土壤中微生物的分离与鉴定实验报告

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Sdu微生物大实验

土壤微生物的分离纯化与鉴定

【实验目的】

1、 从各地区土壤中筛选含几丁质酶的真菌及含果胶酶的菌株；

2、通过从土壤中分离纯化菌株，掌握培养基的制备与灭菌技术、微生物的筛选、分离纯化方法和无菌操作技术。

3、复习以前学过的各种染色方法，掌握生理生化试验的原理与方法。

4、 掌握微生物的鉴定技术、菌种保藏技术。

【实验原理】

1、 微生物的分离与纯化：从混杂的微生物群体中获得只含有某一种或某一株微生物的过程称为微生物的分离与纯化。此次实验采取平板分离法，该方法操作简便，普遍用于微生物的分离与纯化，其基本原理主要包括两个方面：a.选择适合于待分离微生物的生长条件或加入某种抑制剂造成只利于待分离微生物生长，而抑制其它微生物生长的环境，从而淘汰大部分不需要的微生物。 b.微生物在固体培养基上生长形成的单个菌落可以是由一个细胞繁殖而成的集合体，因此可通过挑取单菌落而获得一种纯培养。获得单菌落的方法 可通过稀释涂布平板法或平板划线法等技术来完成。 微生物的观察可以用显微镜观察其细胞形态，

也可以用肉眼观察其菌落形态。 前者是微生物的显微镜观察技术，后者是微生物的肉眼观察技术。

2、霉菌：霉菌可产生复什分枝的菌丝体，分基内菌丝和气生菌丝，气生菌丝生长到一定阶段分化产生繁殖菌丝，由繁殖菌丝产生孢子。霉菌菌丝体（尤其是繁殖菌丝）及孢子的形态特征是识别不同种类霉菌的重要依据。霉菌菌丝和孢子的宽度通常比细菌和放线菌粗得多（约 3-10μm ），常是细菌菌体宽度的几倍至几十倍，因此，用低倍显微镜即可观察。观察霉菌的形态有多种方法，常用的有直接制片观察法、载玻片培养观察法和玻璃培养观察法三种方法，本实验采用载玻片培养观察法。

3、 果胶酶筛选培养基：配制以果胶为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用果胶的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产果胶酶的菌株。刚果红（Congo

Red,简称CR）是一种染料，它可与果胶形成红色复合物，但并不和果胶水解后的产物发生这种显色反应，在含有果胶的培养基中加入刚果红时，刚果红能与培养基中的果胶形成红色复合物。当果胶被果胶分解菌分泌的果胶酶分解后，刚果红-果胶的复合物就将无法形成，从而在培养基中形成以果胶分解菌为中心的透明圈，这样我们就可以通过是否产生透明圈来筛选果胶分解菌。

4、 几丁质酶筛选培养基：配制以几丁质为唯一碳源的筛选培养基，在该培养基上，只有能分解利用几丁质的菌株才能够生长，依此来从土壤中筛选出能够产几丁质酶的菌株。因为几丁质不能溶解于培养基，故在固体培养基平板上表现为浑浊，若菌株能够产生几丁质酶，2

则在培养基中形成以菌落为中心的透明圈，因此可以通过是否产生透明圈来筛选几丁质酶产生菌株。为筛选到真菌，采用加入链霉素来抑制细菌生长。

5、稀释涂布平板法：由于将含菌材料现加到还较烫的培养基中再倒平板易造成某些热敏感菌的死亡，而且采用稀释倒平台法也会使一些严格好氧菌因被固定在琼脂中间缺乏氧气而影响其生长，因此在微生物学研究中更常用的纯种分离方法是涂布平板法。

6、平板菌落计数法：平板菌落计数法是将待测样品经适当稀释之后，其中的微生物充分分散成单个细胞，取一定量的稀释样液接种到平板上，经过培养，由每个单细胞生长繁殖而形成肉眼可见的菌落，即一个单菌落应代表原样品中的一个单细胞。统计菌落数，根据其稀释倍数和取样接种量即可换算出样品中的含菌数。但是，由于待测样品往往不易完全分散成单个细胞，所以，长成的一个单菌落也可能来自样品中的2—3或更多个细胞。因此平板菌落计数的结果往往偏低。为了清楚地阐述平板菌落计数的结果，现在已倾向使用菌落形成单位(cfu)而不以绝对菌落数来表示样品的活菌含量。

7、平板划线法：平板划线分离法是指把混杂在一起的微生物或同一微生物群体中的不同细胞用接种环在平板培养基表面通过分区划线稀释而得到较多独立分布的单个细胞，经培养后生长繁殖成单菌落，通常把这种单菌落当作待分离微生物的纯种。有时这种单菌落并非都由单个细胞繁殖而来的，故必须反复分离多次才可得到纯种。其原理是将微生物样品在固体培养基表面多次作“由点到线”稀释而达到分离目的的。

8、革兰氏染色 ：G+、G-细菌的细胞壁成分和结构不同。G+的细胞壁主要有肽聚糖形成的网状结构组成，在染色过程中，当用95%乙醇处理时，由于脱水而引起网状结构中的孔径变小，细胞壁通透性降低，使结晶紫-碘复合物被保留在细胞壁内而不易脱色，因此呈蓝紫色。G-的细胞壁中肽聚糖含量低，脂类物质含量高，当用乙醇处理时，脂类物质溶解，细胞壁的通透性增加，使结晶紫-碘复合物容易被乙醇抽提出来而脱色，然后又被染上了复染剂的颜色，因此呈现红色。

9、载玻片培养法（小室法）： 用无菌操作将培养基琼脂薄层置于载玻片上，接种后盖上盖玻片培养，霉菌即在载玻片和盖玻片之间的有限空间内沿盖玻片横向生长。培养一定时间后，将载玻片上的培养物置于显微镜下观察。这种方法既可以保持霉菌自然生长状态，还便于观察不同发育期的培养物。

10、 细菌芽孢染色：某些细菌在其发育的一定阶段可以形成一个内生孢子，即为芽孢。芽孢形成后并不脱离原细菌菌体，它的形状、大小和在菌体的位置都是一定的。成熟的芽孢可自菌体中脱落出来。芽孢结构上的特点是壁厚和细胞质浓厚，所以不易着色，通常多采用着色力强的染色剂和用加热等手段促使芽孢着色，并利用复染的方法对比原细菌菌体和芽孢，才易于在显微镜下看到它们。但是，若用简单染色法使菌体着色而芽孢无色也可以衬托出芽孢的形状、大小和位置。细菌的芽孢含水量少，脂肪含量高，芽孢壁较厚，对染料的透性差，不易着色，但是一旦着色又难以脱色。通常，芽孢染色采用弱碱性染料孔雀绿在加热的条件下进行。染色完毕，用蒸馏水冲洗。因孔雀绿是弱碱性染料，与菌体结合力较差，3

因此易被水冲洗掉，而进入芽孢的孔雀绿却难于溶出。水洗后，再用一种呈红色的碱性染料复染，使菌体和芽孢呈现不同颜色。

11、 细菌穿刺实验：将细菌穿刺培养于半固体培养基中，经培养后，无鞭毛的细菌沿穿刺线生长，穿刺线清晰；有鞭毛的细菌沿穿刺线向四周扩散，穿刺线模糊不清。

12、 微生物的生理生化反应原理：在所有生活细胞中存在的全部生物化学反应称之为代谢。

代谢过程主要是酶促反应过程。许多细菌产生胞外酶，这些酶从细胞中释放出来，以催化细胞外的化学反应。各种细菌由于具有不同的酶系统，致使它们能利用不同的底物，或虽然可以利用相同的底物，却产生不同的代谢产物，因此可以利用各种生理生化反应来鉴别细菌。

大分子水解：

微生物对大分子的淀粉、油脂不能直接利用，必须靠产生的胞外酶将大分子物质分解后才能被微生物吸收利用。微生物的胞外酶（如淀粉酶、脂肪酶等）主要为水解酶，将大分子物质分解的过程可以通过观察细菌菌落周围的物质变化来证实。

① 淀粉水解实验：

淀粉遇碘液会产生蓝色。若该细菌能分泌胞外淀粉酶，则能利用其周围淀粉。在碘液染色后，其菌落周围不呈蓝色，而是无色透明圈。

② 油脂水解试验：在固体油脂培养基上接种4种细菌（枯草杆菌，大肠杆菌、变形杆菌、铜绿单胞菌），培养两天以后，若菌落表面出现红色斑点，说明脂肪水解，为阳性反应。反之则为阴性。

13、 所分菌种能力检测

1) 将菌种点种在选择培养基上，记录透明圈直径，以区分菌种的能力。

2) 液体酶活检测：DNS法

酶活力单位定义为:

A. 产果胶酶的菌株：规定每ml果胶酶液降解果胶底物每分钟产生1 μg还原糖为1个酶活单位。

B. 产几丁质酶的真菌：在选定反应条件下, 每分钟释放相当于1mol N-乙酰氨基葡萄糖( NAG)NAG 所需酶量为1 个酶活力单位(U).

甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖。具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS试剂发生显色反应。反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中甘露聚糖酶的活力成正比。因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中甘露聚糖酶的活力。

【实验器材】

1、 材料：各处取得的土壤（15号）

2、 菌种：大肠杆菌、金黄色葡萄球菌、产气杆菌、铜绿假单胞菌、枯草芽孢杆菌、普通变形杆菌 4

3、 培养基：几丁质酶筛选培养基，液体PDA培养基，固体PDA斜面培养基，几丁质酶发酵培养基，果胶酶筛选培养基，液体种子、发酵产酶培养基，固体斜面培养基，固体淀粉培养基，固体油脂培养基，葡萄糖发酵培养基，乳糖发酵培养基，蛋白胨水培养基

4、 溶液试剂：香柏油、酒精、甘油、0.85%生理盐水、结晶紫、弗氏碘液、95%乙醇、番红、孔雀绿、蒸馏水

5、 仪器和其他用品：酒精灯、接种环、载玻片、盖玻片、纱布、牛皮纸、漏斗、玻璃珠、试管、三角瓶、烧杯、擦镜纸、双层瓶、光学显微镜、平皿、镊子、滴管、pH试纸、U型管、量筒、称量纸、电子天平、纱布、移液管、玻璃棒、链霉素

【实验步骤】

一、 土样分离：

1. 准备工作

A. 分别于500ml锥形瓶（2个）中配制200ml果胶酶筛选培养基、200ml几丁质酶筛选培养基，加塞包扎。

B. 配制200ml 0.85%的生理盐水。用移液管分别量取9ml生理盐水分装到4只试管中，与另一只空试管一起加塞包扎。另移取90ml生理盐水于300ml锥形瓶中，加入少量洗净的玻璃珠，加塞包扎。

C. 将14个空平皿用牛皮纸包扎。3个1ml移液管用牛皮纸包扎，刮刀一支用牛皮纸包扎。

D. 将上述物品，放入高压灭菌锅中，110度灭菌20-30分钟。

2. 平板制备

A. 待培养基冷却到不烫手后，在几丁质酶筛选培养基中用1ml无菌移液管无菌操作加入0.2ml链霉素。

B. 取果胶酶筛选培养基，无菌操作倒7套平板，其中3套标上10（稀释度），另取3套标上1000，最后一套标上104。

取几丁质酶筛选培养基，无菌操作倒7套平板，其中3套标上0（稀释度），另取3套标上100，最后一套标上1000。

3. 土样处理及稀释

A. 称取土样（15号土样）10g，无菌操作加入到90ml无菌0.85%生理盐水中，震荡均匀，置于30度摇床中摇30min后静置15min。

B. 在已灭菌的空试管中用记号笔标上0（稀释度），其他4支已灭菌装有生理盐水试管分别标上10,100，1000,104（稀释度）。

C. 无菌操作移取土样锥形瓶上清液5mL于标有0字样的试管中，震荡摇匀；再用1ml无菌移液管无菌操作移取标有0试管中的1ml液体，加入标有10字样的试管中，震荡摇匀，此为10倍稀释。

D. 用1ml移液管无菌操作移取1ml 10倍稀释液体于标有100字样试管中，震荡摇匀，5

此为100倍稀释。以此类推，进行1000倍稀释和104倍稀释。

4. 涂布

A. 另取1ml无菌移液管，从104倍稀释液中无菌操作移取0.2ml加入到标有104果胶酶筛选培养基平皿中，用刮刀无菌操作将菌液均匀涂在培养基表面。以此类推，分别从1000倍稀释液和10倍稀释液中移取0.2ml菌液加入到对应稀释度的果胶酶筛选培养基平皿中，并用刮刀涂抹均匀。

B. 另取1ml无菌移液管，从1000倍稀释液中无菌操作移取0.2ml加入到标有1000几丁质酶筛选培养基平皿中，用刮刀无菌操作将菌液均匀涂在培养基表面。以此类推，分别从100倍稀释液和0倍稀释液中移取0.2ml菌液加入到对应稀释度的几丁质酶筛选培养基平皿中，并用刮刀涂抹均匀。