康为世纪 CW0506高纯96质粒提取试剂盒
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Version 11091092010
2010PurePlasmid 96Kit 高纯96质粒提取质粒提取试剂盒
试剂盒Cat Cat..N o.CW CW0506
0506保存：保存：Buffer Buffer P1P1（加入（加入RNaseA RNaseA））：2-8℃
其他组分：室温
组分说明
Cat.No.CW0506CW0506A Number of preps
4×961×96Buffer P1120ml 30ml Buffer P2120ml 30ml Buffer N3160ml 40ml Buffer PB
250ml 60ml Buffer PW（concentrate）
3×40ml 30ml Buffer EB 60ml 10ml RNaseA(10mg/ml) 1.2ml 300μl Filter 96Plate 4×961×96Bind 96Plate 4×961×96Collection Plate
16×964×96Tape Pad 205Protocol
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产品简介
本试剂盒应用膜吸附技术纯化高质量的质粒DNA。
可以最大限度去除蛋白及其它杂质，从而保证提取的质粒纯度更高。
96孔板可从小体积细菌培养液中提取质粒、粘粒、BACs 等。
优化流程，可通过手动或自动化操作。
提取质粒可应用于测序、限制性酶切、PCR 和转化等其它下游实验。
注意事项
1．Buffer P1使用前请先加入RNaseA（将试剂盒提供的RNaseA 全部加入），混匀，置于2-8℃保存。
2．第一次使用前应按照试剂瓶标签的说明在Buffer PW（concentrate）中加入无水乙醇。
3．使用前先检查Buffer P2和Buffer N3是否出现浑浊，如有浑浊现象，可置于37℃水浴中加热几分钟，即可恢复澄清。
4．提取质粒得率与细菌的培养浓度、质粒拷贝数等因素有关。
5．使用排枪时应注意不要打湿96孔板孔口，以防止离心过程中有液体溅出产生交叉污染。
6．所有离心步骤均为室温下进行。
操作步骤
1．向Collection Plate（96孔）每个孔中加入1.0-1.3ml摇好的菌液，加盖Tape Pad，3600rpm离心10分钟收集菌体，倒掉培养基，倒扣于吸水纸上除去残留的培养基。
注意：如果菌体浓度较低，可以重复集菌一次。
2．向每孔加入250μl Buffer P1（请先检查否已加入RNaseA），加盖Tape Pad，涡旋彻底悬浮菌体。
3．揭去Tape pad，向Collection Plate中每孔加入250μl Buffer P2，加盖新的Tape Pad，温和地上下翻转6-8次使菌体充分裂解，短暂离心使Tape Pad上的液体回落板中。
注意：温柔混匀以防有基因组DNA污染。
混匀后菌液应变得清亮粘稠，所用时间不应超过5分钟，以免质粒受到破坏。
4．揭去Tape Pad，向Collection Plate中每孔加入350μl Buffer N3，加盖新的Tape Pad，立即温和地上下翻转6-8次使其充分混匀。
注意：Buffer N3加入后要立即混合，避免产生局部沉淀。
5．将Filter96Plate和一个新的Collection Plate叠放在一起，取750μl上步得到的裂解液转入对应的Filter96Plate中（过滤板的承载量为750μl）,3600rpm离心5分钟。
6．将过滤液全部转入对应的Bind96Plate中（Bind96Plate叠放在收集废液的Collection Plate上），3600rpm离心5分钟，倒掉Collection Plate中废液，将Bind96Plate重新放在Collection Plate上。
7．（可选步骤）向Bind96Plate中每孔加入500μl BufferPB，3600rpm离心5分钟，倒掉Collection Plate中废液，将Bind96Plate重新放在Collection Plate上。
注意：如果宿主菌是endA+宿主菌（TG1，BL21，JM系列及其衍生物、HB101），这些宿主菌含有大量的核酸酶，易降解质粒DNA，强烈推荐采用此步。
如果宿主菌是endA-（DH5α、TOP10），此步骤可省略掉。
8．向Bind96Plate每孔中加入700μl Buffer PW（请先检查是否加入无水乙醇），3600rpm离心5分钟，倒掉Collection Plate中的废液。
9．重复步骤8。
10．将Bind96Plate叠放在Collection Plate上，置于3600rpm离心10分钟，目的是将Bind96Plate中残余的Buffer PW 去除。
注意：Buffer PW中乙醇的残留会影响后续的酶反应（酶切、PCR等）实验。
11．将Bind96Plate放入新的Collection Plate中，使用排枪向Bind96Plate吸附膜的中间部位悬空滴加80-100μl Buffer EB，室温放置5分钟，3600rpm离心10分钟将质粒溶液收集到收集板中。
12．加盖Tape Pad，-20℃保存备用。
注意：1）Buffer EB可在65-70℃水浴预热，可以增加质粒回收效率。
2）洗脱液的pH值对于洗脱效率有很大影响。
若用水做洗脱液，应保证其pH值在7.0-8.5（可以用NaOH将水的pH值调到此范围），pH 值低于7.0会降低洗脱效率。
洗脱缓冲液体积不应少于80μl，体积过小会影响回收效率。
通常100μl洗脱液平均洗脱得到55μl溶液。
