盐芥T-DNA插入突变体库的建立及初步分析

盐芥T-DNA插入突变体库的建立及初步分析摘要:以盐芥[Thellungiella halophila(C. A. Mey.) O. E. Schulz]为材料,利用根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)介导的转化方法,获得T-DNA插入突变群体,构建了一个具有5 000株抗Basta/Kan的盐芥T-DNA插入突变体库,其中有若干个株系有明显的表型改变,包括花期的改变､株型矮小､叶片形状改变等｡并优化了建库的各因素,确定了最佳的盐芥栽培技术及转化体系,盐芥春化温度及时间为 4 ℃､30 d,转化用菌液浓度OD600≈2.0,侵染时间2 min,暗培养1 d,Kan筛选浓度50 mg/L,除草剂(Basta)筛选浓度为稀释1 500倍;这些因素可为根癌农杆菌介导的盐芥转基因､突变体构建等基因组学研究提供强有力的技术平台｡关键词:T-DNA;盐芥;突变体Construction of T-DNA Insertion Mutants Library of Thellungiella halophila and Its Preliminary AnalysisAbstract: An T-DNA insertion mutant library containing 5 000 independent Basta/Kan-resistant lines was constructed by Agrobacterinm tumefaciens-mediated transformation using Thellungiella halophila(C. A. Mey.) O. E. Schulz as material. Among these transformations, several lines showed obvious phenotypes different from wild-type, including late flowering time, dwarf, changed leaf shape and so no. And the optimization of the conditions for Agrobacterium-mediated gene transformation of T. halophila was discussed. The optimal conditions were as follows: bacterial concentration OD600≈2.0, infection time 2 min, dark culture 1 d, kana mycin concentration 50 mg/L, basta were diluted to 1 500 fold. In addition, the results of the study on T. halophila vernalization showed that the bolting time was 30 days, vernalization temperature range was 4~5℃. This wasan efficient and powerful technique for genomic studies on its transformation, mutant construction and so on. Key words: T-DNA; Thellungiella halophila (C. A. Mey.) O. E. Schulz; mutant盐碱地面积的不断扩大,已成为制约农业发展的极大瓶颈｡因此,需要选择合适的研究材料进行基础生理学和分子生物学的研究,确定植物抗盐碱的关键基因,了解植物的抗盐机理｡盐芥[Thellungiella halophila(C. A. Mey.) O. E. Schulz]是新型的耐盐模式植物,与拟南芥[Arabidopsis thaliana (L.) Heynh.]具有相似的生物学特征。

1.1材料盐芥野生型种子由山东师范大学樊守金老师惠赠｡试验所用的大肠杆菌(Escherichia coli)菌株DH10β､根癌农杆菌(Agrobacterium tumefaciens)菌株EHA105和GV3101､表达载体质粒PBI121和PCAMBIA3301等均由本实验室构建保存｡1.2方法1.2.1侵染用盐芥的准备将盐芥野生型种子放在湿润的滤纸上,4 ℃处理7 d以上,使发芽整齐｡按体积比6∶3将蛭石∶草炭混合好,装入600 mm×230 mm×60 mm的黑色育秧盘中,播种密度为每盘100~120株,放于培养室[1-4];待培养45~60 d时,将健壮的盐芥移到4℃低温环境里春化15 d;移出后继续在培养室里培养,保持温度在22~24 ℃､相对湿度为80%,光源为钠灯,光照时间为16 h/d｡当盐芥的主枝开始现蕾时打顶,以促进侧枝生长｡根癌农杆菌转化前1 d去掉已结实的种荚｡1.2.2盐芥的春化时间对盐芥开花的影响把生长60 d的健壮盐芥分别放于4~5 ℃的低温环境里,分别于大约20､30､40 d后移出,放于培养室里观察开花情况｡1.2.3转化用根癌农杆菌菌液的制备提取质粒,酶切验证,用电击的方法把质粒PBI121和PCAMBIA3301分别转化到根癌农杆菌EHA105和GV3101中[5,6],PCR 验证｡分别挑单菌落于LB液体培养基(组分为酵母提取物10 g/L､蛋白胨10 g/L､氯化钠5 g/L,pH值7.0)中,28℃下振荡培养2 d,加抗生素利福平(Rfp)､卡那霉素(Kan)至终浓度各为50 mg/L｡按1∶50的比例在新鲜的含抗生素的LB液体培养基中扩大培养至指数生长中期(菌液OD600≈1.5)｡2 800 g离心10 min,弃上清｡将沉淀重新悬浮于渗透培养基中,组成含5%蔗糖､MES 0.5 g/L､1 mg/mL的6-BA母液10 μL/L和0.05% SilwetL-77(表面活性剂)的1/2 MS液体培养基,分别调OD600≈0.8､1.5､2.0[7-10]进行比较,确定最佳的根癌农杆菌转化浓度,以备转化｡1.2.4Floral dip法转化盐芥将2组花蕾分别浸泡在含有不同质粒的根癌农杆菌菌液中1~2 min,拿出后用保鲜膜覆盖,保持相对湿度大于95%,黑暗下培养1 d,以利根癌农杆菌侵染转化[11-16]｡5 d后按上述方法重复转化1次｡根据情况确定侵染次数｡待种子成熟后分别收获､干燥｡1.2.5含有Kan抗性转化子的筛选将种子放于EP管中,开口晾干,除去果皮等杂质,只留种子｡待一个多月之后将收获的转化子用0.4%的NaClO+0.1%的Tween-20溶液涡旋洗涤10 min进行消毒,用无菌水洗8次以上后,用0.1%的琼脂重新悬浮种子,然后均匀种到固体筛选培养基(MS､3%蔗糖､0.6%琼脂､Kan 50 mg/L,pH值5.8)表面上,4℃春化7 d,放入恒温组织培养室内培养｡大约45 d之后将具有4叶的抗性苗移植到土里培养｡成熟后收获种子｡将表型有明显变化的转化植株拍照,并单株采收,其余的转化植株另外单株采收｡1.2.6含有除草剂(Basta)抗性转化子的筛选将种子放于EP管中,开口晾干,4℃处理7 d以使发芽整齐｡按体积比2∶1将蛭石∶草炭混合好,装入600 mm×230 mm×60 mm的黑色育秧盘中,播种密度为每盘5 000株,放于24℃培养室中｡待出芽后10 d 用除草剂Basta连续喷洒3 d,(固定时间喷洒),Basta用0.1% Tween-20稀释1 500倍喷洒｡7 d后阳性苗存活,非阳性苗死亡｡将表型有明显变化的转化植株拍照,并单株采收,其余的转化植株另外单株采收｡1.2.7盐芥抗性植株的PCR检测总DNA的提取按CTAB提取法进行[17-19],分别以Kan抗性植株和除草剂Basta抗性植株的总DNA为模板,分别扩增来自PBI121载体上的NPTⅡ基因和来自PCAMBIA3301载体上的Bar基因｡NPTⅡ基因的特异引物为Km-F(5′-GATCTGGATCGTTTCGCATG-3′),Km-R(5′-AAGGCGATAGAAGGCGATGC-3′);Bar基因的特异引物为Bar-F(5′-TCGACTCTAGCGAATTCCTC-3′),Bar-R(5′-ATAGGCGTCTCGCATATCTC-3′)｡PCR扩增程序均为94 ℃､2 min;94℃､30 s,60℃､30 s,72℃､1 min,循环34次;72℃､7 min｡以野生型盐芥的总DNA为阴性对照,分别以PBI121､PCAMBIA3301质粒为阳性对照｡2结果与分析2.1盐芥的春化时间对开花的影响在4℃条件下,春化了20 d的盐芥,移到温室能正常开花,但是需要大约20 d;春化了30 d的盐芥移到温室后7 d之内就可开花;春化40 d的盐芥移到温室后亦可7 d 之内开花;说明4 ℃春化30 d是最佳的盐芥春化方法,缩短了盐芥的生长周期｡2.2转化用根癌农杆菌浓度对转化效率的影响试验结果表明,菌液浓度与侵染盐芥的转化率在某一区间内(OD600值0.1~2.9)有线性关系存在,并呈正比关系｡菌液浓度越大,转化率越高(表1)｡2.3含有Kan抗性植株筛选结果试验结果(图1)表明,Kan浓度为60 mg/L的MS培养基使盐芥的种子萌发率(约60 %)较正常的种子萌发率低(约90 %),Kan浓度为40 mg/L的MS培养基要比Kan 浓度为50 mg/L的筛选出的苗多,大约多0.4倍｡根据结果分析,盐芥的抗性高,所以浓度为40 mg/L的Kan抑制不了野生型盐芥苗的生长,60 mg/L的Kan影响种子萌发率｡所以最佳Kan筛选浓度为50 mg/L｡2.4含有除草剂抗性植株筛选结果试验中发现,用稀释2 000倍的除草剂Basta喷洒亦能使盐芥死亡,但为了限制假阳性率的增高,同时也为了节省药品,试验选用稀释了1 500倍的Basta作为最佳筛选浓度｡含有Basta抗性植株的筛选结果见图2｡从图2可见,Basta喷洒7 d后非转化苗死亡,转化苗存活｡2.5盐芥T1代转化植株突变株系表型分析自2008年10月至2009年12月,按上述方法､分4批转化了野生型盐芥约为2万株,共得到约5 000个独立的T1代转化株系;在T1代植株中,共发现3个株系有明显的表型变化,约占转化植株总数的0.06%｡表型变化主要是直观可见的植株形态的改变,包括株型､株高以及叶形等,部分结果见图3｡目前对其进行遗传分析并对其中一些稳定遗传的重要突变体的功能基因正在分离研究之中,其余有关植株的育性突变体的筛选也在进行中｡2.6两种质粒的筛选比较一种质粒是利用含Kan的培养基来筛选;一种质粒是利用喷洒除草剂Basta来筛选,两者的区别最主要是后者简单方便､省时省力,省去了大量的种子消毒与配制培养基的工作量;其次是前者需要移苗到土里,避免不了导致阳性植株死亡的现象发生｡总之,除草剂的筛选适合大批量的侵染工作｡2.7盐芥抗性植株的PCR检测分别随机抽取若干株抗性苗,提取单株DNA,分别用PBI121上的NPTⅡ序列(长度约为800 bp)和PCAMBIA3301上的Bar序列(长度约为444 bp)做引物,以抗性植株的DNA做模板,进行PCR扩增,检测其NPTⅡ基因或Bar基因的存在情况,检测结果分别见图4､图5｡从图4､图5可见,所检测的抗性植株均含有NPTⅡ基因或Bar基因｡3讨论3.1建立高效的盐芥栽培技术和转化体系建立良好的盐芥转化体系对耐盐机理的研究尤为重要,良好的转化体系要求转化率高､周期短､操作简易,但盐芥培养周期长达5个月､而且抗性强､转化率低,较好的转化率也仅为0.1%｡本试验采用比较春化时间的方式摸索出了最佳的春化方法,也就是盐芥于4℃春化30 d,这为盐芥的培养周期缩短奠定了基础｡且对影响转化体系的因素做了细致的对比,构建了一种效率较高的盐芥转化体系,该体系转化用根癌农杆菌的浓度为OD600≈2.0､侵染时间2 min､保持湿度暗处理1 d;筛选用培养基Kan浓度50 mg/L､筛选时间45 d,筛选用除草剂Basta浓度为1 500倍､筛选时间为出芽后10 d(连续喷洒3 d)｡3.2关于盐芥筛选方法的探讨本试验采用的是两种质粒,其携带两种抗性基因,所以在盐芥筛选的时候,选用的是两种方法｡Kan抗性苗由于需要在选择性培养基中筛选,所以需要对盐芥的种子进行灭菌,然后根据其长势,当培养基的营养不够时,需要移皿,工作量很大;而且盐芥种子的萌发对培养基的要求高,萌发条件比较苛刻,并且刚收的种子还需要长时间的休眠才能在MS培养基中萌发,这些都增加了Kan抗性苗筛选的难度和工作量｡而用除草剂Basta方法筛选,免去了灭菌､移皿､萌发率低的限制,大大降低了筛选工作量和难度,且对转化效率无影响｡参考文献:[1] 刘守伟,刘士勇. 拟南芥室内培养技术研究[J]. 东北农业大学学报,2007,38(2):279-281.[2] 曹敏,邵凤霞,张章,等. 高pH值对盐芥种子萌发的影响[J]. 现代农业科技,2008(12):33.[3] 王瑜,曾幼玲,黄萍,等. 拟南芥在新疆干旱地区的室内栽种及遗传转化[J]. 生物技术,2008,18(3):69-71.[4] 赵听,吴雨霞,赵敏桂,等. 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