2012 Winning Western blot 资料
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高效抽提胞质、膜性、胞核和骨架蛋白，适合蛋白定位研究，兼容2D、WB、活性分析、ELISA 及MS等。
Actin Wash Nuclei Mitoch. ER Cytosol
Step 1
Cytosolic Fraction
Step 2 Membrane Fraction Step 3 Nuclear Fraction
更大的比表面积，更高的蛋白载量 特别适合<20kDa 的蛋白
0.45 µm
比表面积较小而背景较低 更加常用，适合>20kDa 的蛋白
推荐用于低丰度蛋白检测
产品名称 Immobilon-P Immobilon-PSQ
孔径 0.45 µm 0.2 µm
厚度 140 µm 200 µm
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
起始样本的准备
你的蛋白从哪里来？ 细胞培养上清 细胞裂解液 组织匀浆 血清 血浆 表达系统 前处理… 初步裂解 去除核酸 预分级
1
st
纯化蛋白
免疫共沉淀获得的样品 Catch & Release IP System
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
ProteoExtract® 白蛋白/IgG高丰度蛋白去除试剂盒 PureProteome磁珠法白蛋白/IgG高丰度蛋白去除试剂盒
Albumin/IgG
P
Unbound Bound
Removal kit
HSA
IgG light chain
蛋白样品制备
有SDS
无SDS 有SDS 无SDS
电泳
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体孵育 显色
变性SDS-PAGE胶分离蛋白质分子的范围 6%
200 kDa 100 kDa 90 kDa 80 kDa 70 kDa 60 kDa 50 kDa 40 kDa 30 kDa 20 kDa 10 kDa
8%
10%
12%
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体孵育 显色
甲醇—— 胶的稳定剂
防止胶皱缩——蛋白条带更漂亮 降低蛋白转移速度，使蛋白与膜的结 合时间延长
SDS—— 使蛋白带上负电荷
使蛋白快速穿过膜
包裹蛋白，减少蛋白与膜的 有效作用和附着
减少蛋白沉淀，有利于疏水 性蛋白转移
使蛋白与SDS解离，增加蛋白与膜的 相互作用
抗体孵育
显色
Pellicon XL
200 mL
Amicon Ultra-0.5,-2, -4 Amicon Ultra-15 Centricon Plus-70
-
2L
Prep/Scale Pellicon 2
<1 mL
1
– 4 mL 4
–
30 mL 30
-
420 mL
Stirred Cells
2
–
10 L
2
nd
浓缩及缓冲液置换
浓缩 Amicon Ultra系列浓缩管 透析 D-tube透析/电洗脱管
3
rd
去除高丰度蛋白的样品 ProteoExtract白蛋白/IgG去 除试剂盒 PureProteome 白蛋白/IgG 磁珠法去除试剂盒 经亲和纯化获得的表达蛋白 His· Tag、GST· Tag， Strep· Tag等
转膜
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体孵育 显色
蛋白出胶并结合到膜上 考虑重点
– 转膜方式和时间 – 转膜缓冲液 – 膜的种类
Wet Tank System
– 蛋白样品的分子量，电荷及复杂程度（如翻 译后加工）等
Semi-Dry Tank System
转膜缓冲液：甲醇 & SDS的重要作用
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
NucBuster® 核蛋白抽提试剂
30分钟高效抽提核蛋白，兼容下游各种研究
整个抽提过程在一个试管中完成，确保产量 和数据的一致性
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
ProteoExtract细胞骨架蛋白富集与染色试剂盒——最新上市
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
Catch and Release免疫沉淀试剂盒
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
His· Tag、GST· Tag、S· Tag、Strep· Tag纯化
His· Tag纯化
Strep· Tag纯化
缓冲液置换 & 样品浓缩
样品制备 电泳 转膜 封闭
甲醇
SDS
转移时间
膜的孔径
小蛋白/多肽
大蛋白、疏水性蛋白
0.22 um
0.45 um
一般SDS的终浓度不要超过0.05%，甲醇在10-20%之间
膜的种类
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体孵育 显色
Western blotting中两种主要的常用膜
硝化纤维素膜（NC膜）
最早商品化的膜，早期 文献较多 不需要“预湿”处理 脆而易碎 结合载量有限
– 另提供品种齐全的磷酸酶抑制剂混合物
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
Benzonase® 核酸酶
高效去除核酸污染
– 减少样品粘度（减少迁移假象，提高纯化效率等）
– 减少蛋白样品丢失（大、小蛋白）
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
CytoBusterTM 哺乳动物/昆虫细胞蛋白抽提液
F1 F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
ProteoExtract® transmerbrane膜蛋白抽提 试剂盒(TM-PEK)
高效抽提膜蛋白、跨膜蛋白，适合信号通路研究，兼容 2D、WB、IP、活性分析、ELISA及MS等。
•ProteoExtract® 细胞骨架富集及分离试剂盒 （目录号17-10195）：抽提得到的活性细胞骨架 蛋白还可以用于Western Blot，看看某特定蛋白 是否出现在细胞骨架组分中，用于蛋白的细胞定 位分析。 •ProteoExtract® 天然细胞骨架富集及染色试剂 盒 （目录号17-10210，用于4个8-well chamber slides实验）：温和去除杂蛋白，富集骨架蛋白/ 相关蛋白，进行原位IF（免疫荧光）染色，大大 减少了背景蛋白的干扰。
The Secrets of Successful Western Blotting
Proven Strategies to Optimize Your Western Blots
为什么做Western Blot?
目的蛋白是否在相应的组织/细胞 中表达？
目的蛋白在目标组织/细胞中表达 的量和位置上的变化：病理/生理， 药物处理，发育阶段 目的蛋白与其它蛋白的相互作用 （far WB） 重组蛋白表达与否？表达完整性？
15%
电压不稳，加样太多，样品中盐浓度 太高，边缘效应等常见问题
跑胶的质量还涉及以下几个因素：
• 小的电压会使胶的分子筛效应得到 充分发挥。电压越小，条带越漂亮 • 胶越均匀，条带越窄，分离越均匀 • 玻璃板等一定要干净 • 加水隔离时动作轻缓，避免稀释上 层分离胶，使胶不均匀
Marker
• • • • 预染/半预染marker示踪：准确性与方便性 整齐的条带间隔，半定量 WB marker: 内含His / S / Strep· Tag 选用合适的marker和点样位置
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
起始样本的准备
1
st
蛋白酶抑制剂混合物
– 避免蛋白降解，提高WB检测成功率
• PMSF毒性非常大，活性稳定性差
– 不同物种选择不同品种
• 原核，真核，真菌或植物
– 更方便的使用
• • • • 即用液体型广谱抑制剂混合物 浓缩型可以保存1年以上，稳定性好 毒性小，操作方便 配方公开，便于下游应用评估
抽提可溶蛋白，替代超声处理，更好保证蛋白完整性，与电泳兼容
ProteoExtract® 全蛋白质组抽提试剂盒
优化配方，温和的非离子型去污剂配方，不需要超速离心获取膜蛋白、 骨架蛋白等 Human HepG2-Cells Dog adrenal gland
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
比表面积 400 1300
蛋白结合能力 ** 100 270
** ug BSA/cm2
小蛋白的转移
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体孵育 显色
半干法转膜，减少转膜时间 采用0.2 µm PVDF膜（如Immobilon PSQ ）转印<20 kDa的小蛋白
在转膜缓冲液中预平衡胶和膜以去除SDS，使蛋白更好地与膜结合，但对于小蛋白平衡时间 不要超过10min分钟为宜（其它可为15min），以免小蛋白被洗脱
（琼脂糖珠或磁珠）
浓缩/缓冲液置换
生色
化学发光
荧光
WB成功的核心要素
有足够的目的蛋白结 合的膜上
优质的蛋白样本，足够的目的蛋 白从胶转移到膜上并一直保持有 效结合
+
抗体与抗原的有效 结合
膜上的蛋白必须可以被抗体检测， 采用正确的抗体，抗体必须具备较 高的特异性亲和力
高效检测
最后为了获得可见的数据，必须保证检测系统的有效性
PVDF膜 (聚偏二乙烯氟化物)
由Millipore开发
物理性能优越，质地柔韧，易于保 存
可用于多次剥离和杂交，更有利于 数据分析 化学稳定性好，耐腐蚀，不易降解 结合载量更高 透视法观察蛋白，比染色更简便易 行
Actin Wash Nuclei Mitoch. ER Cytosol
Step 1
Cytosolic Fraction
Step 2 Membrane Fraction Step 3 Nuclear Fraction
更大的比表面积，更高的蛋白载量 特别适合<20kDa 的蛋白
0.45 µm
比表面积较小而背景较低 更加常用，适合>20kDa 的蛋白
推荐用于低丰度蛋白检测
产品名称 Immobilon-P Immobilon-PSQ
孔径 0.45 µm 0.2 µm
厚度 140 µm 200 µm
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
起始样本的准备
你的蛋白从哪里来？ 细胞培养上清 细胞裂解液 组织匀浆 血清 血浆 表达系统 前处理… 初步裂解 去除核酸 预分级
1
st
纯化蛋白
免疫共沉淀获得的样品 Catch & Release IP System
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
ProteoExtract® 白蛋白/IgG高丰度蛋白去除试剂盒 PureProteome磁珠法白蛋白/IgG高丰度蛋白去除试剂盒
Albumin/IgG
P
Unbound Bound
Removal kit
HSA
IgG light chain
蛋白样品制备
有SDS
无SDS 有SDS 无SDS
电泳
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体孵育 显色
变性SDS-PAGE胶分离蛋白质分子的范围 6%
200 kDa 100 kDa 90 kDa 80 kDa 70 kDa 60 kDa 50 kDa 40 kDa 30 kDa 20 kDa 10 kDa
8%
10%
12%
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体孵育 显色
甲醇—— 胶的稳定剂
防止胶皱缩——蛋白条带更漂亮 降低蛋白转移速度，使蛋白与膜的结 合时间延长
SDS—— 使蛋白带上负电荷
使蛋白快速穿过膜
包裹蛋白，减少蛋白与膜的 有效作用和附着
减少蛋白沉淀，有利于疏水 性蛋白转移
使蛋白与SDS解离，增加蛋白与膜的 相互作用
抗体孵育
显色
Pellicon XL
200 mL
Amicon Ultra-0.5,-2, -4 Amicon Ultra-15 Centricon Plus-70
-
2L
Prep/Scale Pellicon 2
<1 mL
1
– 4 mL 4
–
30 mL 30
-
420 mL
Stirred Cells
2
–
10 L
2
nd
浓缩及缓冲液置换
浓缩 Amicon Ultra系列浓缩管 透析 D-tube透析/电洗脱管
3
rd
去除高丰度蛋白的样品 ProteoExtract白蛋白/IgG去 除试剂盒 PureProteome 白蛋白/IgG 磁珠法去除试剂盒 经亲和纯化获得的表达蛋白 His· Tag、GST· Tag， Strep· Tag等
转膜
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体孵育 显色
蛋白出胶并结合到膜上 考虑重点
– 转膜方式和时间 – 转膜缓冲液 – 膜的种类
Wet Tank System
– 蛋白样品的分子量，电荷及复杂程度（如翻 译后加工）等
Semi-Dry Tank System
转膜缓冲液：甲醇 & SDS的重要作用
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
NucBuster® 核蛋白抽提试剂
30分钟高效抽提核蛋白，兼容下游各种研究
整个抽提过程在一个试管中完成，确保产量 和数据的一致性
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
ProteoExtract细胞骨架蛋白富集与染色试剂盒——最新上市
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
Catch and Release免疫沉淀试剂盒
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
His· Tag、GST· Tag、S· Tag、Strep· Tag纯化
His· Tag纯化
Strep· Tag纯化
缓冲液置换 & 样品浓缩
样品制备 电泳 转膜 封闭
甲醇
SDS
转移时间
膜的孔径
小蛋白/多肽
大蛋白、疏水性蛋白
0.22 um
0.45 um
一般SDS的终浓度不要超过0.05%，甲醇在10-20%之间
膜的种类
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体孵育 显色
Western blotting中两种主要的常用膜
硝化纤维素膜（NC膜）
最早商品化的膜，早期 文献较多 不需要“预湿”处理 脆而易碎 结合载量有限
– 另提供品种齐全的磷酸酶抑制剂混合物
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
Benzonase® 核酸酶
高效去除核酸污染
– 减少样品粘度（减少迁移假象，提高纯化效率等）
– 减少蛋白样品丢失（大、小蛋白）
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
CytoBusterTM 哺乳动物/昆虫细胞蛋白抽提液
F1 F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4 F1 F2 F3 F4
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
ProteoExtract® transmerbrane膜蛋白抽提 试剂盒(TM-PEK)
高效抽提膜蛋白、跨膜蛋白，适合信号通路研究，兼容 2D、WB、IP、活性分析、ELISA及MS等。
•ProteoExtract® 细胞骨架富集及分离试剂盒 （目录号17-10195）：抽提得到的活性细胞骨架 蛋白还可以用于Western Blot，看看某特定蛋白 是否出现在细胞骨架组分中，用于蛋白的细胞定 位分析。 •ProteoExtract® 天然细胞骨架富集及染色试剂 盒 （目录号17-10210，用于4个8-well chamber slides实验）：温和去除杂蛋白，富集骨架蛋白/ 相关蛋白，进行原位IF（免疫荧光）染色，大大 减少了背景蛋白的干扰。
The Secrets of Successful Western Blotting
Proven Strategies to Optimize Your Western Blots
为什么做Western Blot?
目的蛋白是否在相应的组织/细胞 中表达？
目的蛋白在目标组织/细胞中表达 的量和位置上的变化：病理/生理， 药物处理，发育阶段 目的蛋白与其它蛋白的相互作用 （far WB） 重组蛋白表达与否？表达完整性？
15%
电压不稳，加样太多，样品中盐浓度 太高，边缘效应等常见问题
跑胶的质量还涉及以下几个因素：
• 小的电压会使胶的分子筛效应得到 充分发挥。电压越小，条带越漂亮 • 胶越均匀，条带越窄，分离越均匀 • 玻璃板等一定要干净 • 加水隔离时动作轻缓，避免稀释上 层分离胶，使胶不均匀
Marker
• • • • 预染/半预染marker示踪：准确性与方便性 整齐的条带间隔，半定量 WB marker: 内含His / S / Strep· Tag 选用合适的marker和点样位置
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
起始样本的准备
1
st
蛋白酶抑制剂混合物
– 避免蛋白降解，提高WB检测成功率
• PMSF毒性非常大，活性稳定性差
– 不同物种选择不同品种
• 原核，真核，真菌或植物
– 更方便的使用
• • • • 即用液体型广谱抑制剂混合物 浓缩型可以保存1年以上，稳定性好 毒性小，操作方便 配方公开，便于下游应用评估
抽提可溶蛋白，替代超声处理，更好保证蛋白完整性，与电泳兼容
ProteoExtract® 全蛋白质组抽提试剂盒
优化配方，温和的非离子型去污剂配方，不需要超速离心获取膜蛋白、 骨架蛋白等 Human HepG2-Cells Dog adrenal gland
蛋白样品制备
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体检测 显色
比表面积 400 1300
蛋白结合能力 ** 100 270
** ug BSA/cm2
小蛋白的转移
样品制备 电泳 转膜 封闭 抗体孵育 显色
半干法转膜，减少转膜时间 采用0.2 µm PVDF膜（如Immobilon PSQ ）转印<20 kDa的小蛋白
在转膜缓冲液中预平衡胶和膜以去除SDS，使蛋白更好地与膜结合，但对于小蛋白平衡时间 不要超过10min分钟为宜（其它可为15min），以免小蛋白被洗脱
（琼脂糖珠或磁珠）
浓缩/缓冲液置换
生色
化学发光
荧光
WB成功的核心要素
有足够的目的蛋白结 合的膜上
优质的蛋白样本，足够的目的蛋 白从胶转移到膜上并一直保持有 效结合
+
抗体与抗原的有效 结合
膜上的蛋白必须可以被抗体检测， 采用正确的抗体，抗体必须具备较 高的特异性亲和力
高效检测
最后为了获得可见的数据，必须保证检测系统的有效性
PVDF膜 (聚偏二乙烯氟化物)
由Millipore开发
物理性能优越，质地柔韧，易于保 存
可用于多次剥离和杂交，更有利于 数据分析 化学稳定性好，耐腐蚀，不易降解 结合载量更高 透视法观察蛋白，比染色更简便易 行
