吉氏染液配制方法

疟原虫镜检技术操作规范疟原虫镜检是诊断疟疾、确定虫种及发现传染源的重要手段和方法，具有严格的操作程序和技术要求，为了统一方法、规范程序、提高血检质量，特制定本操作规范。

一、血片制作（一）所需器材载玻片玻片3张（1张作载玻片，1张作推片，1张作采血后滴于玻片备血用）采血针采用一次性采血针。

玻片盒存放50或100片玻片的木质或塑料盒。

皮肤消毒液、棉签或酒精棉球75%的酒精、安尔碘、碘伏等皮肤表面消毒剂。

记号笔用于玻片上书写血检病人基本信息。

（二）操作步骤1、载玻片基本信息登记取1张载玻片，首先用目测法将载玻片从右（磨砂处为右）到左等分成6格，接着用记号笔在第1、2格即（磨砂处）写下血检病人基本信息：编号、姓名、制片日期结果（镜检结束后补写）。

载玻片上信息应与血检登记表中的项目对应。

如图12、采血采血部位为手指末端或耳垂，婴儿可从拇趾或足跟取血。

用消毒剂消毒取血部位皮肤后，以一次性采血针迅速刺入取血部位1～2mm 深，约挤出1-2滴血，滴于玻片上（以备涂制厚薄血膜用）。

3、涂制血膜用推片的左下角刮取玻片上的血液4～5μl，涂于载玻片的第三格（靠近磨砂侧），由里向外一个方向旋转2～4圈，涂成直径为0.8～1.2cm的圆形厚血膜；再用该角沾取血液1～1.5μl血置于载玻片的中心点即（第四格前缘中点）；接着用干棉球或卫生纸擦净推片角上的血渍；最后用推片的下缘置载玻片的中心点（1～1.5μl血液处），当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两玻片保持25°～35°角，从右向左迅速推成舌状薄血膜，即（薄血膜涂在第4格前缘至第6格中部）。

如（图1）、（图2）疟原虫镜检涂制血膜方法示意图2薄血膜厚度应以红细胞之间互相接触而不相互重叠为佳，（直观透过玻片能清晰看到报纸上的字）；厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5～10个白细胞为宜。

二、固定（一）所需器材1、甲醇2、器具玻璃棒、吸管（二）操作步骤薄血膜固定薄血膜晾干后，用玻璃棒沾取或用吸管吸取少量甲醇平铺于薄血膜上，起固定薄血膜作用，（注意不能固定厚血膜）。

一、埃利希(EhrIiCh)氏苏木精染液先将苏木精2g溶于IOOm1乙醇中，再加冰醋酸IOm1,混合后加蒸储水IOOm1和IOOm1甘油，然后加硫酸铝钾(约Iog)至饱和，搅拌均匀，倒入瓶中。

将瓶口用1层纱布包着小块棉花塞上，放在暗处通风的地方，并经常摇动促进“成熟”，直到液体颜色变为深红色为止。

成熟时间约2-4周。

若加0.4g碘酸钠可加快成熟。

二、吉姆萨(GiemSa)氏母液将吉姆萨粉末Ig先溶于少量甘油，在研钵内研磨30min以上，至看不见颗粒为止，再将全部(66m1)剩余甘油倒入，于56℃温箱内保温2h。

然后再加入甲醇(66m1),搅匀后保存于棕色瓶中。

母液配制后放入冰箱可长期保存，一般刚配制的母液染色效果欠佳，保存时间越长越好。

临用时用PH6.8的磷酸盐缓冲液稀释10倍。

三、瑞(Wright)氏染液称取瑞氏染料粉末OJg于研钵内研细后，加入少量甲醇再反复研磨，最后将全部甲醇(总共60m1)加入研匀，染料全部溶解后，将染液保存于棕色瓶内备用。

四、醋酸洋红染液将洋红粉末Ig倒入IOOm145%醋酸溶液中，边煮边搅拌，煮沸(沸腾时间不超过30s),冷却后过滤，即可使用。

也可再加入1%~2%铁明矶水溶液5-10滴，至此液变为暗红色而不发生沉淀为止。

如制作永久标本染色时，可加入饱和氢氧化铁或醋酸铁(媒染剂)溶液数滴，至染色液呈浅蓝色为止。

五、硫堇染液(工作液)①干液(硫堇)：硫堇Ig或2g溶于Ioom150%乙醇中，溶解后过滤备用；②醋酸钠缓冲液：醋酸钠∙3H2O9.7g,巴比妥钠14.7g,溶于50Om1蒸储水中；③0.1mo1/1盐酸；按①：②：③=40：28：32比例配成混合液，调pH5.7±0.2,即得硫堇工作液。

六、0.02%盾纳斯绿B(JanusGreenB)用0.9%生理盐水溶液配制。

七、甲基绿一派洛宁染液(Unna试剂)派洛宁0.25g,甲基绿0.15g,95%乙醇20m1,甘油20m1。

附件一：“三热”病人的血检方法一、血涂片的制作用一次性采血针在耳垂或指端采血，婴儿可从拇趾或足跟采血。

取血在表面洁净、无刮痕的载玻片上涂制薄血膜和/或厚血膜。

用推片的左下角刮取血液4μl～5μl，再用该端中部刮取血液1.0μl～1.5μl。

将左下角的血滴涂于载玻片的中央偏左，由里向外划圈涂成直径0.8cm～1cm的圆形厚血膜。

厚血膜的厚度以一个油镜视野内可见到5个～10个白细胞为宜。

用干棉球抹净角上的血渍，然后将推片下缘平抵载玻片的中线，当血液在载玻片与推片之间向两侧扩展至约2cm宽时，使两张玻片保持250～350角，从右向左迅速向前推成舌状薄血膜。

二、染液的配制1、吉氏（Giemsa’s）染液配制吉氏粉5.0g、甲醇250ml、甘油50ml。

将吉氏粉臵于研钵中，加入少量甘油充分研磨，然后边加边磨，至甘油加完为止，倒入500ml有塞玻璃瓶中。

在研钵中加入少量甲醇，洗掉剩余部分，倒入瓶内，再次加甲醇，洗后再倒入瓶中，至甲醇洗清研钵中甘油为止。

塞紧瓶塞，充分摇匀，臵室温内，每天用力摇动溶液5min，3d后即可使用。

也可在带有紧口瓶塞的硬质玻璃瓶中放入约50个玻璃珠（直径3mm～5mm），用玻璃漏斗把甘油灌入瓶中，再把吉氏粉放入漏斗中，用甲醇缓慢地把所有染料粉冲入瓶内，塞紧瓶塞，臵于室温内，每天用力摇动5min，3d后即可使用。

2、瑞氏（Wright’s）染液瑞氏染剂粉1.0g、甲醇500ml、甘油15ml。

将瑞氏染剂粉臵于研钵内，加入甘油充分研磨后，倒入有塞玻璃瓶中，再用甲醇洗出研钵中的甘油溶液，倒入瓶中，摇匀后，臵室温下，每天摇动5min，3d后即可使用。

3、染色用水常用的染液稀释和冲洗用水是中性蒸馏水或经煮沸过滤的冷开水。

在没有蒸馏水时，也可用井水、河水、泉水或雨水。

稀释和冲洗用水的pH在7.2时，染色效果最佳。

因此，也可选用临时配制的PBS 缓冲液，以取得较好的染色效果。

4、PBS缓冲液的配制（0.01mol/L PBS pH7.2）：KH2PO4 0.38gNaHPO4 1.02g(或Na2HPO4〃12H2O 2.58g)NaCl 8.00g蒸馏水加至 1 000ml三、染色可用吉氏或瑞氏染色法染色。

疟原虫检验技术梁平县疾病预防控制中心何曦血涂片检查疟原虫是诊断和鉴定疟原虫种别的主要方法，也是疟疾流行病学调查的重要部分，血涂片制作和染色的好坏足心影响检查的结果，必须把握好“三关”，即制片、染色和镜检。

一、玻片清洁玻片清洁。

清洁的玻片无油脂，无划痕，无灰尘，玻片上有油迹，使厚血膜容易脱落，薄血膜涂布不均匀。

在用手指持玻片时，只能夹持玻片的两侧边缘，不要接触玻片的表面，以避免手指上的油污染污玻片。

1.新的载玻片先用热肥皂水洗涤，再用清水冲洗，然后用软而洁净的毛巾擦干待用。

2.使用过的载玻片的清洁方法有两种：①5%的肥皂水煮沸法：将洗衣肥皂削成小片，加水配成约5%的肥皂水，煮沸后将玻片一张一张地平放进肥皂水内，微火煮约一刻钟，然后灭火待肥皂水稍冷后，用清洁干毛巾擦净后待用。

②清洁液浸泡法：清洁液配制如下：重铬酸钾 80g浓硫酸 100ml水(清净水)1000ml配制时须先将重铬酸钾研细放入水中，慢慢加温到全部溶解为止，然后缓缓加入浓硫酸，待溶液冷却后倒入有盖的大口玻璃缸内。

清洁玻片时，将待洗的玻片逐张放入清洁中浸泡一两天后，取出清水冲洗至完全没有黄色为止。

浸泡前最好用二甲笨除去镜油，清洁液颜色变为墨绿色后即失去清洁作用，不能再用。

二、制片1.薄血膜涂制：(1)先用75%酒精棉球将耳垂消毒，待酒精干后用采血针迅速刺入耳垂近下端边缘处。

(2)用左手的拇指与食指以及右手的中指向相对的方向将耳垂轻轻挤压出血。

(3)取一张洁净的载玻片，将它的左1/3的表面接触耳垂上的血滴（不要将玻片接触耳垂上的皮肤），使一小滴血在玻片上。

血量1-1.5mm3 .1/4.火柴头大小。

(4)将推片臵于血溶之前与血液相接触，待血液沿推片边缘展开后，将推片与载玻片保持30角度，用力均匀迅速将推片由右向左推出而制成薄血膜。

涂制得较好的薄血膜只有一层血球，血球的分布排列比较均匀，血膜的末端突出如舌状。

若取的血滴太大，则涂制的血膜太宽太厚；若推时用力不均匀，则易成梯田状，若用力太大，则血膜两端过厚，若涂片上有油污，则血膜成多孔状。

ICS11.020C62WS 中华人民共和国卫生行业标准WS/T 569—2017疟原虫检测血涂片镜检法Microscopic examination of blood films for malaria parasites2017-08-01发布2018-02-01实施前言本标准按照GB/T 1.1—2009给出的规则起草。

本标准起草单位：海南省疾病预防控制中心、江苏省寄生虫病防治研究所、中国疾病预防控制中心寄生虫病预防控制所、云南省寄生虫病防治所、海南省农垦总局医院。

本标准主要起草人：王善青、高琪、汤林华、杨恒林、郑彬、胡锡敏、王光泽、李雨春、刘莹、欧阳范献。

疟原虫检测血涂片镜检法1 范围本标准规定了血涂片镜检法检测疟原虫的技术规范。

本标准适用于各级疾病预防控制机构和医疗机构对疟原虫的显微镜检测。

2 术语和定义下列术语和定义适用于本文件。

2.1疟原虫Plasmodium spp疟原虫是一类单细胞、寄生性的真核动物，是疟疾（malaria）的病原体。

寄生于人体的疟原虫主要有恶性疟原虫（Plasmodium falciparum）、间日疟原虫（Plasmodium vivax）、三日疟原虫（Plasmodium malariae）和卵形疟原虫（Plasmodium ovale）等。

2.2血涂片 blood films将血液涂制于载玻片上制成的涂片。

供显微镜疟原虫检查用的血涂片包括厚血膜涂片和薄血膜涂片两种。

3 仪器和器材3.1 生物显微镜（100×油浸物镜、5×或10×目镜）。

3.2 计数器。

3.3 载玻片（无划痕无油污的洁净载玻片）。

3.4 推片。

3.5 血片染色架。

3.6 血片干燥架。

3.7 玻片盒。

3.8 染色盘和染色缸。

4 试剂和材料4.1 吉氏染色原液。

4.2 pH7.2磷酸盐缓冲液（PBS）。

4.3 甲醇（分析纯）。

4.4 香柏油或专用浸油（折射率≥1.5）。