用益生菌制剂干预IBS的研究方案-王红岩
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益生菌制剂干预IBS的研究方案1.计划实验流程
实验材料：
动物模型：清洁级Wistar大鼠40只，要求体重均一（100±10g），喂养观察7天，每天上午添加食物和水，进食和饮水正常可进行实验。
益生菌制剂：
1.阿泰宁（酪酸梭菌活菌胶囊）
2.爽舒宝（凝结芽孢杆菌活菌片）
益生菌制剂以生理盐水溶解，10mg/2ml。
其他用具及药品：生理盐水、酒精、乙醚、酸性正丁醇、各种细菌培养基、正庚烷、盐酸、漩涡混旋器、烧杯、注射器、天平、烘箱、镊子、灌胃针、移液器、离心管、-20℃冰箱、水浴锅、荧光分光光度计
实验步骤：
1.购买大鼠45~50只，防止养殖过程中生病死亡等造成数量不足，5只一笼养殖于同样条件下。
每天记录饲养室温度、湿度、通风状况。
添加饲料和水按少量多次原则。
保持养殖室的卫生，每周消毒1-2次。
2.正常养殖观察7天，观察大鼠的吃料饮水量、活动程度、双目是否有神、尾巴颜色等选择健康大鼠40只作为实验材料。
3.选择10只大鼠作为空白对照为一组，30只大鼠（分三组）用冰生理盐水灌胃14天构建IBS模式大鼠。
4.观察诱导14天的大鼠的24小时粪便颗粒数，含水量明显下降，组织学无损伤，提示IBS模式大鼠成功。
5.大鼠分组处理：未诱导IBS的大鼠作为空白对照组1（10只），诱导IBS成功的分为3组（各10只），组2为模式对照组，正常培养；组3每天2ml益生菌制剂阿泰宁灌胃；组4每天2ml益生菌制剂爽舒宝灌胃。
每组的大鼠数量及性别构成相同。
在诱导及处理的期间内所有大鼠生活在同一环境下，饲喂标准相同。
6.每日观察大鼠的生存情况，观察饮食饮水、大便情况，毛发。
7.分别按上述分组制剂治疗14天，观察各组大鼠一般状况，测定第1天、第14天和第28天的大鼠的体重，24小时大便颗粒数、大便含水量、菌群改变及取血测定5-HT浓度。
固定每天的灌胃时间，大便颗粒数以每日灌胃后至下一天灌胃前的24h为准，腹泻时以一个污染印记为一颗。
大便含水率计算，灌胃前收集新
鲜大便称湿重，烘干后称干重，计算含水率。
8.菌群变化分析，取第一天灌胃前、第14天和第28天的粪便进行菌群变化分析。
9.测定血液中5-HT浓度。
10．数据分析SPSS分析多组数据，实验结果以 x ±s表示，多组间比较用方差分析。
通过对不同处理的大鼠在不同时间点的24小时粪便颗粒数，含水量及肠道菌群和血液中5-HT浓度变化分析益生菌制剂（酪酸梭菌、凝结芽孢杆菌）对IBS的治疗效果。
实验方法：
构建IBS模式大鼠方法（30只）：使用0-4℃冰的生理盐水灌胃14天，每天一次2ml。
具体操作：左手大拇指与食指提住大鼠后颈部皮毛使头部不能活动，掌心握住大鼠背部皮毛使身体在一条直线，固定好大鼠。
右手持灌胃针，沿大鼠嘴角进入，顺咽后壁划入咽部，轻轻用灌胃针使大鼠直立，进入食道，插入4-6cm，14天建立大鼠C-IBS模型。
菌群分析方法：用灭菌弯镊镊取老鼠粪便于无菌10ml离心管中，离心管重量己知，称取老鼠粪便重量，将老鼠粪便放入5ml灭菌生理盐水中，加入磁珠振荡混匀，以移液枪吸取100ul逐个稀释至含900ul生理盐水离心管中,将原液弃去，以第一个粪便稀释液离心管为10-1，稀释至10-6，将粪便稀释液各取10ul滴于各菌选择性固体培养基上。
将MRS-XGAL(选择性分离双歧杆菌)、KVLB(选择性分离拟杆菌)、TTC叠氮化钠(选择性分离肠球菌)、LAMV AB(选择性分离乳酸杆菌)、伊红美蓝(选择性分离大肠杆菌)、甘露醇高盐(选择性分离金葡菌)、BIM(选择性分离丁酸梭菌)，需氧或厌氧培养20-48h，分别计数每个培养基中菌落数，再换算为cfu/g粪便。
大鼠颈静脉采血法取血：以蘸满乙醚的无菌纱布两块放置在1000mL 的烧杯内，将大鼠放入烧杯后加盖 3 min。
将麻醉后的大鼠仰卧平放在解剖台上，操作者左手戴帆布手套固定大鼠头部，用酒精棉签消毒右颈部，消毒区沾染酒精后即可自动分开而显露穿刺区，不必剪毛，肉眼可见到颈动脉在胸锁乳突肌下缘区
搏动，在搏动外侧约1 mm 处作穿刺点; 操作者右手持 2.5 mL注射器，与胸骨成45°～60°进入皮肤后抽吸注射器成负压，再进针约 2 mm 即可见血液涌出。
可根据研究需要抽取相应血量，1 次可抽取2 ～2.5 mL，采血完毕后穿刺点轻
压3 s。
-20℃冻存血液。
5-HT浓度测定方法：取-20℃保存的大鼠血复融后, 各组分别取血0.5 ml，加入酸性正丁醇4.5 ml，在漩涡混旋器上漩涡抽提 5 min, 3000r/min离心10 min, 取上清液3.0 ml 加入正庚烷3.0 ml及0.1 mol/L盐酸溶液 1.0 ml, 漩涡抽提5min, 3000 r/min 离心5 min, 取下层水相测定5-HT含量, 并设空白管(B1), 按表3分别加入试剂后, 混合, 置100℃沸水浴中加热10 min, 冰水浴迅速冷却终止反应, 在90 min 内以激发波长( Ex) 350 nm, 发射波长477 nm测定管荧光强度( F), 按下式计算5-HT 含量。
血清5-HT含量( nmol/L) = [ F(T) - F (B1)] /[F(S)- F(B2) ]×5/3×112×2×567.5。
