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中国纳豆激酶团体标准一、纳豆激酶的活性定义和测量方法纳豆激酶是一种从纳豆中提取的酶，具有溶解血栓、降低血液粘稠度等作用。
纳豆激酶的活性是指其在一定时间内分解纤维蛋白的能力，通常以单位表示。
测量纳豆激酶活性的方法有多种，常用的有纤维蛋白平板法、光谱法等。
二、纳豆激酶原料的要求和检测标准纳豆激酶原料应符合以下要求：1.来源：应来自经过严格筛选的纳豆发酵原料，确保无污染、无有害微生物和有害化学物质。
2.活性：原料中纳豆激酶的活性应达到一定标准，如不得低于10000单位/克。
3.稳定性：原料应具有良好的稳定性，确保在生产、储存和使用过程中不易失去活性。
纳豆激酶原料的检测标准包括：1.外观：应呈均匀的黄色或淡黄色，无杂质。
2.气味：应具有典型的纳豆气味，无异味。
3.水分：水分含量应符合规定，以保证原料的稳定性。
4.活性：按照规定的测量方法进行检测，确保达到规定的活性标准。
三、纳豆激酶产品的生产规范和流程纳豆激酶产品的生产应遵循以下规范和流程：1.原料准备：按照规定的标准筛选原料，并进行必要的清洗和干燥处理。
2.提取和纯化：采用适当的提取和纯化技术，如离心、过滤、沉淀等，以获得高纯度的纳豆激酶。
3.制剂制备：将纳豆激酶与其他必要的辅料混合，制备成各种剂型的纳豆激酶产品，如片剂、胶囊、口服液等。
4.质量检测：对每个生产批次的产品进行质量检测，确保符合规定的标准。
5.包装和储存：按照规定的包装要求进行包装，并确保产品在适当的温度和湿度条件下储存。
6.运输：在运输过程中，应采取必要的措施防止产品损坏和污染。
四、纳豆激酶产品的质量控制和安全性评估纳豆激酶产品的质量控制是确保产品质量和安全的关键环节，应遵循以下要求：1.质量标准：制定详细的质量标准，包括性状、鉴别、纯度、活性等方面的规定。
2.质量检验：对每个生产批次的产品进行质量检验，确保符合质量标准。
3.不合格品处理：对不合格品进行标识、记录并按照规定进行处理，防止不合格品流入市场。
纳豆激酶的活性测定
胡静
【期刊名称】《海峡药学》
【年(卷),期】2013(025)005
【摘要】建立快速、简单测定纳豆激酶活性的方法.本实验以TAME为底物测定纳豆激酶的效价,根据扫描发现蓝色复合物在574nm处有最大吸收,故在574nm处测定吸收度,依照公式,TAME(u·mL-1)=(甲醇微克分子数×样品稀释倍数)/(样品量mL×时间min),计算样品的TAME单位.结果 TAME法灵敏度高,操作简便,适合作为常规的分析检测手段.结论实验证明,TAME法能准确测定纳豆激酶的活性,且设计简单,操作方便,重现性好,是一个切实可行的测定纳豆激酶的方法.
【总页数】2页(P47-48)
【作者】胡静
【作者单位】浙江省宁波市李惠利医院,宁波,315040
【正文语种】中文
【中图分类】Q55
【相关文献】
1.纳豆冻干粉中纳豆激酶的活性测定 [J], 敖宇涛;王冬雪;许灵善;聂风环;王玮;郭建鹏
2.两种纳豆激酶活性测定方法对比及相关性分析 [J], 杨明俊;杨晓彤;冯慧琴;糜可;杨庆尧
3.纳豆激酶体外活性测定及影响因素考察 [J], 王怡鑫;尹宗宁;张霞
4.纳豆激酶分离纯化和酶活性测定的研究进展 [J], 法芸;张金玲;赵海杰;刘会洲
5.纳豆激酶活性测定方法和膳食用量 [J], 刘艳春; 蔡凌云; 王秀伶; 窦世娟
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纳⾖激酶服⽤⽅法⽇本营养健康⾷品协会规定纳⾖激酶的每⽇正常维持量应该不低于2000FU。
因此，医学营养专家建议纳⾖激酶服⽤⼈群的基本⽤量如下：1、每⽇摄取量2000FU，是正常或亚健康⼈群预防⼼脑⾎管疾病⽤量，多数⼈在服⽤7天左右⾝体出现反应，⾃觉精⼒充沛，眼睛⼲涩症状等开始好转；敏感⼈群当天即有反应。
2、每⽇摄取量2000FU-4000FU，是⼼脑⾎管疾病患者建议⽤量，15天左右⼤多⾝体出现积极反应，⽐如⼿脚冰凉、胸闷⼼慌、肢体⿇⽊、头晕眼花、失眠等症状逐渐缓解，2-3个⽉左右⾎压、⾎脂指标逐渐向正常值靠拢，待指标正常时可减量⾄健康维持量。
3、每⽇摄取量4000FU-6000FU，是⼼脑⾎管疾病重病患者建议⽤量，1⽉左右⾃觉症状开始减缓，维持3个⽉减缓明显，待指标好转后，可逐渐减量。
服⽤禁忌1. 严重腹泻，呕吐，消化不良者；2. 需要促凝药物治疗的病患。
3. ⽪肤、内脏器官出⾎、渗⾎者。
4. 治疗中使⽤⼤剂量溶栓药物者。
5. ⽀架术后⼈群遵医嘱。
注意事项孕妇不推荐⾷⽤，⼿术前后2周暂停⾷⽤，以免影响伤⼝愈合。
其它与⾎液凝集相关疾病，须先请教医⽣后⽅可⾷⽤。
若有⼤量出⾎,如⾎管破裂、意外事故等也应避免⾷⽤。
如脑溢⾎患者须在症状发作期后3个⽉才适合⾷⽤。
纳⾖激酶属于功能性⾷品不能替代药物。
不受胃酸⼲扰，直达⼩肠吸收，体内作⽤时间8-12⼩时。
低热量，低蛋⽩，肥胖及肾病患者可安⼼⾷⽤。
与药物同⾷⽆抵触且可降低药物的不良反应。
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纳豆激酶酶活测定方法琼脂糖—纤维素平板法：（1）原理：在血液中纤维蛋白溶酶原和纤维蛋白原往往处于结合状态，因此本试验所用纤维蛋白原制剂均包含纤维蛋白溶酶原。
用凝血酶将纤维蛋白原凝结成蛋白平板后，将样品定量滴在平板上，如果有纤维蛋白溶酶原激活剂活性存在，将纤维蛋白溶酶原激活成纤维蛋白溶酶，从而溶解纤维蛋白，出现溶圈。
在纤维蛋白溶酶原过量的情况下，溶圈的大小反映了激活剂的量。
（2）仪器：玻璃平皿（直径12cm）10ul微量进样器变温电炉（1000W）恒温培养箱（±0.5℃）超净工作台游标卡尺电脑扫描仪（3）试剂药品：1、0.1M磷酸盐缓冲液：0.1M磷酸氢二钠：取无水磷酸氢二钠14.2克用蒸馏水稀释到1000毫升。
0.1M磷酸二氢钠：取无水磷酸二氢钠2.4克用蒸馏水稀释到200毫升。
两种溶液按一定比例混合，用ＰＨ计测定PH至7.4。
2、尿激酶溶液：尿激酶标准品用磷酸盐缓冲液分别配成每毫升磷酸盐缓冲液含10、20、40、60国际单位溶液（中国药品生物检定所尿激酶标准品）。
3、纤维蛋白原溶液：取一只纤维蛋白原加磷酸盐缓冲液32毫升（中国药品生物检定所牛血纤维蛋白原，每支可凝蛋白77毫克）。
4、凝血酶溶液：配成每毫升磷酸盐缓冲液含25单位凝血酶溶液（中国药品生物检定所凝血酶）。
5、琼脂糖溶液：0.1克琼脂糖（电泳级）加磷酸盐缓冲液40毫升，煮沸加炭素墨水1至2滴，至体积约30毫升，取20毫升。
6、样品溶液：样品提取液用水配成每毫升含相当于10—60单位尿激酶的溶液。
（4）测定方法：在超净工作台上将20毫升琼脂糖溶液加15毫升纤维蛋白原溶液，在40℃左右混合，立即加凝血酶0.5毫升混匀，倒入平皿（表面不得有气泡）。
盖盖静置30分钟，用微量进样器分别吸标准品及样品溶液10微升，针刺入平板底垂直点样。
置于37℃恒温培养箱中16小时，取出。
数据处理方法1：用游标卡尺量出每个溶圈相互垂直的两直径，以两直径乘积为横坐标，标准品浓度为纵坐标在双对数纸上作标准曲线，从标准曲线上查出样品单位数。
纳豆激酶的服用方法纳豆激酶（nattokinase）是一种从纳豆中提取的酶，它被广泛认为对心血管健康有益。
纳豆是一种传统的日本食品，由大豆经过发酵制成，富含纳豆激酶和其他有益的营养物质。
许多人选择口服纳豆激酶作为一种补充剂，以支持心脏和血管功能。
下面我将详细介绍纳豆激酶的服用方法。
1. 剂量：纳豆激酶的剂量应根据自身的健康状态、年龄和个体差异来确定。
一般建议每天服用1000-2000法国学術會議纳豆单位（FU）的纳豆激酶。
然而，这个剂量仅供参考，最好在医生的指导下使用。
因为每个人的身体状况不同，服用剂量可能会有所不同。
2. 时间：纳豆激酶最好在餐后服用，以最大程度地促进其吸收和利用。
这是因为食物可以帮助减缓胃酸的分泌，从而降低纳豆激酶在胃中被破坏的风险。
一般来说，建议在早餐或午餐后服用纳豆激酶。
3. 口服方式：纳豆激酶一般以胶囊或粉末的形式出售。
胶囊是最常见和方便的服用方式，你只需将胶囊整颗吞咽即可。
如果你选购的是纳豆激酶粉末，可以将其混入饮料或食物中一同摄入。
然而，如果你使用纳豆激酶粉末，需要先阅读产品说明，确保掌握正确的稀释比例。
4. 存储：为了保持纳豆激酶的稳定性和活性，建议将其存放在阴凉、干燥的地方，并远离阳光和高温环境。
在遵循产品说明的情况下储存纳豆激酶，可以延长其保质期并保持其效用。
5. 注意事项：在服用纳豆激酶或任何其他补充剂之前，最好咨询医生或药剂师的意见。
他们可以根据你的个人情况和任何现有的健康问题，帮助你确定适当的剂量和使用方法。
此外，如果你正在服用其他药物或有某些健康问题，如出血倾向，妊娠或哺乳期等，最好在使用纳豆激酶之前咨询医生。
总结而言，纳豆激酶是一种被广泛认为对心血管健康有益的酶。
在使用纳豆激酶之前，最好咨询医生的意见，并根据个人情况确定适当的剂量和使用方法。
记住，纳豆激酶只是促进心脏和血管健康的一部分，合理饮食和健康的生活方式同样重要。
多肽双缩脲试剂：称以 1.50克硫酸铜（CuSO4·5H2O）和 6.0克酒石酸钾钠（KNaC4H4O6·4H2O），用500毫升水溶解，在搅拌下加入300毫升10% NaOH溶液，用水稀释到1升，贮存于塑料瓶中（或内壁涂以石蜡的瓶中）。
此试剂可长期保存。
若贮存瓶中有黑色沉淀出现，则需要重新配制。
取2 mL发酵液，加入10%的三氯乙酸2mL，混匀，静置10min,以5000r/min的转速离心15min，取0.5mL上清液于另一试管中，再加入 2.0mL的双缩脲试剂，混匀后静置15min，以3000r/min的转速离心15min，取上清于540nm处测吸光度值。
以加0.5mL蒸馏水和2.0mL双缩脲试剂试管作为空白。
3 生物量测定本实验采取分光光度计测定法。
菌体浓度的不同造成菌液浑浊度的差异，此差异可以用分光光度计吸光度的大小表征出来。
当光线通过发酵菌悬液时，由于菌体的散射及吸收作用使光线的透过量下降。
在一定的范围内，生物量与吸光度呈正比，而吸光度可由分光光度计精确的测量。
此方法可以简便、准确、定性的表示出发酵物生物量的变化。
固体发酵培养物按照1g/5ml 的比例加入0.9%的生理盐水，充分浸提，5000r/mim离心10min，弃去沉淀，即得发酵悬液。
把发酵悬液稀释10倍，以0.9%的生理盐水为空白，在波长为500nm处测定其吸光度（比色皿直径1cm），得OD500作为发酵物生物量的比较指标。
4 羟自由基清除率的测定取三个试管，分别加入2.0 mL 待测样品、2.0 mL 待测样品和2.0 mL 蒸馏水，再向三个试管中分别加入2.0 mL 的FeSO4和2.0 mL 的H2O2（6 mmol/L）。
各个试管混合均匀，静置10 min。
再向三个试管分别加入2.0 mL 水杨酸（6 mmol/L）、2.0 mL蒸馏水和2.0 mL 水杨酸（6 mmol/L），各个试管混合均匀，静置30 min。
纳豆激酶检测方法目前行业内流行的纳豆激酶检测大致有三种方法，其原理、利弊简介如下：一、 IU纤维蛋白平板法：以尿激酶为对照，与纳豆激酶样品同时在纤维蛋白平板特定条件下所形成水解圈，测量各自水解圈直径，通过计算取得相应纳豆激酶活力。
由于对水解圈直径的认定的认定存在经验人员视觉差异，导致测定粗放，数据波动性强，重复性差，不具权威依据。
二、 FU紫外分光法：纳豆激酶与纤维蛋白在一定条件下作用会产生可溶性低分子物质，通过紫外分光技术检测其浓度，通过计算取得相应纳豆激酶活力，数据稳定，重复性强。
测定硬件条件苛刻，测定成本高，不具权威性依据。
三、 U中性蛋白酶法：纳豆激酶与酪蛋白在一定条件下作用会产生可溶性低分子物质，通过普通比色计检测其浓度，计算取得相应纳豆激酶活力，数据稳定，重复性强。
测定简单，检测成本低，有国家标准为依据。
1）琼脂糖一纤维蛋白平板法是，是目前最常用的纤溶酶溶栓活力测定方法，此法的原理是用琼脂糖作为固体支持，以凝血酶和纤维蛋白原制做人工血栓平板，注入NK，用溶解圈垂直直径的乘积(mm2)表示纤溶活力，以标准UK或纤溶酶为标准品作标准曲线，计算出NK的活性相当于标准品的单位数。
此法简便易行，并可同时测定多个样品，但由于溶解圈面积受恒温反应时间的影响很大，所以对恒温时间的控制十分重要，且恒温时间对粗制酶活性测定的影响比对NK精制产品活性测定的影响大。
2）在直径15mm的硅化试管中依次加入pH值为7.7的咪唑缓冲液、纳豆激酶收集液、凝血酶和纤维蛋白原，立即振摇数秒，使之产生絮状物，置38℃水浴30 min，置冰水中终止反应。
用100目尼龙网过滤试管中未溶解的纤维蛋白，滤纸吸干，用蒸馏水漂洗，再用滤纸吸干，放入小试管中，再加3mL浓度为O．2 mol/L的NaOH溶液，在沸水中煮15min，冷却。
用分光光度计测定溶液在280nm处的吸光值，并根据活力计算公式计算纤溶活力。
纳豆激酶活力=A对照−A样0.5ml×30min×3×1000ug。
纳豆知识纳豆（natto），学名枯草菌。
日本传统的做法是把煮熟的大豆趁热装在用纳豆菌做成的稻草器皿里，利用稻草上附着的纳豆菌自然发酵而做成的。
用这种方法做成的纳豆中，除了纳豆菌以外，还含有其他杂菌，不仅卫生不过关，而且质量也不好。
1980年的一天，正在美国芝加哥罗宾斯研究所从事血栓研究工作的日本须见洋行教授在比较230多种食品后，赫然发现仅有纳豆菌食品含高浓度的血栓溶解成份。
他将脑血栓患者常服用的溶血栓药物放在定量的人造血栓上，结果耗费一个晚上的时间才能完全溶解，而以同样方法换上一粒纳豆菌食品则只需3小时便可完成。
纳豆激酶，可直接分解血栓，每克湿纳豆溶栓效果相当于尿激酶1600IU。
纳豆激酶对血栓的作用时间长达8-12小时，而尿激酶作用时间只有30分钟。
尿激酶只能注射，纳豆激酶即可注射也可口服，而且可以在毛细血管中发挥作用。
纳豆在日本已食用1000年，是一种安全的食用血栓预防剂。
纳豆和纳豆激酶的生产工艺纳豆的生产过程：精选小粒黄豆→清洗→蒸煮→沥干→降温至恒温→接种→低温培养→分装→冷冻保存→纳豆纳豆是日本的传统食品，是选用优质黄豆经纳豆菌生物发酵而成。
纳豆的外表带有一层白霜，用筷子搅拌时，会拉出粘丝，拉丝越多越好。
这些拉丝所含有的成份大都就是纳豆激酶。
现在市场上销售的纳豆产品因为保存期过长失去大部分功效或者价格过高，所以目前最行之有效的办法就是用科技提取制作，这个技术目前国有只有上海顶舜颖生物科技有限公司所掌握和运用。
这样制作才能满足人体每天2000FU以上的需求。
一、使用器皿和材料①大豆500g②纳豆菌种5g③高压锅④不锈钢盆⑤泡沫饭盒等浅容器⑥泡沫箱子⑦2立升长方形塑胶瓶子或暖水袋⑧温度计二、泡豆蒸豆将大豆充分洗净后，加入3倍量的水浸泡一夜后，倒掉水放进高压锅内蒸到大豆用手捏碎的程度，大约45分钟。
如没有高压锅，煮水时一次不要放得太多。
为了保持大豆的原汁原味，最好是蒸。
三、接种纳豆菌将纳豆菌种用50ml热水（温度最好38-45℃，温度太高会杀死纳豆菌）溶解后，均匀地加入到热大豆中（温度最好38-45℃，温度太高会杀死纳豆菌），迅速搅拌均匀，分装在7个泡沫饭盒里，厚度大约2cm，上面苫上纱布或者在饭盒与饭盒盖之间架上一双筷子，使其充分接触空气。
纳豆激酶(NattoKinase, NK)酶活检测1）生理盐水：0.9% NaCl蒸馏水溶解配制称取3.6g NaCl，加入蒸馏水400mL，振荡即可溶解，溶液为无色透明状2）PBS：0.01mol/L 磷酸缓冲溶液配制方法：①A液（0.01mol/L磷酸二氢钠水溶液）：NaH2PO4·2H2O 1.56g，溶于蒸馏水中，定容1000mL。
②B液（0.01mol/L磷酸氢二钠水溶液）：Na2HPO4·7H2O 2.68g （或Na2HPO4·12H2O 3.58g 或Na2HPO4·2H2O 1.78g）加蒸馏水溶解，并定容至1000mL。
③pH=7.2磷酸盐缓冲液（PBS）缓冲液的配制上述两种溶液均无色透明，按照体积比2∶1混合Na2HPO4与NaH2PO4，所得PBS 溶液pH值为7.8。
在28.0mL A 液中，加入72.0mL B 液，为0.01mol/L PBS 溶液。
3）工作溶液：将0.01mol/L 磷酸缓冲液和生理盐水按照1：17 的体积比例配制即可。
PBS∶生理盐水=1∶174）琼脂糖：1.5%，工作溶液溶解配制称取0.75g琼脂糖粉，加入50mL工作溶液，混匀，微波炉内中低火力加热1min，使琼脂糖充分溶解，溶液呈完全流动、透明状态，将琼脂糖溶液放置在55℃水浴保温。
5）凝血酶：10U/mL，生理盐水溶解配制将1000U 凝血酶溶于1mL 超纯去离子水中，震荡混匀，用移液枪取100μL用0.9%生理盐水配制成10U/mL，于-20℃条件下保存一个月，仍可使用。
6）纤维蛋白原：0.15%，工作溶液①纤维蛋白原试管短暂离心，量取66.7mL工作溶液，将纤维蛋白原粉倒入工作溶液，可观察到，纤维蛋白原为干粉，容易倒出。
②最初，纤维蛋白原粉漂浮在溶液上面，轻轻振荡，纤维蛋白原粉分散下沉，可明显看到悬浮小碎片，室温放置数分钟，可观察到悬浮小碎片明显减少。
Hans Journal of Food and Nutrition Science 食品与营养科学, 2020, 9(2), 132-136Published Online May 2020 in Hans. /journal/hjfnshttps:///10.12677/hjfns.2020.92017Methods for Assay of Nattokinase Activityand the Dosage of DietaryYanchun Liu, Lingyun Cai, Xiuling Wang, Shijuan Dou*College of Life Sciences, Hebei Agricultural University, Baoding HebeiReceived: Mar. 17th, 2020; accepted: Apr. 2nd, 2020; published: Apr. 9th, 2020AbstractNatto, which is a must-have food in Japan, has a long history and a unique flavor. Natto has various functions, among which the thrombolytic effect of nattokinase has attracted much attention. A lot of methods have been used to assay the activity of nattokinase. The article summarizes five main methods, including fibrin plate method, fibrin degradation method, casein degradation method, synthetic substrate method and enzyme-linked immunoassay. At present, fibrin plate method and fibrin degradation method are being used commonly. By comparing different methods for assay-ing nattokinase activity, we hope that the assay method can be unified and a uniform standard for dietary dosage of natto produced by different companies can be put forward.KeywordsNatto, Nattokinase, Methods of Nattokinase Activity, Dosage of Dietary纳豆激酶活性测定方法和膳食用量刘艳春，蔡凌云，王秀伶，窦世娟*河北农业大学，生命科学学院，河北保定收稿日期：2020年3月17日；录用日期：2020年4月2日；发布日期：2020年4月9日摘要纳豆历史悠久，风味独特，在日本已成餐桌必备食品。
纳豆有多种功能，其中人们关注最多的是纳豆激酶的溶栓效果。
纳豆激酶活性测定方法多样，本文总结了主要的五种测定方法：纤维蛋白平板法、纤维*通讯作者。
刘艳春等蛋白分解法、酪蛋白分解法、合成基质法和酶联免疫法，目前以纤维蛋白平板法和纤维蛋白分解法应用较为普遍。
本文对纳豆激酶活性测定方法进行分析，以期统一纳豆激酶测定方法，并为不同厂家纳豆膳食用量提供统一标准。
关键词纳豆，纳豆激酶，活性测定方法，膳食用量Copyright © 2020 by author(s) and Hans Publishers Inc.This work is licensed under the Creative Commons Attribution International License (CC BY 4.0)./licenses/by/4.0/1. 引言发酵豆制品最早起源于我国，其中豆豉制作历史可追溯到先秦时期。
唐朝初期，鉴真东渡时将豆豉传至日本，因此纳豆在日本又被称为“日本豆豉”。
大豆发酵品在日本不断进行工艺改良，后来出现了一种叫纳豆(Natto)的大豆发酵品。
纳豆风味独特，具有很多功能性物质，如纳豆激酶、超氧化物歧化酶(SOD)、谷胱甘肽过氧化物酶、大豆异黄酮、血管紧张素转化酶抑制剂和小分子多肽等，具有溶解血栓凝块、降血压、抗氧化以及促进胃肠道健康等多种功能[1][2][3]。
随着全球人口老龄化问题的加剧，提高老年人的健康水平，增强其幸福指数，预防人类第一大杀手－心脑血管疾病显得尤为重要。
世界卫生组织公布的资料显示，日本人的平均寿命84岁，中国平均寿命目前只有76岁。
在55~64岁的男性中，日本心脑血管疾病发病率仅为0.4%，而中国为30%。
在日本几乎90%的人群每天都在食用纳豆，因此，有学者认为，日本心脑血管疾病发病率低与日本国民长期食用传统发酵食品纳豆有很大关系。
纳豆激酶(Nattokinase, NK, E.C.3.4.21.62)是由纳豆菌(Bacillus sublitis natto)生产的一种蛋白质。
1987年日本学者Sumi从纳豆中分离提取和纯化出一种具有纤溶活性的蛋白激酶，称为纳豆激酶，由275个氨基酸组成，分子量27.7 kD [4]，1992年Ichishima E.实验室获得该基因序列[5]。
纳豆激酶是一种丝氨酸蛋白酶[6]，与其他溶栓试剂相比，如尿激酶，组织纤溶酶原激活剂(Tissue-type plasminogen activator, t-PA)和链激酶，纳豆激酶在预防和延长疗效方面具有优势，并且胃肠道副作用少，稳定性好[7]。
纳豆激酶对氧化损伤介导的动脉血栓和炎症引起的静脉血栓均有良好的作用。
纳豆激酶只溶解血栓的主体物质纤维蛋白，不水解血浆纤维蛋白原，因此，不会出现传统溶栓药引发出血的危险，这一点是临床溶栓药剂所普遍缺失的[8]。
纳豆激酶作为功效成分已于2014年获得国家级批准(2015纳豆与纳豆激酶发展论坛新闻发布会)，纳豆激酶在中国发展前景广阔。
我国一直缺乏纳豆激酶相关生产规范，在功能检测与溶栓效果上缺少统一标准，导致产业鱼龙混杂、良莠不齐。
因此，开发纳豆激酶相关产品，并对产品中纳豆激酶活性进行测定具有非常重要的现实意义。
本文对各种纳豆激酶测定方法进行了总结和比较，以期获得最佳和统一的纳豆激酶测定方法，为不同产品膳食用量提供依据。
2. 纳豆激酶测定方法2.1. 纤维蛋白平板法纤维蛋白平板法根据1952年Astrup建立的方法改进而来[9]，主要原理是以琼脂糖作为相应的骨架，加入相应浓度的凝血酶和纤维蛋白原，二者相互作用，从而在琼脂糖平板上形成人工血栓。
纳豆激酶能将刘艳春等人纤维蛋白降解为可溶性的纤维蛋白片段，因此便会有溶解圈出现，根据溶解圈的直径，推测纳豆激酶活力强弱。
具体方法如下：10 mL琼脂糖溶液(1%)和10 mL牛纤维蛋白原溶液(1.8 mg/mL, 50mM Tris-HCl缓冲液)分别在60℃下培养；10 U凝血酶加入琼脂糖溶液混合；然后再和纤维蛋白原混合；在室温下放置2小时，形成纤维蛋白凝块；纤维蛋白板上打孔，每孔加酶液40 μL，置于37℃下4小时以检测激酶的纤溶活性[10]。
该方法直观简便，可同时测定多个样品，但受时间、温度以及产品纯度影响较大，检测误差大，灵敏度低，适合定性试验。
另外，纤维蛋白原和凝血酶价格高导致检测成本难以降低。
该方法还可以以尿激酶为标准曲线，通过测定纤维蛋白板透明圈的直径，定量分析纤维蛋白溶解活性，比活力单位U/mg [11]。
2.2. 纤维蛋白分解法采用日本纳豆激酶协会描述的方法测定纤维蛋白溶解活性。
将1.4 mL Tris-HCl (0.05 mol/L, pH 8.0)和0.4 mL纤维蛋白原溶液(0.72%)在37℃水浴中预培养5 min；添加0.1 ml凝血酶溶液(20 U/mL)；10分钟后添加0.1 mL稀释样品；在37℃下培养60 min；最后，添加2 ml三氯乙酸溶液(0.2 mol/L)，在37℃下培养20分钟以停止反应；对照为37℃培养60 min后，将含有纳豆激酶的稀释样品和三氯乙酸溶液加入纤维蛋白底物溶液中；12,000 rpm，室温离心10 min，将上清液转移到微型试管中，读取并记录275 nm处上清液的吸光度。
酶的活力单位FU (Fibrin degradation unit)每分钟OD275 nm值增加0.01个单位为一个酶的活力单位[10]。
该方法为纳豆激酶的天然基质，适合定量试验，且数据稳定，重复性好；缺点是测定时间长，成本高。
2.3. 酪蛋白分解法根据Folin-酚测定法，定量检测样品中纤溶酶活性。
蛋白酶水解酪蛋白产生酪氨酸，在碱性条件下，酪氨酸与Folin-酚试剂反应生成蓝色物质，于680 nm处比色测定光吸收值，计算酶活力。
具体方法如下：0.5%酪蛋白2 Ml (35℃预热5 min)，粗酶液1 mL，35℃反应10 min (严格控制时间)，3 mL 10% TCA终止反应，放置15 min，过滤，加0.55 mol/L Na2CO3 5 mL，Folin-酚1 mL，35℃水浴15 min，680 nm比色[12]。
酶的活力单位CU (Casein degradation unit)规定为酶在温度35℃、pH7.5时，单位时间、单位体积产物生成的量为一个活力单位。
优点：简单易行，可同时测多个样品，成本低；缺点：该方法测定的是所有蛋白酶的活性，无法单独测出纳豆激酶活性，且需严格控制酶解时间。
2.4. 合成基质法“纳豆之父”－须见洋行博士(Dr. Hiroyuki Sumi)一直致力于纳豆研究工作，根据纳豆激酶的特性，提出合成基质反应法(国际单位是IU)。
这个方法不但结果稳定、测定时间短，更重要的是它可以区分出真正的纳豆激酶与其他类似的酵素。
日本已经采用了该分析方法，在美国、台湾等地区，越来越多的业内人士也开始使用IU这一标准(/a/100707/1378854.html)。
2.4.1. 四肽底物法四肽底物法是根据胰凝乳蛋白酶活测定方法改进而来[13]。
在溶液中加入琥珀酰丙氨酰丙氨酰脯氨酰苯丙氨酰对硝基苯胺(N-Succinyl-Ala-Ala-Pro-Phe-p-Nitroanilide)作为底物，加入酶液，于37℃水浴孵育1 min，测定单位时间内410 nm处光吸收的变化。
