一、化学鉴别试验
鉴别是指用规定的试验方法来辨别药物的真伪，是药品质量控制的一个重要环节。
鉴别的方法有化学方法、物理化学方法和生物学方法等。
化学的方法有呈色反应、沉淀生成反应、荧光反应、气体生成反应/制备衍生物测定熔点等。
物理化学的方法主要是一些仪器分析方法，如紫外-可见分光光度法、红外分光光度法、色谱法等。
生物学的方法是利用微生物或实验动物进行鉴别，主要用于抗生素和生化药物的鉴别。
药物的鉴别试验，均为用来证实贮藏在有标签容器中的药物是否为其所标示的药物，而不是对未知物进行定性分析。
常见金属离子、酸根和官能团的鉴别收载在《中国药典》附录“一般鉴别试验”项下，如钠盐（Na +）、钾盐（K +）、钙盐（Ca 2+）、酒石酸盐、水杨酸盐、丙二酰脲类、芳香第一胺类的鉴别等。
药物专属的鉴别试验则收载在《中国药典》正文各品种质量标准的鉴别项下。
化学鉴别法具有简便、现象明显的特点，是药物鉴别的基本方法。
1、呈色反应鉴别法
系指供试品溶液中加入适当的试剂溶液，在一定条件下进行反应，生成易于观测的有色产物。
如酚羟基的三氯化铁呈色反应；芳香第一胺的重氮化-偶合反应等。
例如，水杨酸盐鉴别方法为：取供试品的稀溶液，加三氯化铁试液1滴，即显紫色。
反应原理是水杨酸含有游离酚羟基，可在中性或弱酸性(pH 值为4~6)条件下，与三氯化铁试液反应，生成紫堇色配位化合物。
反应方程式如下：
+FeCl 3O
OH
OH +Fe O O O OH H 2O
+3HCl
水杨酸 铁配合物
又如，芳香第一胺类鉴别方法反应，又称重氮化-偶合反应，用于鉴别芳香第一胺(即芳伯氨)。
具有芳伯氨基或潜在芳伯氨基药物（指可以转化为芳伯氨基），在盐酸介质中与亚硝酸钠作用，生成重氮盐，重氮化盐进一步与β-萘酚偶合，生成有色偶氮合物。
方法为：取供试品约50mg ，加稀盐酸1ml ，必要时缓缓煮沸使溶解，放冷，加0.1mol ／L 亚硝酸钠溶液数滴，滴加碱性β-萘酚试液数滴，生成橙色或猩红色的沉淀。
反应方程式如下：
NH 2R
NaNO 2 2HCl N +Cl -R 2NaCl H 2O 2++++N +Cl -R 2+OH +NaOH N R N
NaCl H 2O
++
2、沉淀生成反应鉴别法
系指供试品溶液中加入适当的试剂溶液，在一定条件下生成不同颜色的沉淀，有的沉淀具有特殊的形状。
如丙二酰脲类的硝酸银反应；氯化物的银盐沉淀反应。
例如，丙二酰脲类的硝酸银反应的原理是巴比妥类药物含有丙二酰脲结构，在碱性条件下，可与某些重金属离子反应，生成沉淀或有色物质。
这一特性可用于本类药物的鉴别。
方法为：取供试品约0.1g ，加碳酸钠试液1ml 与水10ml ，振摇2分钟，滤过，滤液中逐滴加入硝酸银试液，即生成白色沉淀，振摇，沉淀即溶解；继续滴加过量的硝酸银试液，沉淀不再溶解。
反应式如下：
巴比妥类药物的一银盐可溶于水，而二银盐不溶。
反应中第一次出现的白色沉淀是由于硝酸银局部过浓，产生少量巴比妥二银盐，振摇后，转换为可溶性的一银盐，继续滴加硝酸银至过量，则完全生成白色二银盐沉淀。
3、荧光反应鉴别法
在适当的溶剂中药物本身在可见光下发射荧光，如硫酸奎宁的稀硫酸溶液显蓝色荧光；药物与适当试剂反应后发射出荧光，如维生素B 1的硫色素反应等。
例如，维生素B 1硫色素反应的鉴别方法为：取供试品约5mg ，加氢氧化钠试液2.5ml 溶解后，加铁氰化钾试液0.5ml 与正丁醇5ml ，强力振摇2分钟，放置使分层，上面的醇层显强烈的蓝色荧光；加酸使成酸性，荧光即消失；再加碱使成碱性，荧光又显出。
原理是维生素B 1在碱性溶液中，可被铁氰化钾氧化生成硫色素。
硫色素溶解于正丁醇(或异丁醇等)中，显蓝色荧光。
反应方程式如下：
硫色素
4、气体生成反应鉴别法
大多数的胺类药物、酰脲类药物以及某些酰胺类药物可经强碱处理后加热产生氨（胺）气；化学结构中含硫的药物可经强酸处理后加热产生硫化氢气体；含碘有机药物经直火加热可生成紫色碘蒸气；含乙酸酯和乙酰胺类药物，经硫酸水解后，加乙醇可产生乙酸乙酯的香味。
二、鉴别试验的条件及方法验证
鉴别试验必须在适宜条件下完成，否则将会影响结果的判断。
影响鉴别反应的因素主要有被测物浓度，试剂的用量，溶液的温度、pH、反应时间和干扰物质等。
所以，在方法建立阶段，需要对这些条件进行系统考察，选择最适宜的反应条件。
1、溶液的浓度主要是指被鉴别药物的浓度，鉴别试验中的反应试剂一般是过量加入的。
适宜的药物浓度应该是能够产生明显的反应现象，高于反应发生的最低浓度，且不超过检测或反应的灵敏度范围。
2、溶液的温度温度对化学反应的影响很大，所以鉴别反应要选择适当的浓度。
一般温度每升高10℃，可使反应速度增加2～4倍。
但温度的升高也可使某些生成物分解，导致颜色变浅，甚至观察不到阳性结果。
3、溶液的酸碱度许多鉴别反应都需要在一定酸碱度的条件下才能进行。
为使反应获得明显现象，应对溶液的酸碱度进行选择，使反应物和生成物处于易于反应和稳定易于观测的状态。
4、试验时间化学反应需要一定的反应时间。
应该对不同的时间进行考察，选择适当的反应时间，需要是可加入催化剂。
三、鉴别实验的方法验证
方法鉴别的目的在于证明所采用的方法适用于目标药物鉴别的要求。
鉴别试验方法验证的内容包括专属性、灵敏度和耐用性。
1.专属性指其他成分（其他药物成分、杂质、降解产物、辅料等）存在的情况下，该鉴别方法能否正确地鉴别出目标药物的特性。
专属性试验要求证明能与可能共存的物质或结构相似化合物区分，需确证含被分析物的供试品呈正反应，而不含被测成分的阴性对照呈负反应，结构相似或组分中的有关化合物也应呈负反应。
2.耐用性指测定条件发生小的变动时，测定结果不受影响的程度。
方法的耐用性好，意味着该方法对测定条件的要求不苛刻，外界条件的一定变化，对测定结果的影响不大。
3.灵敏度指鉴别试验的最低检出浓度（量）。
最低检出浓度越低，说明鉴别试验灵敏度越高。
例如，复方吡啦西坦片剂中维生素B2鉴别方法建立
复方吡啦西坦片由吡啦西坦、脑蛋白水解物、谷氨酸、硫酸软骨素、维生素B1、维生素B2、维生素B6和维生素E等8种药物加适量辅料制成，处方中既有结构明确的化学药，又有成分复杂的生物制品药。
设计复方制剂维生素B2的鉴别试验时，参考ChP2010收载的维生素B2的鉴别试验方法（如下所示方法1）进行，并以维生素B2原料药为阳性对照，另取处方中其他药物和辅料作为阴性对照（空白试验），验证方法的专属性。
方法1：取本品10片，置研钵中，加水50ml，充分研磨，滤过，滤液作为供试液；另取维生素B2原料适量，加水溶解，作为对照液。
可见供试品与对照品溶液均显黄色荧光。
取对照液和供试液各约6 ml，分成三份，一份加稀硫酸溶液，一份加氢氧化钠试液，另一份加连二亚硫酸钠结晶少许，摇匀后观察现象。
结果可见，加连二亚硫酸钠，维生素B2对照液和供试液均黄色消褪，荧光消失；加氢氧化钠试液，两者均荧光消失；加稀硫酸溶液，维生素B2对照液黄色荧光消失，但供试品溶液出现蓝色荧光，表明片剂中其他成分在酸性条件下有荧光干扰。
故对处方中各个组分进行了逐一实验，结果脑蛋白水解物在酸性溶液中显蓝色荧光，而其他成分均无此现象。
可见，酸性条件下脑蛋白水解物对维生素B2鉴别产生干扰。
因此复方复方吡啦西坦片维生素B2鉴别方法为：取供试液，分成两份，一份加氢氧化钠试液，另一份加连二亚硫酸钠结晶少许，摇匀后，黄色荧光均消失。
