细胞工程

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细 胞 工 程Cell Engineering

生物科学成为当今世界自然科学的热点和重点，主要由于两方面的原因：

(1)二十世纪后叶，分子生物学领域一系列突破性成就，使生命科学在自然科学中的地位发生了革命性的变化。

(2)建立在实验室研究基础上的生物技术的发展为人类带来了巨大的利益和财富。

 生物技术的定义

1982年，国际合作与发展组织的定义为：生物技术是应用自然科学及工程学的原理，依靠微生物、动物、植物体作为反应器将生物材料进行加工以提供产品为社会服务的技术。

美国政府技术顾问委员会(OAT) 的定义是：应用生物或来自生物体的物质制造或改进一种商品的技术，其中还包括改良有重要经济价值的植物与动物和利用微生物改良环境的技术。该定义强调了生物技术的商品属性。

生物技术是指，人们运用现代生物科学、工程学和其他基础学科的知识，按照预先的设计，对生物进行控制和改造或模拟生物及其功能，用来发展商业性加工、产品生产和社会服务的新兴技术领域。

传统生物技术发展阶段

➢ 古代，人们就会利用微生物发酵法来制醋、做酱、醇酒等，但古代人并不知道微生物的存在，更不懂得什么是发酵，他们对微生物利用完全靠着多年来摸索出来的经验。

➢ 19世纪中期，法国微生物学家巴斯德发现了发酵现象，这可以说是生物工程的一个里程碑。

➢ 20世纪初，第一次世界大战期间，人们用发酵法生产原料，制造炸药，从此发酵工业开始出现。

➢ 20世纪40年代发现了青霉素，抗生素工业开始出现。

➢ 20世纪60年代，日本人在制造氨基酸产品时发明了固定化酶连续使用的新技术，于是使酶制剂、氨基酸、核酸、有机酸发酵工业相继获得了发展。 2

现代生物技术发展阶段

➢ 到了20世纪70的代初，随着分子生物学的发展、杂交瘤技术的产生、单克隆抗体的出现、固定化技术的提高，逐渐出现了生物技术（biotechnology）这个词，形成了现代新生物工程。

基因工程

➢ 基因工程是指在微观领域（分子水平）中，根据分子生物学和遗传学原理，设计并实施一项把一个生物体中有用的目的DNA(遗传信息)转入另一个生物体中，使后者获得新的需要的遗传性状或表达所需要的产物，最终实现该技术的商业价值。

稀少珍贵的蛋白质药物

➢ 1982年，美国食品与药物管理局批准了首例基因工程产品——人胰岛素投放市场——它标志了基因工程产品正式进入到商业化阶段。

➢ 人生长激素、表皮生长因子、肿瘤坏死因子、a-干扰素、纤维素酶、抗血友病因子、红细胞生成素、尿激酶原、白细胞介素-2、集落刺激因子、乙肝疫苗等等

 畜牧业中的应用

 动物疫苗、生长激素等

 例：从转基因羊的羊奶中提取出治疗心脏病的药物tPA

 种植业中的应用

 用携带外源基因的农杆菌Ti质粒转化植物原生质体，使外源DNA与植物染色体DNA整合，通过原生质体的培养分化成愈伤组织，最后发育成具有新性状的完整植株—转基因植物

蛋白质工程

➢ “后基因组时代”将是“蛋白质组学时代”，即从对基因信息的研究转向对蛋白质信息的研究，包括研究蛋白质结构、功能与应用及蛋白质相互关系和作用。

➢ 蛋白质工程就是在对蛋白质的化学、晶体学、动力学等结构与功能认识的基础上，对蛋白质人工改造与合成，最终获得商业化的产品。

n 蛋白质工程的主要步骤通常包括：

（1）从生物体中分离纯化目的蛋白；

（2）测定其氨基酸序列；

（3）借助核磁共振和X射线晶体衍射等手段，尽可能地了解蛋白质的二维重组和三维晶体结构;

（4）设计各种处理条件，了解蛋白质的结构变化，包括 折叠与去折叠等对其活性 与功能的影响；

（5）设计编码该蛋白的基因改造方案，如点突变；

（6）分离、纯化新蛋白，功能检测后投入实际使用

 发酵工程



➢ 现代发酵工程主要指利用微生物、包括利用DNA重组技术改造的微生物在全自动发酵罐或生物反应器中生产某种商品的技术。

➢ 现代发酵工程是生物代谢、微生物生长动力学、大型发酵罐或生物反应器研制、化工原理等密切结合和应用的结果。

一般发酵工程包括以下基本步骤：

（1）菌种选育；

（2）细胞大规模培养即发酵过程；

（3）生产活性产物的诱导；

（4）菌体及产物的收获

➢ 发酵工程的产品范围非常广泛。从食品、药品、精细化工产品到许多工业用原料等等，生物可降解塑料PHB等

1 细胞工程的定义

细胞工程 (cell engineering)是以细胞生物学和分子生物学为基础理论，采用原生质体、细胞或组

织培养等试验方法或技术，在细胞水平上研究改造生 3 物遗传特性，以获得具有新的性状的细胞系或生物体以及生物的次生代谢产物，并发展有关理论和技术方法的学科。

细胞工程的核心技术：细胞培养与繁殖

目的：获得新性状、新个体、新物质

第二章 细胞工程基础

一、 细胞壁(cell wall)

与动物细胞不同，植物细胞具有细胞壁及穿壁胞间连丝(plasmodesma)。

对细胞的形态和结构起支撑和保护作用。

正是因为存在这一独特的结构，使得植物遗传的研究与动物遗传研究有了比较大的差异(更困难)，尤其是在进入分子水平或者说是在进行细胞工程和基因工程研究时，这一点尤其突出。

构成植物细胞壁的化学成分有： 纤维素、半纤维素、果胶质

细菌、动物与植物细胞的比较

二、 细胞膜（cell membrane/plasmalemma）

➢主要由磷脂双分子层和蛋白分子组成。

➢细胞内的许多其它构成部分也具有膜结构，称为膜相结构(membranous structure)；相对地，不具有膜的部分则称为非膜相结构(non-membranous structure) 。

➢膜结构对细胞形态、生理生化功能的重要作用：

✓选择性透过某些物质，大分子物质通过微孔进出细胞；

✓提供生理生化反应的场所；

✓对细胞内空间进行分隔，形成结构、功能不同又相互协调的区域。

三、 细胞质(cytoplasm)

指细胞膜以内，细胞核以外所有物质的统称。

细胞质中分布着蛋白纤丝组成的细胞骨架及各种细胞器。

细胞器：细胞器是指细胞质内除了核以外的一些具有一定形态、结构和功能的物体 。

✓线粒体（mtDNA）、质体（叶绿体ctDNA，白色体，有色体）、内质网（粗面内质网、滑面内质网）、核糖体、高尔基体、中心体（动物细胞特有）。

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内质网

K. R. Porter等于1945年发现于培养的小鼠成纤维细胞，因最初看到的是位于细胞质内部的网状结构，故名内质网（endoplasmic reticulum，ER）。

一、形态与组成

约占细胞总膜面积的一半，是封闭的网络系统。

分为粗面型内质网（rough endoplasmic reticulum，RER）和光面型内质网（smooth endoplasmic reticulum，SER）。

RER呈扁平囊状，排列整齐，有核糖体附着。

SER呈分支管状或小泡状，无核糖体附着。

细胞不含纯粹的RER或SER，它们分别是ER连续结构的一部分。

ER主要功能是合成蛋白质和脂类，分泌性蛋白和跨膜蛋白都是在ER中合成的。

ER膜中含大约60%的蛋白和40%的脂类，脂类主要成分为磷脂，磷脂酰胆碱含量较高，鞘磷脂含量较少，没有或很少含胆固醇。

ER约有30多种膜结合蛋白，另有30多种位于内质网腔，这些蛋白的分布具有异质性，如：葡糖-6-磷酸酶，普遍存在于内质网，被认为是标志酶，核糖体结合糖蛋白（ribophorin）只分布在RER，P450酶系只分布在SER。

二、ER的功能

（一）、蛋白质合成

蛋白质都是在核糖体上合成的，并且起始于细胞质基质，但是有些蛋白质在合成开始不久后便转在内质网上合成，这些蛋白主要有：

•向细胞外分泌的蛋白、如抗体、激素；

•膜的整合蛋白； 4 •需要与其它细胞组合严格分开的酶，如溶酶体的各种水解酶；

•需要进行修饰的蛋白，如糖蛋白。

（二）、蛋白质的修饰与加工

包括糖基化、羟基化、酰基化、二硫键形成等，其中最主要的是糖基化，几乎所有内质网上合成的蛋白质最终被糖基化。

糖基化的作用：

①使蛋白质能够抵抗消化酶的作用；

②赋予蛋白质传导信号的功能；

③某些蛋白只有在糖基化之后才能正确折叠。

（三）、新生肽链的折叠、组装和运输

COP II介导由内质网输出的膜泡运输，这种膜泡由内质网的排出位点（exit sites）以出芽的方式排出。

不同的蛋白质在内质网腔中停留的时间不同，这主要取决于蛋白质完成正确折叠和组装的时间，这一过程是在属于hsp70家族的ATP酶的作用下完成的，需要消耗能量。

有些无法完成正确折叠的蛋白质被输出内质网，转入溶酶体中降解掉，大约90%的新合成的T细胞受体亚单位和乙酰胆碱受体都被降解掉，而从未到达靶细胞膜。

（四）、内质网的其它作用

•合成磷脂、胆固醇等膜脂，合成后以出芽的方式转运至高尔基体，溶酶体和质膜上，或借磷脂转移蛋白（PTP）形成水溶性复合物，转至其他膜上。

•解毒，如肝细胞的细胞色素P450酶系。

•参与甾体类激素的合成。

•使葡糖6-磷酸水解，释放糖至血液中。

•储存钙离子，作为细胞内信号物质，如肌质网。

•提供酶附着的位点和机械支撑作用。

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•高尔基体

最早发现于1855年，1889年，Golgi用银染法，在猫头鹰的神经细胞内观察到了清晰的结构，因此定名为高尔基体。20世纪50年代以后才正确认识它的存在和结构。

一、形态与组成

是由数个扁平囊泡堆在一起形成的高度有极性的细胞器。

常分布于内质网与细胞膜之间，呈弓形或半球形。

凸出的一面对着内质网称为形成面或顺面（cis face）。凹进的一面对着质膜称为成熟面或反面（trans face）。顺面和反面都有一些或大或小的运输小泡。

扁平囊直径约1um，单层膜构成，中间为囊腔，周缘多呈泡状，4~8个扁平囊在一起(某些藻类可达一二十个)，构成高尔基体的主体(Golgi stack)。

二、功能区隔

•高尔基体顺面的网络结构（cis Golgi network，CGN），是高尔基体的入口区域。

•高尔基体中间膜囊（medial Golgi），多数糖基修饰，糖脂的形成以及与高尔基体有关的糖合成均发生此处。

•高尔基体反面的网络结构（trans Golgi network，TGN）， 是高尔基体的出口区域，功能是参与蛋白质的分类与包装，最后输出。

三、主要功能

1、参与细胞分泌活动

RER上合成蛋白质→进入ER腔→COPII运输泡→进入CGN→在medial Gdgi中加工→在TGN形成运输泡→运输与质膜融合、排出。

高尔基体对蛋白质的分类，依据的是蛋白质上的信号肽或信号斑。

2、蛋白质的糖基化

O-连接的糖基化在高尔基体中进行，糖的供体为核苷糖。

3、进行膜的转化功能

内质网上合成的新膜脂转移至高尔基体后，经过修饰和加工，形成运输泡与质膜融合。

4、将蛋白水解为活性物质

如将蛋白质N端或C端切除，成为有活性的物质，如胰岛素（C端）；或将含有多个相同氨基序列的前体水解为有活性的多肽，如神经肽。