半定量RT_PCR法评定鸡小肠肽转运载体cPepT1基因的表达

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半定量RT—PCR法在检测基因表达水平中的应用

收稿日期：０７０ —８２０ —１２基金项目：国家自然科学基金项目（０７９２３５０２）
作者简介：王
要：定量逆转录多聚酶链式反应（Ｔ—Ｃ半ＲＰＲ法）是近年来常用的一种快速、简捷、异的Ｒ特ＮＡ检测方法，也是探
讨基因转录水平的有效手段．该文就半定量ＲＰＲ法的检测步骤及技术的关键因素（Ｔ—Ｃ总ＲＮ提取、Ａ引物设计、环循数的确定和内参的选择等）进行综述．关键词：半定量ＲＴＰＲ； — Ｃ检测；基因表达中图分类号：１Ｑ８３文献标识码：Ａ文章编号：０４４２（０７０ —０９０１０ —３９２０）１０４ —４
Ｖ０＿４Ｎｏ１ｌ２，．
Ｍａｒ２．００７
半定量ＲＴＰＲ法在检测基因表达水平中的应用 —Ｃ
王荣，红菊李
（．阳师范学院生物系，１阜安徽阜阳２６４；．３０１２北京师范大学生命科学学院北京
摘
１０７）０８５
以保证总ＲＮＡ纯度及程，光实时定量ＰＲ仪的问世，定量技术达到好选用知名品牌公司的试剂，荧Ｃ使
了一个新的高度，现了ＰＲ从定性到定量的飞提取的产量Ｉ实Ｃ另外所用的组织量最少应在１０ｍｇ细０、跃，是，但由于荧光实时定量ＰＲ仪价格昂贵，制胞数最少应在１７Ｃ限０．．了该仪器在研究中的推广使用．事实上，在许多研究１２总ＲＮＡ的纯度和完整性鉴定总ＲＡ提取之后，Ｎ必须用紫外分光光度计测定过程中只需评估样品之间某种基因表达水平的相对Ａ２０Ａ２０在１８－２０之间方可采．．．￣差异，定量ＲＰＲ技术完全可以满足上述目的其纯度和浓度，６／８半Ｔ— Ｃ的要求． ¨ 与经典的检测基因的表达方法如Ｎｏｔｅｎ印ｒｈｒ迹、ＮＡ酶保护分析等相比，定量ＲＴ—ＣＲ半ＰＲ法以其灵敏度高（比杂交法高１００－０００倍）专一性０￣１０、用Ｉ然后再用１５左右的琼脂糖凝胶对总ＲＮＡ进．行电泳，鉴定其完整性，度不高，整性不好的以浓完标本最好不用，以免影响后面的实验结果．１３ｃＮＡ第一链的合成．Ｄ

半定量RT-PCR检测胶质瘤细胞分化相关新基因的表达

半定量RT-PCR检测胶质瘤细胞分化相关新基因的表达孙继勇;黄强;董军;王爱东;兰青【期刊名称】《中国神经肿瘤杂志》【年(卷),期】2003(0)1【摘要】背景与目的:利用基因芯片和生物信息学手段从大量的基因中筛选肿瘤发生发展过程中重要的调控基因,是目前功能基因组研究的一个重要研究方向.但是小样本量的检测有时会出现一些假阳性和假阴性结果,因此很有必要抽取部分样本的基因进行验证.本文利用半定量RT-PCR检测了从胶质瘤恶性进展和诱导分化两个基因表达谱中利用生物芯片和生物信息学技术筛选出来的7条基因在胶质瘤组织中的表达情况,目的在于,一方面验证以前的基因芯片数据的可靠性;另一方面通过对基因表达水平的半定量,进行横向的对比,希望能够找出这些基因在不同级别胶质瘤中的表达规律,为进一步的功能研究提供依据.方法:按照7条基因的Gen-Bank登录号,检索GenBank得到这些基因的全长cDNA序列,然后设计相应的PCR引物,针对22例恶性胶质瘤病人的肿瘤组织作检测,22例胶质瘤按照WHO分级其中I 级3例,Ⅱ级8例,Ⅲ级7例,Ⅳ级4例,最后利用SmartView电泳图像分析软件对各个基因在不同组织中的表达进行半定量.结果:这些基因在这些肿瘤中的表达差异是有规律性的,和以前的基因芯片结果基本一致.如X54304(肌球蛋白轻链)、AI264216(胆碱转运因子2)都是随着恶性程度的进展而表达升高,而NM-019896(DNA多聚酶p12亚基)、NM-015962(CGI-35蛋白)、AB037886(NESH 蛋白)、D38305(Tob蛋白)、M87507(半胱天冬酶1,Caspasel)都是随着恶性程度的进展而表达降低.结论:我们对于基因芯片和生物信息学技术筛选到的7条基因作半定量RT-PCR分析,证实我们使用的基因芯片是可靠的;同时显示这些基因在胶质瘤的恶性进展过程中都发生了规律性的改变,信息学检索提示其中有些基因可能是肿瘤恶变的重要调控因子.【总页数】5页(P12-16)【作者】孙继勇;黄强;董军;王爱东;兰青【作者单位】苏州大学附属第二医院神经外科暨脑肿瘤研究室,江苏,苏州,215004;苏州大学附属第二医院神经外科暨脑肿瘤研究室,江苏,苏州,215004;苏州大学附属第二医院神经外科暨脑肿瘤研究室,江苏,苏州,215004;苏州大学附属第二医院神经外科暨脑肿瘤研究室,江苏,苏州,215004;苏州大学附属第二医院神经外科暨脑肿瘤研究室,江苏,苏州,215004【正文语种】中文【中图分类】R739.41【相关文献】1.半定量RT-PCR检测口腔鳞状细胞癌死亡相关蛋白激酶的表达 [J], 李春艳;高文信;张茹慧;王林;赵静辉;李艳秋2.用原位RT-PCR技术检测大肠癌组织中相关新基因SNC66的表达 [J], 吴翰桂;郑树3.实时RT-PCR与半定量RT-PCR检测胃腺癌中ING4表达的比较研究 [J], 刘丹;李明;傅松滨4.半定量RT-PCR方法检测肝癌相关cDNA克隆的表达 [J], 温传俊;赵新泰;万大方;顾健人5.半定量RT-PCR检测肺癌组织S100C的表达及其原核表达载体的构建和鉴定[J], 赵向锋;张慧珍;金蕾;杨继要;刘桂芝;陈景涛;吴逸明因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

荧光定量RT-PCR检测鸡CD4、CD8基因表达水平

荧光定量RT-PCR检测鸡CD4、CD8基因表达水平岳华;黄兴;杨发龙;李明义;范根成;马莉;汤承【期刊名称】《畜牧兽医学报》【年(卷),期】2008(039)006【摘要】白细胞分化抗原CD4和CD8在机体免疫应答及其信号传递过程中发挥着重要作用.本试验建立了定量检测鸡CD4和CD8 mRNA表达水平的SYBR Green Ⅰ实时荧光定量RT-PCR(RRT-PCR)方法,并采用该方法对26～50日龄商品鸡外周血淋巴细胞(PBL)中CD4和CD8 mRNA表达水平进行了检测.结果显示:所建立的RRT-PCR对CD4和CD8 mRNA的扩增效率分别为93%和91%;线性范围分别在10-4～10-9和10-3～10-9;相关系数分别为0.998 0和0.999 9;最低分别能检测105和120拷贝;熔解曲线分别在78.2和86.7℃附近出现1个单特异峰;组内变异系数分别在1.13%～2.15%和1.17%～3.68%,组间变异系数分别在1.16%～3.25%和1.66%～2.86%.26～50日龄鸡PBL CD4和CD8的mRNA表达水平有小幅波动,与采用流式细胞术检测结果的报道一致.本试验建立的RRT-PCR 方法敏感性高、稳定性和再现性好,为检测鸡CD4、CD8基因表达水平提供了精确定量的新方法.【总页数】7页(P784-790)【作者】岳华;黄兴;杨发龙;李明义;范根成;马莉;汤承【作者单位】西南民族大学生命科学与技术学院,成都,610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都,610041;成都农业科技职业学院,成都,611130;西南民族大学生命科学与技术学院,成都,610041;中国动物卫生与流行病学中心,青岛,266032;中国动物卫生与流行病学中心,青岛,266032;西南民族大学生命科学与技术学院,成都,610041;西南民族大学生命科学与技术学院,成都,610041【正文语种】中文【中图分类】S852.4【相关文献】1.荧光定量RT-PCR测定人颗粒溶素基因表达水平 [J], 钱琤;陈孙孝;周晔;陈波;蒋廷旺;吴传勇;邓安梅;仲人前2.二重荧光定量RT-PCR检测胰腺癌患者CD44v6基因的表达 [J], 周刚;邱大卫;秦大江;牛立志;蔡金蕾;何丽华;黄文浩;徐克成3.荧光定量RT-PCR检测胃癌患者外周血中CD44v6基因微小转移 [J], 王道荣;汤东;石磊;诸林海;谢萍;陈国玉;刘训良;苗毅;夏建国4.实时荧光定量RT-PCR检测宫颈癌组织中HIC1基因表达的应用研究 [J], 谭毅菁;招钜泉;吴校连5.骨髓间充质干细胞Hey1基因表达水平荧光定量RT-PCR方法的建立 [J], 刘强;翁亚光;唐敏;罗敏因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。

半定量RT_PCR在基因表达方面的应用

为了客观地比较不同样本中目的基因表达量的多少，消除由于反转录时总ＲＮＡ浓度差异造成的误差，要选择合适的内标基因。其中最常用的ＧＡＰＤＨ， β－ａｃｔｉｎ，１８ＳｒＲＮＡ。我们可以根据实际情况的不同，选择不同的内标基因作参照。３．３同管扩增或异管扩增的选择
同管扩增是内标基因和目的基因在同一个管内进行扩增。异管扩增是
按说明书提取组织总ＲＮＡ，提取的组织总ＲＮＡ用３０ μＬ的ＤＥＰＣ水溶解即得总ＲＮＡ提取液。对所提的总ＲＮＡ必须用紫外分光光度计或者使用核酸测定仪测定总ＲＮＡ的纯度和浓度，以便在反转录的过程中进行定量。用１％甲醛变性凝胶电泳，ＥＢ染色，紫外光下观察ＲＮＡ，如果能够清楚的看见２８Ｓ、１８Ｓ和５Ｓ３条带，而且２８Ｓ条带的宽度是１８Ｓ的２倍时，表明ＲＮＡ的完整性较好。在测定时ＲＮＡ溶液浓度时，ＲＮＡ溶液必须充分混匀，其吸光度值ＯＤ２６０／ＯＤ２８０的值在１．８～２．０之间时，说明纯度比较高，可以继续往下做。
收稿日期：２００８－０１－１８作者简介：高海波，在读硕士研究生，主攻方向：动物繁殖调控
因此称半定量ＲＴ－ＰＣＲ法。本文就半定量ＲＴ－ＰＣＲ的原理、技术、操作步骤和注意事进行综述。
１提取组织总ＲＮＡ
１．１组织材料的获取一般我们获取的组织材料首先要经过
总ＲＮＡ的提取是ＲＴ－ＰＣＲ反应中关键的第一步，因为ＲＮＡ提取质量的好坏直接关系到后面ｃＤＮＡ的合成和ＰＣＲ的扩增。因此所提的总ＲＮＡ要求纯度高、完整性好并达到一定的浓度。由于ｍＲＮＡ半衰期短，又

RT-PCR法检测TOCP染毒母鸡坐骨神经Caspase-3 mRNA 的表达

RT-PCR法检测TOCP染毒母鸡坐骨神经Caspase-3 mRNA 的表达一、前言1.关于RT –PCR:为逆转录PCR或反转录PCR，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。

在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

可用于检测细胞/组织中基因表达水平，细胞中RNA病毒的含量和直接克隆特定基因的cDNA序列等。

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在TaqDNA聚合酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

(Plateau)。

到达平台期所需循环次数取决于样品中模板的拷贝。

在PCR中需要设计引物，引物是人工合成的两段寡核苷酸序列，一个引物与感兴趣区域一端的一条DNA模板链互补，另一个引物与感兴趣区域另一端的另一条DNA 模板链互补。

引物设计有其原则：（1）引物最好在模板cDNA的保守区内设计。

（2）引物长度一般在15~30碱基之间。

（3）引物GC含量在40%~60%间，Tm值最好近72℃。

（4）引物3′端要避开密码子的第3位。

（5）引物3′端不能选择A，最好选择T。

PepT1基因绝对荧光定量PCR标准曲线的建立

PepT1基因绝对荧光定量PCR标准曲线的建立李慧锋;李丽;张丽娟;徐玉良;李武峰【摘要】为研究 PepT1 mRNA 在鸡小肠的表达对于蛋白质消化吸收的影响,实验建立了 PepT1 基因绝对荧光定量PCR标准曲线.根据GenBank中 PepT1 的序列信息设计合成两对引物,引物一是克隆引物,用于从鸡小肠细胞中扩增出cDNA片段;引物二是荧光定量PCR引物,其长度包含于引物一中,用荧光定量PCR来检测基因的表达.通过克隆出 PepT1 基因282 bp部分片段并插入到PMD18载体中,从而构建出绝对荧光定量PCR标准曲线.从实验结果得出标准曲线的回归方程为Y=-3.205X+34.170,其回归系数R2=0.990,溶解曲线表现为单一的峰,通过对结果的具体分析,认为该方法可靠,特异性均较强,可成功构建目的基因的标准曲线.【期刊名称】《山西农业大学学报（自然科学版）》【年(卷),期】2010(030)004【总页数】4页(P332-335)【关键词】鸡小肠;PepT1;荧光定量PCR;标准曲线【作者】李慧锋;李丽;张丽娟;徐玉良;李武峰【作者单位】山西农业大学,生命科学学院,山西,太谷,030801;山西农业大学,生命科学学院,山西,太谷,030801;山西农业大学,生命科学学院,山西,太谷,030801;山西农业大学,生命科学学院,山西,太谷,030801;山西农业大学,生命科学学院,山西,太谷,030801【正文语种】中文【中图分类】Q75小肽跨膜转运是一种自然界普遍存在的现象,在人、动物、细菌、真菌以及高等植物发芽种子中都有发现[1]。

小肽转运载体PepT1是质子依赖型转运载体,是动物组织内一个重要的生理过程,通常是通过动物小肠进行表达的[2]。

小肽对动物营养有着特殊的意义,一方面在吸收过程中,小肽与游离氨基酸的吸收是两个相互独立的转运系统,与游离氨基酸相比,小肽具有吸收速度快、耗能低、不易饱和,且各种肽之间转运无竞争性与抑制性等特点,有关资料表明在蛋白质消化过程中,以肽形式存在的氨基酸浓度远比游离氨基酸存在的浓度大,而且肽的吸收速度也快[3～4]。

半定量RT-PCR法分析猪肌肉组织细胞谷胱甘肽过氧化物酶mRNA表达水平

半定量RT-PCR法分析猪肌肉组织细胞谷胱甘肽过氧化物酶mRNA表达水平徐春兰;汪以真【摘要】细胞谷胱甘肽过氧化物酶(cGPX)是动物体内一种重要的抗氧化酶.本实验室构建一优化的半定量RT-PCR法,以18s rRNA为内标,研究猪肌肉组织中cGPX 基因 mRNA表达水平.提取猪肌肉组织总RNA,经反转录后进行扩增,先寻求PCR 线性扩增范围,确定RT-PCR的最佳循环次数和Mg2+浓度,扩增后用VDS摄像系统扫描PCR扩增产物的电泳条带灰度.通过cGPX PCR产物的灰度与18s rRNA PCR产物的灰度之比,即可计算出cGPX mRNA的相对含量.【期刊名称】《中国兽药杂志》【年(卷),期】2005(039)008【总页数】5页(P3-6,23)【关键词】RT-PCR;cGPX;猪;肌肉【作者】徐春兰;汪以真【作者单位】浙江大学饲料科学研究所,浙江杭州,310029;浙江大学饲料科学研究所,浙江杭州,310029【正文语种】中文【中图分类】Q503谷胱甘肽过氧化物酶（EC1.11.1.9，glutathione peroxidase，GPX）是在哺乳动物中发现的，通过还原态谷胱甘肽催化还原过氧化物和有机过氧化氢物，从而保护细胞及其他如DNA、蛋白质及脂质体等敏感生物分子免受氧自由基的损害［1］。

目前已知人GPX家族有五个成员，即胞质内GPX（classic or cytosolic GPX，GPX1）、胃肠道特异性GPX（gastrointestial-specific GPX，GPX2）、血浆GPX（plasma GPX，GPX3）、磷脂过氧化氢GPX（phospholipid hydroperoxide GPX，GPX4）以及附睾特异性GPX（epididymis-specific GPX，GPX5）。

GPX作为细胞内重要的抗氧化剂正日益受到医学界的重视。

细胞内谷胱甘肽过氧化物酶（cellular glutathione peroxidase，cGPX）是一种含硒酶［2］，作为动物体内重要的抗氧化酶，对预防多种动物疾病如仔猪白肌病、桑椹心、雏鸡渗出性素质和家畜产仔率下降等有重要作用［3］。

半定量rtpcr技术原理

半定量rtpcr技术原理嗨，小伙伴们！今天咱们来聊一聊超有趣的半定量RT - PCR技术原理哦。

半定量RT - PCR啊，就像是一个小小的侦探，在细胞这个神秘的世界里探寻基因表达的秘密呢。

咱们先得知道，细胞里的基因就像一本本不同的小书，每个基因都有自己独特的信息，而这些信息有时候是需要被读取出来的，这读取的过程就是基因表达啦。

那RT - PCR是怎么回事呢？RT就是逆转录的意思哦。

细胞里的基因信息大多是以DNA的形式存在的，但是要想知道这个基因是不是正在积极地工作，我们得看它转录出来的RNA呀。

可是RNA这小机灵鬼不太好直接研究，所以呢，我们就用逆转录酶这个小助手，把RNA逆转录成cDNA。

这就好比把RNA这个用特殊语言写的小纸条，翻译成了我们能更好研究的cDNA版本。

这个过程就像是把一种神秘的暗号给破解了一样，超酷的。

接下来就是PCR的部分啦。

PCR就像是一个复印机，不过是超级精确的那种哦。

它可以把我们刚刚得到的cDNA不断地复制，让它的数量变得很多很多。

你可以想象一下，原本只有一点点的cDNA，就像一颗小种子，通过PCR这个神奇的魔法，变成了一大片的“小种子森林”。

这个过程是有特定的温度循环的。

就像坐过山车一样，一会儿温度高，一会儿温度低，在不同的温度下，不同的酶和原料就开始工作啦。

那半定量又是怎么个事儿呢？这就是这个技术超级有趣的地方啦。

半定量呢，不是像那种特别精确的定量方法，能准确地说出有多少个分子。

它更像是一种大概的估计，就像我们看东西，不一定要知道具体有多少厘米，但是能大概知道长或者短。

在半定量RT - PCR里，我们通过比较不同样本里目标基因的扩增产物的量，来判断这个基因在不同情况下的表达水平是高了还是低了。

比如说，我们想知道一种植物在干旱环境和湿润环境下某个基因的表达差异。

我们就分别从干旱环境下的植物和湿润环境下的植物细胞里提取RNA，然后进行RT - PCR。

如果干旱环境下植物的这个基因经过PCR后产物量比湿润环境下的多很多，那就说明这个基因在干旱环境下可能表达得更强烈，就像是这个基因在干旱的时候更努力地工作，来帮助植物应对干旱呢。

半定量RT—PCR在基因表达方面的应用

次性手套．要经常更换．则上是且原
手离开超净工作台就应换一次手套。
实验所用的玻璃器皿均在０１的焦．％
碳酸二乙酯（ＥＣ水溶液中过夜处理．ＤＰ）
再用蒸馏水冲净．压灭菌１，高于干燥ｈ烘箱中烘干备用。凡是不能用高温处理的塑料容器等用０１．％的焦碳酸二乙酯
ＤＰ水处理。注意ＤＰ是剧毒．致ＥＣＥＣ有
ＵｉｒｔＴｉｈｎｉ３８１ＣｉａｎｅｓｙａｕＳａｘ０００，ｈｎ）ｖｉ，ｇ
ＡｂｓｒｃＲｅｅｓｒｎｃｐｉｎ— ｏｙｒｓｉｎＲｅｃｉｎ（ｔａｔ：ｖｒｅＴａｓｒｔｏＰｌｍｅａｅＣｈａｔｏｉＲＴ— ＰＣＲ、ｉｓａ
的组织中均存在ＲＡ酶，的皮肤、Ｎ人手
指、剂、器等均可能造成污染，试容因０００）３８１（西农业大学动物科技学院，西太谷山山
此在全部实验操作过程中我们建议：
设立一个专用ＲＡ提取的超净工作Ｎ
Ｋｅｏｄ：ｅ－ｕｎｔｉ；ＴＰＲｇｎｐｓｏｙｗｒｓｓｑａｔａｖＲ — Ｃ；ｅｅｘｒｓｉｍｉｔｅｅｅｉ
ｕｅａｄａｐｏｒａｅｆｒｍａｙｕｏｅ．Ｈｅｅｓｄｎｐｒｐｔｎｐｐｓｓｉｏｒｗｅｄｓｒｂｔｐｎｉｌ，ｓａｄｒｅｃｅｈｅｒｃｐｅｔｎａｄｉｉ

半定量RT-PCR

半定量RT-PCR逆转录PCRRT-PCR 为反转录RCR（reverse transcription PCR）和实时PCR（real time PCR）共同的缩写。

逆转录PCR，或者称反转录PCR(reverse transcription-PCR,RT-PCR)，是聚合酶链式反应(PCR)的一种广泛应用的变形。

在RT-PCR中，一条RNA链被逆转录成为互补DNA，再以此为模板通过PCR进行DNA扩增。

由一条RNA单链转录为互补DNA(cDNA)称作“逆转录”，由依赖RNA的DNA 聚合酶（逆转录酶）来完成。

随后，DNA的另一条链通过脱氧核苷酸引物和依赖RNA 的DNA聚合酶完成，随每个循环倍增，即通常的PCR。

原先的RNA模板被RNA酶H降解，留下互补DNA。

RT-PCR的指数扩增是一种很灵敏的技术，可以检测很低拷贝数的RNA。

RT-PCR 广泛应用于遗传病的诊断，并且可以用于定量监测某种RNA的含量。

（检测基因表达的方法，参见Northern Blot法。

）RT-PCR有时候也会指代实时PCR(real-time PCR)。

为了与逆转录PCR相区别，通常被写作“定量PCR”(quantitative PCR)或者RTQ-PCR(real-time quantitative PCR)。

实时PCR实时PCR(real-time PCR)，属于定量PCR（Q-PCR）的一种，以一定时间内DNA 的增幅量为基础进行DNA的定量分析。

real time PCR 的定量使用萤光色素，目前有二种方法。

一种是在ds DNA中插入特异的萤光色素；另一种使用一种能与增幅DNA序列中特定寡核酸序列相结合的一种萤光探针（probe）。

real time PCR 与reverse transcription PCR 相结合，能用微量的RNA来找出特定时间、细胞、组织内的特别表达的遗传基因。

这两种RT PCR的组合又被称之为“定量RT-PCR（quantitative RT-PCR）”RT-PCR技术相关试剂oligo: 多聚体，相当于mRNA引物AMV（M-MLV）：逆转录酶dNTP：脱氧核苷酸RNase：RNA酶抑制剂PCR Buffer：RT-PCR缓冲液MgCl2：2价镁离子（一）预变性：破坏DNA中可能存在的较难破坏的二级结构。

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农业生物技术学报ＪｏｕｒｎａｌｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＢｉｏｔｅｃｈｎｏｌｏｇｙ２００６，１４（４）：４８９￣４９２＊基金项目：国家重点基础研究发展规划（９７３）项目（Ｎｏ．２００４ＣＢ１１７５００）资助。

作者简介：刘国华（１９７０￣），男，副研究员。

主要研究方向：家禽营养。

Ｅ－ｍａｉｌ：＜ｌｉｕｇｕｏｈｕａ＠ｍａｉｌ．ｃａａｓ．ｎｅｔ．ｃｎ＞．收稿日期：２００５－０７－１３接受日期：２００５－０７－２９・研究论文・半定量ＲＴ－ＰＣＲ法评定鸡小肠肽转运载体ｃＰｅｐＴ１基因的表达刘国华，蔡辉益，郑爱娟，陈桂兰（中国农业科学院饲料研究所，北京１０００８１）摘要：根据鸡肽转运载体ｃＰｅｐＴ１ｍＲＮＡ和看家基因β－ａｃｔｉｎｍＲＮＡ序列，分别设计ｃＰｅｐＴ１和β－ａｃｔｉｎ引物各１对，并通过Ｍｇ２＋浓度、循环数等ＰＣＲ条件的优化，建立了包括ＲＮＡ提取、反转录、ＰＣＲ的鸡小肠ｃＰｅｐＴ１基因表达检测方法。

采用该方法研究了肉仔鸡ｃＰｅｐＴ１基因在小肠各段的表达差异。

结果显示，肉仔鸡小肠ｃＰｅｐＴ１表达水平表现为随小肠近端到远端显著降低的趋势，回肠表达水平显著低于十二指肠和空肠，十二指肠和空肠差异不显著。

关键词：半定量ＲＴ－ＰＣＲ；鸡；肽转运载体；基因表达中图分类号：Ｓ１８８文献标识码：Ａ文章编号：１００６－１３０４（２００６）０４－０４８９－０４ＥｖａｌｕａｔｉｎｇＧｅｎｅＥｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆＰｅｐｔｉｄｅＴｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｃＰｅｐＴ１ｉｎＳｍａｌｌＩｎｔｅｓｔｉｎｅｏｆＣｈｉｃｋｂｙＳｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔｙＲＴ－ＰＣＲＬＩＵＧｕｏ－ｈｕａ，ＣＡＩＨｕｉ－ｙｉ，ＺＨＥＮＧＡｉ－ｊｕａｎ，ＣＨＥＮＧｕｉ－ｌａｎ（ＦｅｅｄＲｅｓｅａｒｃｈＩｎｓｔｉｔｕｔｅ，ＣｈｉｎｅｓｅＡｃａｄｅｍｙｏｆＡｇｒｉｃｕｌｔｕｒａｌＳｃｉｅｎｃｅｓ，Ｂｅｉｊｉｎｇ１０００８１，Ｃｈｉｎａ）Ａｂｓｔｒａｃｔ：Ａｍｅｔｈｏｄｏｆｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔｙＲＴ－ＰＣＲｗａｓｅｓｔａｂｌｉｓｈｅｄｔｏｅｖａｌｕａｔｅｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｐｅｐｔｉｄｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒｉｎｓｍａｌｌｉｎｔｅｓ－ｔｉｎｅｏｆｃｈｉｃｋ．Ｔｈｅｐｒｉｍｅｒｓｏｆβ－ａｃｔｉｎａｎｄｃＰｅｐＴ１ｗｅｒｅｄｅｓｉｇｎｅｄａｃｃｏｒｄｉｎｇｔｏｔｈｅｉｒｇｅｎｅｓｅｑｕｅｎｃｅｒｅｐｏｒｔｅｄ．ＴｈｅｃｙｃｌｅｓａｎｄＭｇ２＋ｃｏｎ－ｃｅｎｔｒａｔｉｏｎｓｗｅｒｅｏｐｔｉｍｉｚｅｄｂｙｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔ．ＴｈｅｒｅｓｕｌｔｓｓｈｏｗｅｄｔｈａｔｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃＰｅｐＴ１ｖａｒｉｅｄｉｎｉｎｔｅｓｔｉｎａｌｓｅｇｍｅｎｔｓ，ｄｅｃｒｅａｓｅｄｆｒｏｍｔｈｅｐｒｏｘｉｍａｌｔｏｔｈｅｄｉｓｔａｌ，ｉ．ｅ．ｔｈｅｌｅｖｅｌｏｆｔｈｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎｏｆｃＰｅｐＴ１ｉｎｉｌｅｕｍｗａｓｈｉｇｈｅｒｔｈａｎｔｈａｔｉｎｄｕｏｄｅｎｕｍａｎｄｊｅｊｕｎｕｍｓｉｇ－ｎｉｆｉｃａｎｔｌｙ，ｎｏｄｉｆｆｅｒｅｎｃｅｗａｓｆｏｕｎｄｂｅｔｗｅｅｎｄｕｏｄｅｎｕｍａｎｄｊｅｊｕｎｕｍ．Ｋｅｙｗｏｒｄｓ：ｓｅｍｉ－ｑｕａｎｔｉｔｙＲＴ－ＰＣＲ；ｃｈｉｃｋ；ｐｅｐｔｉｄｅｔｒａｎｓｐｏｒｔｅｒ；ｇｅｎｅｅｘｐｒｅｓｓｉｏｎ肽转运载体ＰｅｐＴ１是依质子梯度的寡肽转运载体家族的成员，其主要表达部位在小肠，是动物日粮中小肽完整吸收的主要途径（ＬｅｉｂａｃｈａｎｄＧａｎａｐａ－ｔｈｙ，１９９６）。

自Ｆｅｉｅｔａｌ．（１９９４）在家兔体内发现ＰｅｐＴ１以来，已有十几种哺乳动物和爬行动物的ＰｅｐＴ１被成功克隆，并对其功能特性和基因调控进行了有限的研究（孙建义等，２００２；韩飞等，２００３）。

但由于家禽与这些物种的ＰｅｐＴ１基因的同源性存在较大差异（与兔、人、小鼠、大鼠和绵羊的同源性为６５％左右），以及医学研究对鸟类的忽视，使得家禽ＰｅｐＴ１基因及功能研究一直未能取得进展。

直到Ｃｈｅｎｅｔａｌ．（１９９９）发现鸡小肠也存在ＰｅｐＴ１转运蛋白，并从鸡小肠克隆出鸡肽转运载体（ｃＰｅｐＴ１）（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，２００２），才为家禽小肽转运分子机理研究带来了新契机。

ｃＰｅｐＴ１是７１４个氨基酸组成的蛋白质分子（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，２００２），其在小肠粘膜的数量分布决定了吸收小肽分子的能力（ＭｅｒｅｄｉｔｈａｎｄＢｏｙｄ，２０００），因此可将ｃＰｅｐＴ１基因表达水平和ｃＰｅｐＴ１蛋白分子的数量作为衡量小肽转运能力的指标。

目前已经成功地建立了大鼠（Ｍｉｙａｍｏｔｏｅｔａｌ．，１９９６）、人（Ｌｉａｎｇｅｔａｌ．，１９９５）、兔（Ｆｅｉｅｔａｌ．，１９９４）、鸡（Ｃｈｅｎｅｔａｌ．，１９９９）的ＰｅｐＴ１ｍＲＮＡ表达量检测方法，但在国内尚未见报道。

本实验通过引物设计、ＰＣＲ条件优化等建立了ＲＴ－ＰＣＲ法检测ｃＰｅｐＴ１ｍＲＮＡ表达量的半定量方法，为研究鸡对小肽的吸收及其调控机制提供方法学基础。

１材料和方法１．１材料来源７日龄肉用雏鸡２０只，取十二指肠、空肠和回肠各１小段，液氮速冻，置－７０℃冰箱冻存。

农业生物技术学报２００６年１．２总ＲＮＡ提取ＲＮＡ提取采用离心柱型ＲＮＡｕｌｔｒａ总ＲＮＡ提取试剂盒（北京天为时代科技有限公司产品）。

取约１００ｍｇ小肠组织，在液氮中研碎，加入１ｍＬ裂解液ＲＺ，匀浆，室温放置５ｍｉｎ。

４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心５ｍｉｎ，取上清，转入无ＲＮＡ酶的离心管中，加０．２ｍＬ氯仿，剧烈振荡１５ｓ，室温放置３ｍｉｎ。

４℃１２０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上层无色的水相，转入新管，缓慢加入同体积７０％乙醇，混匀。

将管中的溶液和沉淀一起转入吸附柱ＣＲ中，４℃１００００ｇ离心３０ｓ，弃废液。

加０．５ｍＬ去蛋白缓冲液ＲＤ，４℃１００００ｇ离心３０ｓ，弃废液。

加０．７ｍＬ漂洗液ＲＷ，４℃１００００ｇ离心３０ｓ，弃废液。

加０．５ｍＬ漂洗液ＲＷ，４℃１００００ｇ离心２ｍｉｎ，将吸附柱转入新管，加５０μＬ无ＲＮＡ酶水，室温静置２ｍｉｎ，４℃１００００ｇ离心２ｍｉｎ。

电泳检测ＲＮＡ完整性，紫外法检测ＲＮＡ含量及纯度。

提取的总ＲＮＡ立即反转录或－７０℃冰箱冻存。

１．３反转录取总ＲＮＡ３μｇ，加入引物Ｏｌｉｇ（ｄＴ）１２１μＬ，１０ｍｍｏｌ／ＬｄＮＴＰ１μＬ，无ＲＮＡ酶的水定容至１２μＬ，混匀，７０℃温浴５ｍｉｎ，迅速置冰上冷却，加５×反转录缓冲液４μＬ，０．１ｍｏｌ／ＬＤＴＴ（二硫苏糖醇）２μＬ，４０Ｕ／μＬＲＮＡ酶抑制剂１μＬ，混匀，４２℃温浴２ｍｉｎ。

再加入ＳｕｐｅｒｓｃｒｉｐｔＩＩ反转录酶１μＬ，混匀，４２℃温浴５０ｍｉｎ，７０℃温浴１５ｍｉｎ，置冰上冷却用于ＰＣＲ反应或－２０℃冻存。

１．４ＰＣＲ１．４．１引物登录ＧｅｎＢａｎｋ，检索ｃＰｅｐＴ１ｍＲＮＡ序列，根据该序列采用ＰｒｉｍｅｒＰｒｅｍｉｅｒ５．０软件设计特异性引物。

ｃＰｅｐＴ１上游：５＇－ＴＡＧＡＣＴＧＧＧＣＡＡＧＣＧＴＣＴＴ－３＇；下游：５＇－ＴＴＴＧＣＡＡＣＧＡＣＧＡＣＧＡＧＡＡ－３＇。

β－ａｃｔｉｎ上游：５＇－ＴＧＡＡＣＡＡＧＣＣＣＡＧＡＧＧＴＴＴ－３＇；下游：５＇－ＡＴＣＴＡＡＧＡＡＣＧＧＡＴＡＣＣＴＣＡＧＧ－３＇。

ｃＰｅｐＴ１扩增产物长度为３４７ｂｐ，β－ａｃｔｉｎ６４９ｂｐ。

引物由上海生工合成。

１．４．２反应体系１μＬｃＤＮＡ模板，１μＬＴａｑＤＮＡ聚合酶（２．５Ｕ／μＬ），５μＬ１０×ＰＣＲ缓冲液（含Ｍｇ２＋），４μＬｄＮＴＰ（１０ｍｍｏｌ／Ｌ），１μＬβ－ａｃｔｉｎ上游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ），１μＬβ－ａｃｔｉｎ下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ），１μＬｃＰｅｐＴ１上游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ），１μＬｃＰｅｐＴ１下游引物（１０μｍｏｌ／Ｌ），ＭｇＳＯ４（１００ｍｍｏｌ／Ｌ）０．２５μＬ，总体积为５０．０μＬ。

１．４．３ＰＣＲ反应条件使用ＧｅｎｅＡｍｐＰＣＲｓｙｓｔｅｍ９７００型ＰＣＲ仪（ＡｐｐｌｉｅｄＢｉｏｓｙｓｔｅｍ，美国），设定条件为：９４℃预变性５ｍｉｎ，９４℃变性３０ｓ，５６℃退火３０ｓ，７２℃延伸４５ｓ，完成２９个循环后７２℃延伸５ｍｉｎ。

１．４．４Ｍｇ２＋浓度的确定采用ＭｇＳＯ４提供ＰＣＲ扩增所需的Ｍｇ２＋。

在保持上述ＰＣＲ体系不变的基础上，分别加入ＭｇＳＯ４使Ｍｇ２＋终浓度为２．０，２．５和３．０ｍｍｏｌ／Ｌ，进行扩增。

产物进行凝胶电泳，鉴定其扩增效果，确定最适宜Ｍｇ２＋浓度。

１．４．５ＰＣＲ扩增循环数确定采用上述ＰＣＲ体系，分别设定循环数２０、２４、２７、３０、３３、３６和３９次，根据扩增产物的效果，在ＰＣＲ扩增平台期之前的指数增长期选择适宜的循环数。

１．５ＰＣＲ产物电泳本实验ＰＣＲ产物采用ＥＢ（溴化乙锭）染色，在ＴＡＥ电泳缓冲液中以１．２％的琼脂糖凝胶电泳。

称取０．４８ｇ琼脂糖，溶于４０ｍＬＴＡＥ缓冲液中，微波加热融化，加１．０μＬ的ＥＢ，混匀，制成平面胶。

取８μＬＰＣＲ扩增产物，加０．９μＬ１０×电泳上样缓冲液，混匀后点样，每块胶点１个标准样（ＭａｒｋｅｒⅡ，北京天为时代科技有限公司）。

采用ＤＹＹ－ⅡＩ３１Ａ型电泳仪（北京市六一仪器厂）进行电泳，电压１４０Ｖ，电流１００ｍＡ。

紫外凝胶分析仪观察，照相，Ｂｉｏ－１Ｄ＋＋（ＶｉｌｂｅｒＬｏｕｒｍａｔ，法国）软件分析结果。

１．６测序将扩增产物委托北京三博远志生物公司进行测序。

１．７数据处理和统计分析据测得的目的基因和看家基因的电泳条带光密度值，计算目的基因的相对表达量，采用Ｓｔａｔｉｓｔｉｃａ６．０（Ｓｔａｔｓｏｆｔ，Ｉｎｃ．，美国）ＡＮＯＶＡ程序进行方差分析，Ｆｉｓｈ’ｓＬＳＤ法多重比较，显著性水平为０．０５。

２结果２．１提取总ＲＮＡ纯度和含量由图１可见，从肉鸡小肠提取的ＲＮＡ在电泳中分为清晰的２８Ｓ、１８Ｓ和５Ｓ３条带，表明ＲＮＡ完整性很好，提取过程中未发生降解。

经紫外检测，所有样品的ＯＤ２６０／ＯＤ２８０均在１．８￣２．１之间，表明ＲＮＡ样品纯度较好，达到了后续实验的需要。

２．２反转录结果通过琼脂糖凝胶电泳观察ｃＤＮＡ条带呈弥散状，说明反转录的ｃＤＮＡ能满足后续ＰＣＲ反应。

２．３Ｍｇ２＋浓度对ＰＣＲ扩增的影响Ｍｇ２＋是ＤＮＡ聚合酶的辅助因子，其浓度高低直接影响ＤＮＡ聚合酶的活性。

Ｍｇ２＋浓度太低影响４９０第４期刘国华等：半定量ＲＴ－ＰＣＲ法评定鸡小肠肽转运载体ｃＰｅｐＴ１基因的表达扩增效率，浓度太高则影响ＰＣＲ特异性。

从图２可见，Ｍｇ２＋终浓度为２．５ｍｍｏｌ／Ｌ扩增效果最佳，条带亮度最高。

图１．肉鸡小肠提取的总ＲＮＡ电泳图Ｆｉｇ．１．ＥｌｅｃｔｒｏｐｈｏｒｅｓｉｓｍａｐｏｆｔｏｔａｌＲＮＡｆｒｏｍｓｍａｌｌｉｎｔｅｓｔｉｎｅｏｆｂｒｏｉｌｅｒ１～４，抽测的不同肉鸡的小肠提取的总ＲＮＡ样品。