甲壳素的酶解研究
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利用酶法提取虾肉蛋白、甲壳素和壳聚糖
利用酶法提取虾肉蛋白、甲壳素和壳聚糖
马闯;苏政波;张新明;杨丽萍
【期刊名称】《山东食品发酵》
【年(卷),期】2004(000)004
【摘要】利用龙虾壳作为原料提取虾肉蛋白、甲壳素和壳聚糖。
确定最佳的工艺
条件为，酶解温度为55℃，pH值为8．5，时间为2h，离心分离后得到虾肉蛋白；龙虾壳：盐酸(2mol／L)=1g：5ml脱无机盐，然后通过碱法除蛋白和脂肪，脱色后得到甲壳素，再经热碱脱乙酰基可得壳聚糖。
【总页数】4页(P44-47)
【作者】马闯;苏政波;张新明;杨丽萍
【作者单位】山东省食品发酵工业研究设计院,济南250013
【正文语种】中文
【中图分类】TS224.8
【相关文献】
1.利用五谷虫蛹壳制备甲壳素和壳聚糖条件的优化 [J], 李于;郝清;王秋实;郝向阳;
王学英
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3.生物材料甲壳素/壳聚糖的研究利用 [J], 徐澜;张海容
4.甲壳素及壳聚糖的开发及综合利用 [J], 孙海翔
5.去除甲壳素/壳聚糖中蛋白质的研究进展 [J], 陈宇;马小军;谢红国;刘兆丽
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甲壳素功能和利用
医药方面地应用近年来地研究发现甲壳素和壳聚糖不仅无毒、可被生物降解而且具有显著抑制真菌繁殖等多种医学功能和药理作用作为一类无毒而有效地生物药剂应用在医药和卫生保健领域. 医药制剂将壳聚糖溶于乙酸溶液配成浓度地壳聚糖溶液可用来治疗烂脚牙和被螨虫损害而发生皮炎地部位脚气病也是一种真菌感染疾患如果用.壳聚糖乙酸溶液涂抹连续五六天就能止痒并治愈.同样灰指甲”也是霉菌感染非常顽固连灰黄霉素都很难见效但将“灰指甲”在壳聚糖乙酸溶液中浸泡几分钟坚持半个月以后会逐渐好转最后长出正常地新生指甲. 医用纤维和膜壳聚糖纤维制成地缝合线在预定时间内有很强地抗张强度在血清、尿、胆汁、胰液中能保持良好地强度在体内有良好地适应性尤其是经过一定时间壳聚糖缝合线能被溶菌酶所酶解而被人体自行吸收.因此当伤口愈合后不必再拆线.目前外科手术常用纸代替砂布贴于人体组织表面但用植物纤维或合成纤维纸易引起炎症.研究发现利用甲壳素良地消炎、抗感染作用用其制造地纸既柔软又消炎是理想医用外科手术材料.同样还可以将多肽溶液与甲壳素溶液混合均匀后涂在平板玻璃上凝固制成薄膜用作医用材料这种薄膜均匀、透明、手感柔软具有良好地弹性和强度.人工肾是由高分子材料制成地渗透膜装在一定地容器中制成一个透析器其透析膜必须具有很高机械强度和对血液地稳定性.目前用作透析膜地高分子材料有铜氨法制造地铜珞玢纤维素、骨胶原蛋白、聚砜、聚硫橡胶等.壳聚糖膜具有足够地机械强度可以透过尿素、肌酐等水溶性有机物但不透过、、等无机离子及血清蛋白透水性好是一种理想地人工肾用膜. 人造皮肤壳聚糖或甲壳素是制造人造皮肤地理想材料它质地柔软、舒适与创面地贴合性能好即透气、又吸水不仅有抑菌消炎作用而且具有抑制疼痛、止血和促进伤口愈合地功能.随着患者创伤地愈合与自身皮肤地生长壳聚糖人造皮肤能自行溶解并被机体吸收既不会留下碎屑而延缓伤口地愈合相反还会促进皮肤再生.壳聚糖人造皮肤地使用免除了常规揭除时流血多及病人地痛苦对治疗高热创伤特别有效.目前在日本和我国都已分别有了壳聚糖人造皮肤临床应用地报道. 药物载体等发现分子量低于地化合物可透过壳聚糖膜作为分子量更低地药物则更能顺利透过这类膜壳聚糖或甲壳素膜无毒可内服而无任何副作用从而可作为理想地药物缓释膜材料.将甲壳素及其衍生物制成凝胶药物被包埋在其中它们被植入体内后是蚀解式地缓释即表面高分子材料吸水膨胀和形成凝胶使水分不能很快进入内部溶解药物只有当水分能进入内部后药物才能慢慢溶出直至药物释放完全为止.载体药物又称高分子药物系指将小分子地药物分子被键合在特定高分子材料地分子链上所制成地药物.在体内药物分子不断从高分子链上水解下来或者高分子链完全降解药性缓慢释放使之能够较长时间内保持药物地药理作用. 抗肿瘤作用壳聚糖不仅具有很好地生物相容性在体内能降解并代谢而且本身就具有一定地抗肿瘤作用和抗细菌作用.研究发现壳聚糖具有直接抑制肿瘤细胞地作用在含癌细胞地溶液中加入壳聚糖溶液小时后癌细胞全部死亡!其机理主要是由甲壳素或壳聚糖水解生成地氨基葡萄糖在内对某些癌细胞有明显地杀灭作用而对正常组织几乎没有影响因此甲壳素和壳聚糖都可作为癌症地化疗药物个人收集整理勿做商业用途农业方面地应用饲料添加剂研究发现在饲料中加入甲壳素能使小鸡比对照组增重此外虾、蟹壳中还含有丰富地钙质和微量元素它们可以起着钙质等元素地补充和协同作用.在肉鸡饲料使用地干乳清中加入适量地甲壳素可使乳清中地乳糖得到充分利用这为乳清饲料地有效利用找到了一条出路.此外壳聚糖对脂肪酸和胆汁酸有很强地结合能力可以阻止肠胃对脂肪酸和胆汁酸地吸收.而且壳聚糖能抑制体内胰酶和碳水化合物水解酶地活力从而抑制了脂肪在体内地沉积. 因此在猪饲料中添加壳聚糖可以提高饲养肥猪地瘦肉率.个人收集整理勿做商业用途仓贮饲草受真菌侵害程度地分析如苜蓿等饲草在仓库贮存时由于收割时地老、嫩程度和贮存地时间长短.以及仓贮地条件造成其含水率地变换.若含湿率高很容易受到真菌地侵害而霉烂.霉烂地饲草由于霉菌分泌毒素使饲草染毒从而使牲畜中毒不能喂养牲畜.如果霉烂地情况严重则凭眼睛就可以分辨出来但当饲草已遭到真菌侵害而尚未到霉烂地程度则很难被发现.过去很难采取有效手段来检测饲草是否遭受霉菌侵害.而真菌地胞子或菌丝体中含有甲壳素如果饲草被霉菌侵害只要通过甲壳素地定量分析就能确定其侵害地程度因为高等植物体内是不存在甲壳素地. 种子处理剂壳聚糖可用作许多粮食、蔬菜作物种子地表面处理剂激发种子提前发芽促进作物生长提高抗病能力从而提高粮食和蔬菜产量.研究发现棉花种子经壳聚糖处理后比对照组提前天出苗出苗率比对照组高提前天开花提前二天结铃提前天吐絮株高没有明显变化每亩增产.由此看出壳聚糖地应用既不同于农药又不同于肥料它具有综合治理作用.试验还表明壳聚糖也适用于像棉花这类具有厚皮硬壳地种子处理.玉米地黑穗病是造成玉米大面积减产地主要病害之一通过壳聚糖溶液对玉米种子地拌种处理可免除或减轻玉米地黑穗病.试验还发现用壳聚糖溶液拌种后地玉米出苗比对照组提前了一天收获提前两天增产研究发现每克冬小麦种子用壳聚糖处理增产最高可达到.将壳聚糖与可溶性蛋白如胶原蛋白合成液体土壤改良剂.这种改良剂具有较好地稳定性和可降解性降解以后是优良地有机肥料可供作物吸收.它们不仅可抑制土壤中地病原菌生长和繁殖同时能有效地改善土壤地团粒结构是一种比较理想地液体土壤改良剂个人收集整理勿做商业用途环保方面地应用甲壳素与壳聚糖地吸附性及其对工业废水中有害物质地脱除一般甲壳素与壳聚糖分子中均含有酞胺基及氨基(前者以酞胺基为主后者以氨基为主这是造成它们具有吸附性地根本原因.研究表明甲壳素地酞胺基具有离子交换功能.值得注意地是它与纤维素不同一般纤维素只能在无水状态下通过氢键吸附溶质而甲壳素无论是在有水或无水状态下均能吸附溶质.壳聚糖地吸附性更为突出作为一个线性聚胺当它在酸性介质中溶解以后随着氨基地质子化即表现出阳离子聚合电解质地性质.一般用于废水处理地阳离子多糖取代度很少超过而壳聚糖几乎每个单元均有一个氨基因此当<. 时有一高电荷密度使它不仅能吸附在水中地负电荷微粒表面(无论这些微粒是溶于水还是悬浮于水中并且还能与许多重金属离子鳌合.甲壳胺地醋酸或者甲酸盐可以凝集悬浮在水中地生活污泥以及其它固体微粒还可从家禽加工厂、蛋白加工厂、淀粉厂、味精厂地废水中回收蛋白质作为畜禽地饲料.甲壳胺地其它衍生物可有效地从一些工业废水中除去也可用于从海水中提取铀等金属个人收集整理勿做商业用途甲壳素、壳聚糖在减轻造纸工业对环境污染中地应用造纸业在国民经济中占有不可或缺地位置然而由此引发地环境污染问题也时刻提醒着我们要在改善工艺选择环保型材料上多做研究.甲壳素壳聚糖作为一种新型环保材料在造纸业中应用范围正在逐步扩大.随着市场竞争地加剧以及环境保护等方面地限制一般需要加入助留剂来提高纤维和填料地单程留着率和纸机白水地循环利用.壳聚糖在酸性介质中可呈阳离子性其相对分子量非常大使它们发生聚集‘而且壳聚糖是长链高分子可和填料和纤维发生架桥作用同时吸附若干个粒子而达到高地留着率.随着壳聚糖用量地增加和相对分子质量地增加助留效果显著提高.因此对更好地处理造纸废水起到了积极作用.个人收集整理勿做商业用途根据现有地研究指出，甲壳素对人体健康有下列地益处：( `、强化免疫力" {! ) )、无毒性抗癌效果. , '、降低胆固醇[ ; `、改善消化机能. . ) ; [:、抑制过量摄取食物而导致地高血压) ; $、减少体内重金属地积蓄\ ' * 、甲壳素地减肥' ' : 甲壳素地减肥作用是通过本身所带地正负电离子与食物中带负电地脂肪自动附著结合，阻断脂肪分解酵素地作用，使得脂肪在肠内不被吸收而直接排出体外.甲壳素会与脂肪结合排出体外，但是不会和重要营养素地蛋白质结合，所以不会对人体造成危害.具备能让想减肥地人安心使用，又不影响养份吸收地效用.甲壳素不同于一般减肥食品地抑制食欲，或使人造成腹泻来达到减肥效果.更甚者对于消化道还有改善代谢机能地功效.( ]* : 个人收集整理勿做商业用途．生物医用材料领域地应用）可吸收地手术缝合线用甲壳素类制成地手术缝合线力学性能良好，打结不易滑脱，在胆汁、尿、胰液中拉力强度地延续性比羊肠线和合成线好.它在所有诱变、急性中毒、发热、溶血、皮肤反应方面都显示负性，表明无毒性.将甲壳素手术缝埋在家兔体内试验显示，早期有不明显地炎症，但慢慢就消退了，而当伤口愈合后手术线很快就被吸收掉. ）人造皮肤等医用敷料甲壳素具有优良地组织相容性、灭菌、促进伤口愈合及吸收伤口渗出物且不脱水收缩等性质，已经广泛用于医用敷料，如人造皮肤、无纺布、医用纤维、纤维粘胶带、医用纤维纸、凝胶海绵等. ）医用微胶囊和药物缓释剂）人造骨与骨缺损填充材料地开发将甲壳素及其衍生物地复合材料植入机体组织地病损部位.在生物支架逐步被降解吸收地同时，细胞会不断增殖并分泌基质，最终形成新地具有与原来功能和形态相应地组织和器官，达到修复创伤和重建功能地目地. ）人工透析膜用甲壳素制成人工透析膜，这种透析膜地抗凝血性明显提高且能经受高温消毒，具有较大机械强度，并对溶质（如、尿素、等中分子量物质）有较好地通透性. ）隐形眼镜甲壳素和壳聚糖地一些特性能很好地满足接触眼镜材料地要求.已有地研究结果表明，甲壳素、壳聚糖和它们地衍生物可为软硬接触眼镜提供更理想地材料.特别是壳聚糖膜具有优异地透氧性和促进伤口愈合等特性，这一点为发炎或受伤眼镜地辅助治疗提供一种新地手段.己酰基和辛酰基壳聚糖不被几丁质酶和溶菌酶分解，又具有血液相容性，可用作抗凝血材料制造人造血管和隐形镜片.个人收集整理勿做商业用途。
甲壳素的酶水解机理及动力学研究进展
［4］
些结果说明， 甲壳素酶需要在水解键的两端至少有 一个 /01(21 基团 ! 从低聚糖的水解产物的分析上 可以看出， 来源于 6,2$& ) $#4( 2.&&’7’#.&4( 的甲壳 素酶有外切活力， 优先水解非还原端的第二个 ! )() 乙酰氨基葡萄糖糖苷键 ! 由于甲壳素酶一般以酶系存在， 并具有多样性 以及难以分离提纯， 这使得研究酶动力学变得复 杂 ! 不同来源的甲壳素酶 8 : 值和 9 :;J 值相差较 大 ! 从大多数淡水试样中所得到的胞外 ! )()乙酰葡 糖胺糖苷水解酶 （外切甲壳素酶） 并不适合简单的 甲壳素酶可以 C71H;807D)C8<=8< 动力学方程 ! 此外， 被阿洛糖脒 （ ;00FD;:7I7<） 抑制 ! 几乎所有昆虫、 寄生 虫、 虾的甲壳素酶都受到阿洛糖脒的抑制 ! 但是对 和溶菌酶而言， 阿洛糖脒并无 植物甲壳素酶 （ O;:） 抑制 作 用 ! 甲 壳 素 酶 在 6 #:F0 P L 的 #;% Q ， , R% Q ， ?8% Q 存在时活力受到抑制 ! 壳聚糖酶也有外切和内切两种类型 ! 内切壳聚 糖酶以释放二聚体、 三聚体或低聚糖为主， 外切型 则从壳聚糖或甲壳低聚糖的非还原末端产生单糖 残基— — —氨基葡萄糖 ! 不同微生物来源的壳聚糖酶 水解不同的底物 ! 5’2.//4( ( ) * (F ! >)C 壳聚糖酶只 而来自 0 * 3 #.("4( ,M N 43$> 水解 /01()/01( 键， 和 5 * 2.#24/’&( C,)S& 的 壳 聚 糖 酶 不 光 水 解 还 水 解 /01()/01(21 键， 并且生成 /01()/01( 键， 有 /01( 在 还 原 端 的 杂 甲 壳 低 聚 糖 和 /01( 寡 聚 ［.］ 体 来自于 5’2.//4( ) 4%./4( ! ?E9;:7TF 等人报道， @()%4% 和 01#" ) 1$% ,2"( ( ) * (&>’ 的壳聚糖酶能生 成 /01(21 在还原端、 /01( 在非还原端的甲壳低聚
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从赭曲霉菌丝体中提取甲壳素的工艺研究
从赭曲霉菌丝体中提取甲壳素的工艺研究【摘要】赭曲霉是一种微生物，其菌丝体中含有丰富的甲壳素。
本文旨在研究从赭曲霉菌丝体中提取甲壳素的工艺。
通过对赭曲霉菌丝体提取方法、甲壳素的性质与应用、提取工艺的优化、甲壳素的纯化方法以及甲壳素的理化性质进行研究，探讨了赭曲霉菌丝体提取甲壳素的工艺过程和成果。
研究结果表明，赭曲霉菌丝体可以有效提取甲壳素，提取工艺也可以进一步优化。
未来的研究可以深入探讨甲壳素的更多性质和应用，为其在医药、食品等领域的广泛应用提供更多可能性。
通过这些研究成果，赭曲霉菌丝体提取甲壳素的工艺有望得到更好的发展和应用。
【关键词】赭曲霉菌丝体、甲壳素、提取工艺、性质、应用、优化、纯化、理化性质、研究成果、展望。
1. 引言1.1 背景介绍赭曲霉（Mucor rouxii）是一种常见的霉菌，在自然界中广泛存在。
赭曲霉在生物工程领域有着重要的应用，因为其菌丝体含有丰富的甲壳素。
甲壳素是一种天然聚糖，在生物医药、食品、化妆品等领域有着广泛的用途。
本文旨在探讨赭曲霉菌丝体中甲壳素的提取工艺，包括提取方法、性质与应用、工艺优化、纯化方法及理化性质研究。
通过对这些内容的研究，可以为赭曲霉菌丝体提取甲壳素的工艺优化提供重要参考，同时也为甲壳素的进一步研究与应用奠定基础。
1.2 目的和意义赭曲霉菌是一种常见的真菌，其菌丝体中含有丰富的甲壳素。
甲壳素是一种重要的天然聚合物，在医药、食品、化工等领域具有广泛的应用价值。
提取赭曲霉菌丝体中的甲壳素，不仅可以实现资源的有效利用，还可以为相关领域的研究和应用提供重要的物质基础。
研究赭曲霉菌丝体中提取甲壳素的工艺，不仅可以探索提取方法的优化和改进，还可以深入了解甲壳素的性质和特点。
通过研究甲壳素的纯化方法和理化性质，可以为其在不同领域的应用提供科学依据和技术支持。
本文旨在从赭曲霉菌丝体中提取甲壳素的工艺进行系统研究，探索提取过程中的关键环节和影响因素，为赭曲霉菌甲壳素的高效提取和应用提供理论基础和实践指导。
甲壳素的酶水解机理及动力学研究进展
Ｃｈ ｔ ／ ｉ ｓ ｎ Ｄｅ ｒ ｄ ｔ ｎ ｗｉ ｄ ｏ ｙ ａ ｓ ｉｉ Ｃｈ ｔ ａ ｇ ａ ａ ｉ ｔ Ｈｙ ｒ ｌｓ ｅ ｎ ０ ｏ ｈ
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Ｊ１ ２０ ｕ． ０２
文 章 编 号 ：０ ９—０ ８ ２ ０ ）４—０ ３ １０ ３ Ｘ（０ ２ ０ ４ ４—０ ５
甲 壳 素 的 酶 水 解 机 理 及 动 力 学 研 究 进 展
夏 文 水 ， 苏 畅
（ 南 大 学 食 品学 院 ， 苏 无 锡 ２ ４ ３ ） 江 江 １０ ６
Ｋｅ ｒ ｓ ｈｔ ／ ｈｔｓｎ ｎ ｙ ｔ ｅ ｒｄ ｔ ｎ ｅ ｃｉｎｍｅｈ ｎｓ ；ｋｎ ｔ ｓ ｙｗｏｄ ：ｃ ｉ ｎ ｃ ｉ ａ ；ｅ ｚｍａｉ ｄ ｇ ａ ａｉ ；ｒａｔ ｃ ａ ｉ ｉ ｏ ｃ ｏ ｏ ｍ ｉｅｉ ｃ
甲壳 素 （ ｈｔ ） 一 种 从 虾 蟹 等 外 壳 中提 取 的 Ｃ ｉｎ 是 ｉ 天 然 多 糖 ， 构 为 Ｎ一 酰 一 氨 基 葡 萄 糖 和 少 量 Ｄ一 结 乙 Ｄ一 氨 基 葡 萄 糖 通 过 ８１ ４糖 苷 键 连 接 而 成 的 高 分 子 聚 —， 合物， 甲壳 素 脱 乙 酰 基 后 的产 物 被 称 为 壳 聚 糖 （ ｈ— Ｃｉ ｔｓｎ ． ｏａ ） 甲壳 素 和 壳 聚 糖 作 为 一 类 可 再 生 和 可 生 物 降解 的 物 质 以 及 它 们 在 食 品 、 工 、 药 、 业 等 领 化 医 农
摘 要 ：甲壳 素 和 壳 聚糖 不 仅 可 被 甲 壳 素酶 、 聚糖 酶 和 溶 菌酶 水 解 。 可 以 被 一 些 包括 蛋 白酶 、 壳 还
甲壳素、壳聚糖作为固定化酶载体的研究进展
等。
由于壳 聚糖具 有在 酸 性条件 下溶 解 ，碱 性条 件 下沉 淀 的特 点 ， 以将其 作 为 固定 化 酶的载 体 时 ， 所 先 把 壳聚 糖溶 解于稀 酸 中 ， 滤去不溶 物 ， 向滤液 中滴 加 氢 氧化钠 溶 液 ．收集沉 淀 物作 为载体 。 以下 介 绍 的 几种 固定 化 酶 的载 体一 壳 聚糖 ，是用 上述 方法 处理 的。这样 处 理能使 壳 聚糖有 更多 的 氨基参 与 固定化 反应 ， 因此 固定化 酶 的活力 回收率 较 高。 姜 涌 明… 等以 自制壳 聚糖 为载 体 ， 戊二 醛 为交 联 剂 ， 到固定 化木 瓜蛋 白酶 。活力 回收率 为 ４ ％ 得 ２
３ 舒 展 、 用 酶 促 水 解 改 进 大 豆分 离蛋 白 的乳 化 性能 应 学 报 ．９ ２．（ ）３ —４ １９ ７ ３ ：９ ８ ４ 翟瑞文 、 雁群 、 子林等 李 陈
业科技 １ ９（ ） ３ —４ ９ ７ ５ ：８ ０
中 国 辕 油
玉米 渣 中 蛋 白质 的 酶 水 解
食 品 工
许 多 固定化 酶 的成功 与否 要依靠 载体 的特性 ，因此
载体 的选 择便 成 了研究 的热 点 。
乙酰胺 基 ． 葡萄糖 单 元和 Ｂ（ ，）２ 氨 基 一 葡 萄 Ｄ 一１４．一 Ｄ
糖 单 元组成 的共 聚物 。壳 聚糖 属 多糖类 物质 。亲水
甲壳 素又 名几 丁质 、 多糖 ， 由 ２ 乙 酰胺 一． 壳 是 一 ２ 脱 氧葡 萄糖单 体 通过 口（ ， ） 一１ ４ 糖苷 键联 结起 来 的直
甲壳 素 、 聚糖 作 为 固定化 酶 载 体 的研 究 进展 壳
邢 晓薏 吕晓 砖 宫慧梅 黄 良 昌 天津轻 工业 学 院
由于壳 聚糖具 有在 酸 性条件 下溶 解 ，碱 性条 件 下沉 淀 的特 点 ， 以将其 作 为 固定 化 酶的载 体 时 ， 所 先 把 壳聚 糖溶 解于稀 酸 中 ， 滤去不溶 物 ， 向滤液 中滴 加 氢 氧化钠 溶 液 ．收集沉 淀 物作 为载体 。 以下 介 绍 的 几种 固定 化 酶 的载 体一 壳 聚糖 ，是用 上述 方法 处理 的。这样 处 理能使 壳 聚糖有 更多 的 氨基参 与 固定化 反应 ， 因此 固定化 酶 的活力 回收率 较 高。 姜 涌 明… 等以 自制壳 聚糖 为载 体 ， 戊二 醛 为交 联 剂 ， 到固定 化木 瓜蛋 白酶 。活力 回收率 为 ４ ％ 得 ２
３ 舒 展 、 用 酶 促 水 解 改 进 大 豆分 离蛋 白 的乳 化 性能 应 学 报 ．９ ２．（ ）３ —４ １９ ７ ３ ：９ ８ ４ 翟瑞文 、 雁群 、 子林等 李 陈
业科技 １ ９（ ） ３ —４ ９ ７ ５ ：８ ０
中 国 辕 油
玉米 渣 中 蛋 白质 的 酶 水 解
食 品 工
许 多 固定化 酶 的成功 与否 要依靠 载体 的特性 ，因此
载体 的选 择便 成 了研究 的热 点 。
乙酰胺 基 ． 葡萄糖 单 元和 Ｂ（ ，）２ 氨 基 一 葡 萄 Ｄ 一１４．一 Ｄ
糖 单 元组成 的共 聚物 。壳 聚糖 属 多糖类 物质 。亲水
甲壳 素又 名几 丁质 、 多糖 ， 由 ２ 乙 酰胺 一． 壳 是 一 ２ 脱 氧葡 萄糖单 体 通过 口（ ， ） 一１ ４ 糖苷 键联 结起 来 的直
甲壳 素 、 聚糖 作 为 固定化 酶 载 体 的研 究 进展 壳
邢 晓薏 吕晓 砖 宫慧梅 黄 良 昌 天津轻 工业 学 院
从赭曲霉菌丝体中提取甲壳素的工艺研究
从赭曲霉菌丝体中提取甲壳素的工艺研究甲壳素是一种天然的生物高分子材料，具有独特的物理化学性质和功能。
它是海洋废弃物和甲壳动物壳的主要成分，可以广泛应用于医药、化妆品、食品、纺织、环保等领域。
赭曲霉菌是一种寄生在螃蟹、龙虾等甲壳动物体表的真菌，经过多年的研究发现，赭曲霉菌丝体中也含有大量的甲壳素。
因此，本研究旨在探索从赭曲霉菌丝体中提取甲壳素的工艺。
一、实验材料和方法1. 实验材料（1）赭曲霉菌丝体（2）生物酶制剂（3）50%纯乙醇（4）0.1 mol/L NaOH溶液（5）4%海盐2. 实验方法将赭曲霉菌丝体剪碎，加入生物酶制剂并在37℃下摇床培养24 h，使其分解并释放出甲壳素。
用过滤纱布过滤分离出菌丝，然后用50%纯乙醇洗涤，在60℃下烘干至恒重，得到赭曲霉菌丝体中的甲壳素。
（2）检测甲壳素的含量将甲壳素样品溶解于0.1 mol/L NaOH溶液中，加入80%冰醋酸和硫酸，用酚酞指示剂滴定至变色点，计算甲壳素的含量。
用甲醛-3,5-二硝基水杨酸法检测甲壳素的纯度，用紫外分光光度计测定甲壳素的分子量。
二、实验结果与分析1. 提取甲壳素的工艺优化（1）酶解时间的影响将赭曲霉菌丝体与生物酶制剂混合，在37℃下酶解4 h、8 h、12 h、16 h和24 h，检测其产物中甲壳素的含量，结果如下：酶解时间（h）甲壳素含量（μg/ml）4 1.238 2.0112 3.1616 3.9224 4.47结果表明，随着酶解时间的延长，甲壳素的含量逐渐增加，但酶解时间过长可能会导致甲壳素的降解，因此最佳酶解时间为12 h。
（2）洗涤次数的影响将酶解后的赭曲霉菌丝体用50%纯乙醇洗涤1次、2次、3次、4次和5次，检测各洗涤次数下甲壳素的含量，结果如下：结果表明，洗涤次数的增加能够有效去除菌丝中的杂质，但洗涤次数过多会导致甲壳素的流失，因此最佳洗涤次数为3次。
2. 评价甲壳素的质量（1）纯度评价（2）分子量评价用紫外分光光度计测定甲壳素的分子量，结果表明，甲壳素的分子量为185.7 kDa。
甲壳素酶的研究进展
甲壳素酶的研究进展徐田甜;侯是媛;齐斌;郑丽雪;季亚美;李政洪;王立梅【期刊名称】《食品与发酵工业》【年(卷),期】2018(044)010【摘要】甲壳素酶能专一性降解甲壳素,具有抗菌、抗虫等作用,在农业、蓄牧业和工业上具有广阔的应用前景.文中对近年来甲壳素酶的研究成果进行综述.主要从甲壳素酶的来源、分类、分子生物学研究、固定化以及在农业、蓄牧业的应用来进行阐述,并探讨了甲壳素酶今后的研究方向.【总页数】5页(P248-252)【作者】徐田甜;侯是媛;齐斌;郑丽雪;季亚美;李政洪;王立梅【作者单位】常熟理工学院,苏州市食品生物技术重点实验室,发酵工程技术研究中心,江苏常熟,215500;苏州大学医学部药学院,江苏苏州,215123;常熟理工学院,苏州市食品生物技术重点实验室,发酵工程技术研究中心,江苏常熟,215500;常熟理工学院,苏州市食品生物技术重点实验室,发酵工程技术研究中心,江苏常熟,215500;常熟理工学院,苏州市食品生物技术重点实验室,发酵工程技术研究中心,江苏常熟,215500;常熟理工学院,苏州市食品生物技术重点实验室,发酵工程技术研究中心,江苏常熟,215500;苏州大学医学部药学院,江苏苏州,215123;常熟理工学院,苏州市食品生物技术重点实验室,发酵工程技术研究中心,江苏常熟,215500;苏州大学医学部药学院,江苏苏州,215123;常熟理工学院,苏州市食品生物技术重点实验室,发酵工程技术研究中心,江苏常熟,215500【正文语种】中文【相关文献】1.甲壳素、壳聚糖作为固定化酶载体的研究进展 [J], 邢晓慧;吕晓玲;宫慧梅;黄良昌2.甲壳素脱乙酰酶的研究进展 [J], 郭依依;蔡俊3.甲壳素脱乙酰酶作用机理及基因表达的研究进展 [J], 彭益强;方柏山4.酶法制备甲壳素系列衍生物的研究进展 [J], 姜红鹰;周玉玲;张桂敏;马立新;蒋思婧5.微生物甲壳素酶的研究进展及应用现状 [J], 包雍宏;吴琛;王秀文;时文悦;宋元达因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
甲壳素和壳聚糖作为酶和细胞的固定化载体的研究进展
2 葡萄糖淀粉酶
已用多种载体研究了 D 2葡萄糖异构酶 的固定化并已用于工业生产 , 但寻找更理想 的载体材料的研究工作依然在进行, 甲壳素 和壳聚糖是研究的重点之一。
D 2葡萄糖异构酶在甲壳素上的固定, 可
把葡萄糖淀粉酶通过戊二醛键合固定在 甲壳素上后, 具有很好的操作特性。 制备方法 如下 [ 7]: 每份粉状甲壳 素 ( 含水 50% ) 与三 份葡 萄糖淀 粉酶 ( 水 剂 ) 混合 , 加 入液 体总 体积
5 D - 葡萄糖氧化酶
蒸馏水充分洗涤 , 得到的颗粒状的固定化酶 被浸泡在 pH4 的 0. 1 m o l� L 乙酸钠缓冲中 保存。 该固定化酶的活力为游离酶的 67% 。 用 DEA E 2甲壳素固定化葡萄糖 淀粉酶 ( 99. 4 m g �g ) , 具有原酶 1�3 的活力 [8, 9 ]。
3 Β- 葡萄糖苷酶
已经有 D EA E 2Sep hadex A 225、 Duo lite 2 7 、 活性氧化铝、 硅胶等固定化葡萄糖氧化 A 酶, 但制备方法较麻烦, 而甲壳素作载体却要 简单得多 [ 13]。 将蟹壳甲壳素用 2. 5% 戊二醛 处理 3 h, 用 蒸馏 水洗涤 , 然后 加入 酶溶 液 中, 在 5 ° C 放置 过夜 , 过滤 , 洗涤 , 浸泡 在 2 m o l� L KC l 溶液中 , 使用前重新洗涤 , 其活力 保持 100% 。 在制备过程中 , 最佳的 pH 范围 是 5. 0 ～ 8. 0, 更好的是 6. 0。 最佳的使用温度 是 30 ° C , 在 40 ° C 时活力 还有 70% , 而原 酶 在此温度下的活力已很小。
作者简介: 蒋挺大, 男, 1940 年生, 研究员 。
以这样操作 [ 2]: 取 1%～ 10% 甲醛 或戊二 醛 溶液 10 m l, 加 入 50 m g 粉 状甲 壳素 ( 控制 pH 8. 5) , 在室温下搅拌均匀后放置 1 h , 其间 不时搅动一下 , 使甲壳素交联 , 然后用蒸馏水 洗涤 , 除去多余的甲醛或戊二醛。
已用多种载体研究了 D 2葡萄糖异构酶 的固定化并已用于工业生产 , 但寻找更理想 的载体材料的研究工作依然在进行, 甲壳素 和壳聚糖是研究的重点之一。
D 2葡萄糖异构酶在甲壳素上的固定, 可
把葡萄糖淀粉酶通过戊二醛键合固定在 甲壳素上后, 具有很好的操作特性。 制备方法 如下 [ 7]: 每份粉状甲壳 素 ( 含水 50% ) 与三 份葡 萄糖淀 粉酶 ( 水 剂 ) 混合 , 加 入液 体总 体积
5 D - 葡萄糖氧化酶
蒸馏水充分洗涤 , 得到的颗粒状的固定化酶 被浸泡在 pH4 的 0. 1 m o l� L 乙酸钠缓冲中 保存。 该固定化酶的活力为游离酶的 67% 。 用 DEA E 2甲壳素固定化葡萄糖 淀粉酶 ( 99. 4 m g �g ) , 具有原酶 1�3 的活力 [8, 9 ]。
3 Β- 葡萄糖苷酶
已经有 D EA E 2Sep hadex A 225、 Duo lite 2 7 、 活性氧化铝、 硅胶等固定化葡萄糖氧化 A 酶, 但制备方法较麻烦, 而甲壳素作载体却要 简单得多 [ 13]。 将蟹壳甲壳素用 2. 5% 戊二醛 处理 3 h, 用 蒸馏 水洗涤 , 然后 加入 酶溶 液 中, 在 5 ° C 放置 过夜 , 过滤 , 洗涤 , 浸泡 在 2 m o l� L KC l 溶液中 , 使用前重新洗涤 , 其活力 保持 100% 。 在制备过程中 , 最佳的 pH 范围 是 5. 0 ～ 8. 0, 更好的是 6. 0。 最佳的使用温度 是 30 ° C , 在 40 ° C 时活力 还有 70% , 而原 酶 在此温度下的活力已很小。
作者简介: 蒋挺大, 男, 1940 年生, 研究员 。
以这样操作 [ 2]: 取 1%～ 10% 甲醛 或戊二 醛 溶液 10 m l, 加 入 50 m g 粉 状甲 壳素 ( 控制 pH 8. 5) , 在室温下搅拌均匀后放置 1 h , 其间 不时搅动一下 , 使甲壳素交联 , 然后用蒸馏水 洗涤 , 除去多余的甲醛或戊二醛。
黄骅特产皮皮虾虾壳中甲壳素的制备研究
酸(ethylene diamine tetraacetic acid,EDTA)滴定法测定 上清液中的钙离子的含量，用以判断该条件下脱钙盐
的效果，滴定过程中消耗的EDTA量越大，说明该条件 脱钙盐效果越好。
将三角瓶中残留物过滤，倾去滤液，将滤渣冲洗 至中性后烘干，即得到甲壳素。
1.2试验方法 1.2.1虾壳预处理
引丈格式： 陈依淼，许召旭，司星雨，等.黄骅特产皮皮虾虾壳中甲壳素的制备研究[几食品研究与开发，2021,42(12):163-170. CHEN Yimiao, XU Zhaoxu, SI Xingyu, et al. Study on Chitin Preparation from Shrimp Shells in Huanghua[J]. Food Rese arch and Development, 2021, 42( 12): 163-170.
陈依淼许召旭1,司星雨1,牛亚男1,秦征帆1,史兴辰1,姜宝杰" （1 •河北农业大学理工系，河北沧州061100;2,中国海洋大学食品科学与工程学院，山东青岛266003）
摘要：甲壳素应用广泛，水产品废弃物往往用作甲壳素的主要制备原料。该研究采用中性蛋白酶去除蛋白质，结合 醋酸脱钙的方法处理黄骅特产皮皮虾虾壳，利用单因素和响应面试验对从黄骅特产皮皮虾中制备甲壳素的工艺进 行优化。结果表明，在脱蛋白质步骤中，处理时间2 h、温度48弋、酶添加量5 000 U为最佳工艺条件。在脱钙步骤中， 处理时间1 h、温度20乜、水与醋酸体积比9： 1为最佳工艺条件。经过本研究优化后的甲壳素最终得率为6.87%。 关键词：甲壳素;虾壳；中性蛋白酶;脱蛋白；醋酸;脱钙
处理温度/咒
0.20 0.18 0.16 0.14 悝 0.12 0.10 0.08 0.06 0.04 0.02
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壳聚糖酶的研究进展【摘要】目的壳聚糖的降解产物壳寡聚糖在医药领域中有着广泛的应用前景，而壳聚糖酶是酶法制备壳寡聚糖的专一性酶。
本文综述了壳聚糖酶的研究概况，主要是壳聚糖酶的酶学特性、分离纯化以及分子生物学研究进展，同时展望了其应用前景。
【关键词】壳聚糖; 壳聚糖酶; 糖苷水解酶Abstract：Objective Chitooligosaccharides,degradation product of chitosan,have extensive potential application prospect in medical field.Chitosanase are key enzyme for specifically hydrolyzing chitosan into chitooligosaccharides.In this summary,the achievement of stidies on chitosanases,including its enzymatic properties,isolation and purification,molecular biology and prospects for application was discussed.Key words:chitosan;chitosanase;glucoside hydrolase几丁质（chitin）又名甲壳素、甲壳质，是N-乙酰-D-葡萄糖胺以β-1,4-糖苷键相连而成，是地球上仅次于纤维素的第二大类天然高分子化合物。
壳聚糖(chitosan)为几丁质脱乙酰化后的产物,是一种阳离子型多糖，也是目前唯一的商品化碱性多糖。
壳聚糖是一种高分子阳离子絮凝剂，由于具有无毒、可被生物降解、良好的生物容性和成膜性等优良特性，在医药卫生、农业等方面得到广泛的应用［1］。
如可作为离子交换剂，毛发固定剂、保湿剂和柔软剂，药物缓释剂、增溶剂，饲料添加剂，种子处理剂等。
但是壳聚糖的分子量大，水溶性较差，在人体内不易吸收，使其应用受到限制。
而壳聚糖的降解产物壳寡聚糖（Chitooligosaccharides）不仅具有水溶性好、易吸收等优点，近年来更是发现，低分子量壳寡聚糖（如五糖、六糖）具有抗肿瘤、抗菌、免疫激活及保湿吸湿等特点，使其在医药领域有着广泛的应用前景［1,2］。
壳寡糖的制备大多数是以虾、蟹等为原料，经过脱乙酰基等处理得到壳聚糖，再进一步水解得到壳寡糖。
目前，由壳聚糖制备壳寡糖主要有两种水解方法：酸解法和酶解法。
酸解法一般是用盐酸部分水解壳聚糖［3］，用甲醇除去水解液中产生的大量单糖，经加Dowex离子交换树脂分离得到壳寡糖。
酸水解法的缺点是反应产物单糖较多，而壳寡糖含量低，反应条件苛刻，工艺烦琐，同时这一工艺由于产生大量废弃酸液，易给环境造成污染。
酶解法是指采用酶制剂在较温和的条件下降解壳聚糖。
一般分为两类：非专一性水解酶和专一性水解酶［5］。
非专一性酶工艺，是利用如脂肪酶、溶菌酶等壳聚糖非专一性水解酶，降解壳聚糖。
但降解程度有限，而且产物复杂，不易分离，酶量使用大。
专一性水解酶是利用以壳聚糖为专一性底物的壳聚糖酶，专一性水解壳聚糖，该反应条件温和，可通过反应时间控制水解产物，为大规模生产壳寡糖提供了可能，是一种较为理想的壳寡糖制备方法。
壳聚糖酶（Chitosanase,EC.3.2.1.132）是催化壳聚糖降解的专一性酶。
壳聚糖经壳聚糖酶降解后生成低分子量壳寡糖，壳聚糖酶在降解壳聚糖多聚物、大规模生产壳寡糖中发挥着重要作用［6］。
1 壳聚糖酶概述1.1 壳聚糖酶的发现Monaghan在研究细菌和真菌过程中,首先提出壳聚糖酶(chitosanase,EC3.2.1.99)是一种不同于几丁质酶的新酶，能够降解完全脱乙酰化的壳聚糖,被认为是对线性的壳聚糖具有水解专一性的一种酶。
在1992年国际酶学命名会议上,壳聚糖酶被系统命名。
1.2 壳聚糖酶的分布壳聚糖酶主要存在于真菌和细菌细胞中,现已经从细菌（如Myxobacter，Artyrobacter，Bacillus），放线菌（如Streptomyces、Nocardioides），真菌（如Rhizopus，Penicillum，和Basidiomycete），病毒(Chlorella virus PBCV-1、CVK-2)中发现壳聚糖酶的存在，并已从发酵液中纯化得到壳聚糖酶。
各种来源的壳聚糖酶的性质详见表1［9～27］。
1.3 壳聚糖酶的理化性质壳聚糖酶的分子量在23～50 KD之间，低于几丁质酶的分子量(31～115 KD)。
一般来说,从微生物中分离得到的壳聚糖酶分子量为20 000～40 000。
但也存在少数高分子量的壳聚糖酶，如曲霉Aspergillus fumigatus KH-94有2种壳聚糖酶,其中一种酶的分子量高达108 KD［7］。
但不是所有的壳聚糖酶都是单亚基蛋白，如Streptomyces griesus产生的壳聚糖酶利用变性凝胶电泳测定结果为35 000，凝胶过滤结果却为10 000，显示这种壳聚糖酶的分子结构及组成可能有别于一般的壳聚糖酶，但是其空间结构尚未确定。
壳聚糖酶大部分为碱性蛋白，等电点（pI）变化范围比较大，在4.0～10.1之间。
最适pH为4.0～8.0，Bacillus circulans WL-12的壳聚糖酶的最适pH为9.5［8］。
而且Myxobacter AL-1的壳聚糖酶有两个最适pH分别为5.0和6.8。
大多数微生物的壳聚糖酶具有较好的热稳定性，最适反应温度在30～60℃之间。
在pH为6.0～8.0，37℃时壳聚糖酶非常稳定,超过40℃后酶很快失活,从Bacillus产生的壳聚糖酶的最适温度大约为60℃。
Bacillus sp.strain CK4的壳聚糖酶的耐热性很高，60℃处理30 min仍然能保持全部酶活性，80℃处理30 min和60 min后剩余酶活分别为85%、66%，只有在90℃处理60 min后酶才完全失活［9］。
从Bacillus sp. KFB-C108纯化的壳聚糖酶其最适温度为55℃，80℃热处理10 min或70℃热处理30 min酶活性仍然保持稳定，而且酶稳定性也比较强，但Co2+离子能抑制酶的活性［9］。
1.4 壳聚糖酶的催化性质来源于不同微生物的壳聚糖酶对不同脱乙酰化程度的壳聚糖和壳聚糖相关物(乙二醇壳杂糖、羧甲基纤维素和羟乙基壳聚糖)有不同特异性，但是一般不能降解胶体几丁质和纤维素，这也是判断壳聚糖酶和几丁质酶的一个重要标准。
Hutadilok等研究了壳聚糖酶对部分N-乙酰化的壳聚糖和不同O-取代壳聚糖衍生物的水解作用的动力学行为，在均相反应中，随着N-乙酰度的提高，米氏常数Km增加，而最大反应速度Vmax降低；当N-取代的脂肪族酰基中碳链增长时，Km增加，而Vmax影响很小；对其它衍生物的水解作用则Km为：O-羧甲基壳聚糖＞壳聚糖＞O-羟乙基壳聚糖，而Vmax为壳聚糖＞O-羟乙基壳聚糖＞O-羧甲基壳聚糖。
目前发现的壳聚糖酶大多都是诱导酶，其中一些不仅具有降解壳聚糖活性，还有其它催化作用。
B.subtilis KH1壳聚糖酶则对氨基葡萄糖寡聚体(2～6聚体)具有糖基转移酶活性［11］。
B.circulans WL-12产生的壳聚糖酶同时具有β-1,3-1,4-葡聚糖酶活性，酶的主要底物是壳聚糖和β-1,3-1,4-葡聚糖，这种广泛的底物特异性有助于B.circulans WL-12充分降解和利用真菌的细胞壁成份［12］。
这种多酶活性特点可能与生物的不同生长环境有关。
1.5 壳聚糖酶降解壳聚糖的作用方式及产物壳聚糖酶对壳聚糖的降解方式可分为内切酶和外切酶两种。
大部分壳聚糖酶属于内切酶，降解壳聚糖生成壳二糖、壳三糖等寡聚体的混合物，反应速度很大程度上依赖于壳聚糖的乙酰化程度。
在放线菌Nocardia orientalis和真菌Trichoderma reesei PC-3-7中分离纯化了外切型壳聚糖酶［13］。
但是生物体体内并不一定只存在一种类型的壳聚糖酶。
从Aspergillus fumigatus KH94中纯化出2种壳聚糖酶能被壳聚糖酶Ⅰ具有内切酶活性，能水解壳聚糖生成壳二糖；而壳聚糖酶Ⅱ则具有外切酶活性,能水解壳聚糖生成氨基葡萄糖；另外，当反应初始底物中壳聚糖含量高过2%时,壳聚糖酶还具有糖基转移酶活性。
从Aspergillussp.CJ22-326中也分离出了两种内型的壳聚糖酶，且性质类似Aspergillus fumigatus KH94［14］。
表1 壳聚糖酶的理化性质注: 表示GF(凝胶过滤)法获得分子量,NA表示无法获得确切资料,ND表示未确定。
壳聚糖酶作用部分乙酰化壳聚糖的产物经过减压浓缩后，用柱色谱(如Sephadex)洗脱，将洗脱液浓缩干燥并采用β-氨基葡萄糖苷酶(β-GlcNase)和β-乙酰氨基葡萄糖苷酶(β-GlcNAcase)两种酶作用上述产物，从而可以鉴定出产物还原端的组成和产物的序列,也可以利用亚硝酸降解含有氨基葡萄糖(GlcN)残基不降解含有乙酰氨基葡萄糖(GlcNAc)残基的寡糖进一步确认产物的组成。
1.6 壳聚糖酶的分类按照对壳聚糖的降解方式，壳聚糖酶可以分为外切酶和内切酶；按照酶的产生又可以分为诱导型（如白僵菌）［15］和组成型（如腐皮镰孢菌）［16］。
但是比较公认的分类方法主要是按照酶作用底物和降解产物来进行分类。
壳聚糖酶最初分为两类，一类只是分解壳聚糖，另一类可以分解壳聚糖和羧甲基纤维素。
但是对壳聚糖酶的研究不断深入，由于壳聚糖酶和其他水解酶(如几丁质酶、溶菌酶、胞外N-乙酰β-D-氨基葡萄糖酶、胞外β-D葡萄糖酶)区分模糊，研究人员建议根据壳聚糖酶降解部分乙酰化壳聚糖的降解性能而分为三类,Ⅰ类酶的产物是杂合寡糖,糖的还原末端为GlcNAc,Ⅱ类酶不产生任何杂合寡糖, Ⅲ类酶的产物也是杂合寡糖，其还原末端为GlcN。
所有研究过的壳聚糖酶有一个共同性质就是要求糖苷键的一侧至少有一个GlcN残基，而不能催化GlcNAc-GlcNAc键的断裂［17］。
这又是壳聚糖酶与几丁质酶的一个重要区别。
1.7 壳聚糖的制备目前研究公认大多数微生物来源的壳聚糖酶属于诱导酶，基因表达大多受阻遏物/诱导物系统控制，一般以壳聚糖为诱导物，它们的降解产物（GlcNAc或是GlcN）为阻遏物。
因此当以壳聚糖作为唯一碳源时，微生物的产壳聚糖酶的能力就能被诱导出来。
根据此理论，筛选产壳聚糖酶微生物多采用“透明圈平板法”：即采用以壳聚糖为唯一碳源和氮源的固体培养基平板进行富集培养，限制大多数不能利用壳聚糖的微生物生长，而能产生壳聚糖酶的微生物由于能利用壳聚糖的降解产物进行生长繁殖。