得率均达到最大值,当pH值低于或高于5.5时木糖利用率及2,3-丁二醇质量浓度均有明显下降,可见pH值对该发酵过程影响较为显著,其适宜的pH值为5.5。

2.4　接种量对木糖发酵的影响在不同接种量条件下发酵96h的实验结果亦列入表2。

当接种量为5%(体积分数,下同)时,发酵液中木糖的残留量高,2,3-丁二醇浓度较低;而接种量超过10%时木糖利用率升高,但2,3-丁二醇得率反而降低。

一方面随着种子量的增加,细菌生长和利用底物的速率加快,另一方面随着接种量的增第1期冯燕青,等:Klebsiella oxytoca发酵木糖生产2,3-丁二醇的研究105　加,伴随着菌体生长对于底物的消耗,降低了发酵液中产物的浓度。

因而10%的接种量较为适宜。

2.5　温度对木糖发酵的影响由于酶活力很大程度上依赖于温度,因此温度在生物转化过程中有重要影响作用。

通常细菌发酵生产2,3-丁二醇的最适温度范围是30～35℃[10]。

从表2结果可以得到,在26～34℃之间,木糖利用率和2,3-丁二醇的得率均随着温度呈先升高后降低的趋势,在30℃时,木糖利用率及2,3-丁二醇的得率达到最高。

表2　不同反应条件对于发酵的影响Table2　Effect of d i fferen t rea ti on cond iti on s on2,32but aned i ol producti on 发酵条件 conditi ons 残留木糖质量浓度/(g・L-1)residual xyl osemass concn.木糖利用率/%xyl ose utilizati on rate2,3-丁二醇质量浓度/(g・L-1)2,32butanedi olmass concn.2,3-丁二醇得率/(g・g-1)2,32butanedi ol yield氮源nitr ogen s ources 蛋白胨pep t one9.109036.410.45玉米浆corn steep liquor9.748936.220.45酵母膏yeast extract13.248530.140.39豆饼粉s oybean cake powder32.456419.720.34玉米浆质量浓度/(g・L-1) corn paste mass concn.230.416619.460.33 415.888230.150.41 69.718936.220.45 89.439033.200.41 108.659031.740.39初始pH值initial pH value 4.521.237623.600.345.010.598831.070.395.59.718936.220.456.013.348533.210.43 6.518.577929.620.41接种量(体积分数)/% inoculum (volume fracti on)516.748130.720.42 109.718936.220.45 15 4.789531.050.36 20 3.239628.530.33温度/℃te mperature 2614.428431.230.41 2811.678733.640.43309.718936.220.45 3210.438834.140.43 3412.108633.460.43图1　2,3-丁二醇发酵的时间进程F i g.1　T i m e course of2,32but aned i ol producti onby K.oxytoca ZU203ferm en t a ti on of xy2lose2.6　Klebsiella oxytoca ZU-03发酵生产2,3-丁二醇的时间进程由图1可以看出,在发酵的前12h有明显的延迟期。