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DNA甲基化在法医学中的应用前景及其检测方法的研究进展摘要：DNA甲基化检测法在法医学中的应用前景广阔，主要涉及到亲权鉴定的工作，在特殊案例中DNA甲基化检测法的应用具有一定价值，尤其可以解决同卵双生的鉴定问题，为法医学的个体甄别提供新思路，同时还能借助甲基化状态与SNP“二等位基因”类似性的特点，实现法医学多态性标记目的，给法医学的发展带来更多新的机遇。
为了充分发挥DNA甲基化在法医学中的应用价值和优势，下文分析和研究DNA甲基化在法医学中的检测方法，提出几点检测方面的建议，旨在为法医学中DNA甲基化检测法的合理应用与长远发展提供帮助。
关键词：DNA甲基化；法医学；应用前景；检测方法；研究进展DNA甲基化属于表现遗传学中的一部分，是研究DNA不变的状况下，基因表达出现可遗传变化的一门遗传学分支学科，和印记基因形成、基因沉默等存在直接的联系，并且DNA甲基化也属于表现遗传学中较为主要的遗传修饰形式，主要指的就是在DNA甲基转移酶的作用之下，将S-腺苷甲硫氨酸当做是甲基供体，将甲基添加到上面，最终出现5-甲基胞嘧啶。
通常情况下认为，DNA甲基化在基因方面的表达具有抑制性特点，可以应用在法医学的基因鉴定中，有着一定的应用价值和优势。
1 DNA甲基化在法医学中的应用前景陈雨专家在研究中发现，利用印记基因中的甲基化差异区域能够为法医学中的二联体亲权鉴定提供明确亲本来源等位基因的重要证据，针对印记基因之内的SNP或者是可变数目串联重复序列亲本印记等位基因，在相关的二联体亲权鉴定还有某些较为特殊的案件中，能够实现探索性的应用目的，可以将DNA甲基化在相关案例中的应用优势凸显出来[1]。
例如：目前在甄别部分同卵双生个体案件的过程中还存在一些难题，而在研究中可以发现，DNA甲基化的差异性，很有可能就是导致遗传物质抑制的同卵双生体现出差异性的主要原因，在同卵双生子相互之间，DNA甲基化甚至还存在位点之间甲基化程度的差异性，可以为法医学鉴定工作的实施和开展提供更多帮助。
DNA甲基化研究及其检测方法的新进展
李波;乔振华
【期刊名称】《山西医科大学学报》
【年(卷),期】2006(37)3
【摘要】DNA甲基化是指在DNA甲基转移酶（DNMT）的催化下,在胞嘧啶的第五位碳原子上加一甲基基团,使之变成5-甲基胞嘧啶（5-mC）的化学修饰过程.修饰过程中,DNA的甲基化并不改变基因的碱基序列,而是通过影响基因的表达以改变其功能.近年大量研究证实,DNA甲基化的变异（全基因组的低甲基化和局部基因的高甲基化）在恶性肿瘤的发生、发展中具有重要作用,已成为恶性肿瘤的基本特征之一,可以用于肿瘤的早期检测与治疗,因此,DNA的甲基化与肿瘤关系的研究与检测方法的改进已成为研究热点之一.
【总页数】3页(P317-319)
【作者】李波;乔振华
【作者单位】山西医科大学第二临床医学院血液内科,太原,030001;山西医科大学第二临床医学院血液内科,太原,030001
【正文语种】中文
【中图分类】R342
【相关文献】
1.DNA甲基化在法医学中的应用前景及其检测方法新进展 [J], 赵书民;李成涛
2.肾细胞癌的DNA甲基化研究新进展 [J], 陈小龙;肖跃海;孙发
3.DNA甲基化在阿尔茨海默病发病机制中作用的研究新进展 [J], 栗鋆;邵宏元;刘凡
4.昆明动物所在猪lincrna基因dna甲基化研究中取得新进展 [J],
5.昆明动物所在猪lincrna基因dna甲基化研究中取得新进展 [J],
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DNA甲基化检测技术进展及经验总结李懿;李光润【摘要】DNA甲基化作为一种表观遗传学元件,参与正常细胞的发育分化、基因组印记、X染色体失活和染色质重构等生命过程,在肿瘤演进中亦发挥重要作用.为满足不断深入的研究需求,DNA甲基化检测技术得到了较快的发展,检测的灵敏度和特异度不断提高,并逐步从个别位点向高通量检测发展.该文综述了目前常用的DNA甲基化分析方法,并简要总结了其在应用中的关键点和经验.【期刊名称】《医学综述》【年(卷),期】2015(021)002【总页数】4页(P204-207)【关键词】表观遗传学;DNA甲基化;检测【作者】李懿;李光润【作者单位】成都军区昆明总医院肿瘤科,昆明650032;成都军区昆明总医院肿瘤科,昆明650032【正文语种】中文【中图分类】Q3-3;Q751DNA甲基化是表观遗传学修饰的主要形式，甲基化模式的异常促进细胞恶性转化，参与肿瘤演进[1-2]。
许多基因具有肿瘤特异性的甲基化表型[3]，一方面基因组广泛的低甲基化引起原癌基因活化，基因组不稳定性增加[4]；另一方面启动子区的高甲基化，引起抑癌基因及错配修复基因表达沉默，导致肿瘤的发生[5]。
研究表明，基因组的低甲基化随着细胞恶性度的增加而愈加明显，是病情诊断的重要指标[6]；此外，CpG岛局部的高甲基化发生于细胞恶变之前，能在早期预测肿瘤的发生[7]，其也能有效地预测肿瘤的复发和转移[8]，在肿瘤的鉴别诊断中亦发挥重要作用[9]。
因此，检测肿瘤发生中相关基因的甲基化模式具有重要意义，现就近年来中外文献报道的甲基化检测方法进行简要的分析总结。
酶切-Southern杂交是早期用于甲基化研究的技术，其依赖于同裂酶(HpaⅡ和MspⅠ)识别位点中甲基胞嘧啶的敏感度不同，与基因组DNA共同消化后，与32P标记的检测基因片段的探针行Southern杂交，根据片段长度分辨位点的甲基化情况。
该方法简单且实验结果易解释，可进行基因CpG岛总体甲基化模式的定量研究，但样品需要量大且仅提供位于甲基化敏感限制性内切酶识别序列中的CpG甲基化信息，易出现由不完全酶切引起的假阳性。
宫颈癌相关基因DNA甲基化研究进展近年研究发现宫颈癌的发生发展可能与表观遗传的改变有很大联系。
DNA 甲基化是表观遗传学重要的分子机制之一。
近年来，国内外对宫颈癌DNA甲基化的研究越来越多，发现多种基因在宫颈癌的发生发展中发生了甲基化修饰，且这种表观遗传学改变与宫颈病变程度有一定相关性。
许多研究提出宫颈癌有关的DNA甲基化检测可能用于临床宫颈癌和癌前病变的诊断或预测。
标签：DNA甲基化；宫颈癌；生物标志物宫颈癌（cervical cancer）是最常见的妇科恶性肿瘤之一[1-2]。
传统上癌症的发生发展被视为一种遗传疾病，表观遗传学机制对于组织特异性基因表达模式的维护和正常发展十分必要，表观遗传学受到破坏将导致基因功能改变及细胞恶性转化。
表观遗传学（epigenetics）是与遗传学（genetics）相对应的概念。
遗传学改变是指基于基因序列改变所致基因表达水平变化，如基因突变、基因杂合丢失和微卫星不稳定等；而表观遗传学是研究不涉及DNA序列的改变，但基因表达却发生了可遗传的改变的学科。
这种改变是细胞内除了遗传信息以外的其他可遗传物质发生改变的结果，且这种改变在发育和细胞增殖过程中能稳定传递。
除基因组的改变外，近年研究发现宫颈癌的发生发展可能与表观遗传的改变有很大联系。
表观遗传的现象很多，已知的有：DNA甲基化、组蛋白乙酰化、RNA干扰、基因组印记（genomic impriting）和DNA编辑（RNA editing）、基因沉默、核仁显性和休眠转座子激活等。
其中DNA甲基化作为表观遗传学重要的分子机制之一，受到人们越来越多的关注[3-4]。
基因组正常而甲基化模式改变与肿瘤的演变发展有着密切联系[5]。
1 DNA甲基化DNA甲基化是表观遗传学和表观基因组学的重要研究内容，在调控基因表达及染色体结构方面发挥着重要作用。
在哺乳动物基因组中，所谓DNA甲基化是指在DNA甲基化转移酶（DNA methytrasferase）的作用下将S-腺苷甲硫氨酸提供的甲基基团共价结合到CpG二核苷酸的胞嘧啶5’碳原子上，生成5’-甲基胞嘧啶的过程。
DNA甲基化检测方法的临床研究进展【摘要】随着医疗科技的不断发展，DNA甲基化检测方法逐渐增多，DNA甲基化属于遗传外饰物，是遗传学中的重要内容，对于该物质的研究一直是临床中的热点，但采用操作简单，能够有效帮助各界医学专家了解杂种优势以及基因学的秘密。
为了临床研究提供准确依据，本文现对DNA甲基化检测方法的临床研究进展展开综述，详情内容如下：【关键词】 DNA；甲基化；检测方法；综述DNA甲基化属于遗传性物质，在动物中参与动物胚胎发育、基因印记以及X 染色体失活等，属于基因表达有着调节作用，但若人体中甲基化出现异常将导致人体出现肿瘤。
有研究结果得出对人体实施DNA甲基化检测，能够有效保证患者生命健康，缓解患者不适，了解其身体情况。
随着医疗科技的不断发展， DNA甲基化检测方法逐渐增多，均能够为患者治疗以及诊断提供宝贵依据，但均存在缺陷[1-2]。
鉴于此，本文主要阐述DNA甲基化检测方法的临床研究进展，详情内容如下：1.DNA甲基化检测方法1.1甲基化敏感的限制性内切酶方法甲基化敏感的限制性内切酶方法是临床最常用的甲基化检测方法，其利用限制性内切酶无法切开甲基化的DNA排序特点进行检测。
Yongxi Zhao[3]的研究结果得出在哺乳动物的DNA以及真核的DNA中，只有在特定情况才会出现甲基化（CG 相连），此种方式具有物美价廉、操作简单等显著优势，但却存在着需要大量样本以及假阳性率过高等问题。
1.2 BSP测序法BSP测序法主要内容为利用重亚硫酸盐将DNA中含有的甲基化胞嘧啶脱氨基变化为尿嘧啶，通过观察PCR产物，能够帮助临床医师评估其CpG位点是否存在甲基化。
钟明,赵峰[4]认为此种监测方式有者极高的准确率以及可靠性，但是在时间监测的过程中需要准备大量的克隆测序，因此操作十分复杂。
1.3荧光定量法荧光定量法具有极高的高通量以及敏感性，且不需要进行杂交等相关程序，能够有效件减少环境污染，减少误差，其原理是依据重亚硫酸盐测量其DNA的片段[5]。
线粒体DNA甲基化的研究进展线粒体（mitochondria）是细胞内的重要细胞器，负责维持细胞的能量代谢和调节细胞的生命活动。
与核基因组不同，线粒体细胞质基因组（mitochondrial DNA，mtDNA）是由环状DNA组成的，其大小约为17-20 kb，编码有13个蛋白质基因、22个转运RNA基因和两个核糖体RNA基因。
甲基化是一种重要的表观遗传修饰方式，可以通过添加甲基基团到DNA分子上来改变基因的表达特性。
在核基因组中，甲基化已被广泛研究并且证明对维持基因稳定性和正常发育至关重要。
线粒体DNA甲基化的研究起步较晚，仍然相对较少，并且知之甚少。
线粒体DNA甲基化的研究始于20世纪80年代，当时的研究主要集中在人类和动物模型上。
研究表明，线粒体DNA甲基化模式在不同组织和器官中存在差异，并且在肿瘤细胞中甲基化程度较低。
线粒体DNA甲基化水平的变化与肿瘤发生、神经退行性疾病以及心血管疾病等一系列疾病的发生发展密切相关。
尽管对于线粒体DNA甲基化的研究还处于起步阶段，但随着高通量测序技术的发展和组学研究的深入，越来越多的研究开始关注线粒体DNA甲基化的机制和功能。
研究发现了线粒体DNA甲基转移酶与线粒体疾病的关联，并且发现线粒体DNA甲基化水平在细胞能量代谢和线粒体功能调控中起重要作用。
最新的研究表明线粒体DNA甲基化可能与衰老有关。
研究人员发现，老龄小鼠的线粒体DNA存在明显的甲基化水平下降，而导致线粒体功能降低。
一些研究指出，线粒体DNA 甲基化与癌症的发生也有关系，虽然具体机制尚不明确。
线粒体DNA甲基化的研究仍然相对较少，但已经有一些重要的进展。
这些研究结果揭示了线粒体DNA甲基化在维持线粒体功能和调控细胞生命活动中的重要作用，并为进一步研究线粒体相关的疾病提供了新的思路和方法。
对于线粒体DNA甲基化的机制和功能还需要进一步的研究，以深入揭示其在细胞和生物过程中的具体作用。
DNA 甲基化及检测方法研究进展李媛媛，龚晓，包云飞，洪亚辉（湖南农业大学生物科学技术学院，湖南长沙410128）摘要：DNA 甲基化是一种重要的遗传修饰，是表观遗传学（epigenetics ）研究的重要内容。
综述了目前常用的甲基化检测方法的原理及其在检测DNA 甲基化中的优缺点，如MSAP 检测方法、亚硫酸氢盐法、基因芯片技术等。
随着对表观遗传学研究的深入，DNA 甲基化检测方法也有了快速的发展，将有利于科学工作者更快更好的检测出DNA 甲基化。
关键词：DNA 甲基化；亚硫酸氢盐法；MSAP ；芯片技术中图分类号：Q75文献标识码：A 文章编号：1006-060X （2010）13-0015-03Research Advances of DNA Methylation and Its Detection MethodsLI Yuan-yuan,GONG Xiao,BAO Yun-fei,HONG Ya-hui(College of Bio-science and Technology,HNAU,Changsha 410128,PRC)Abstract:DNA methylation is an important genetic modification and an important part of epigenetics.The principles,advantages and disadvantages of common methylation detection methods (MSAP method,sodium bisulfite method and chip technology,etc.)were reviewed.With the further study on epigenetics,the detection method of DNA methylation has developed rapidly to detect DNA methylation faster and better.Key words:DNA methylation;sodium bisulfite method;MSAP;chip technology DNA 甲基化是一种重要的遗传修饰，是表观遗传学（epigenetics ）研究的重要内容[1]。
科技情报开发与经济SCI-TECH INFORMATION DEVELOPMENT ＆ ECONOMY 2009 年第19 卷第29 期文章编号：1005－6033（2009）29－0118-03 收稿日期：2009－08－02DNA 甲基化研究进展*王琦1，胡凤成2，李春明3（1.陕西理工学院生物科学与工程学院，陕西汉中，723001；2.陕西省略阳县野生动植物保护站，陕西略阳，724300；3.陕西省勉县野生动植物保护站，陕西汉中，724200）摘要：DNA 甲基化已成为阐明正常和病理基因表达现象的重要机制，因而已成为当前分子生物学的研究热点之一。
对DNA 甲基化的转录抑制机制、在肿瘤发生中的作用、与细胞衰老和凋亡的关系、抑制剂以及分析方法等方面的研究新进展进行了综述。
关键词：DNA 甲基化；基因调控；肿瘤；5 氮杂脱氧胞苷中图分类号：Q78 文献标识码：ADNA的甲基化修饰常见于细菌、植物和哺乳动物。
甲基化修饰有多种方式，被修饰位点的碱基可以是腺嘌呤的N－6 位、胞嘧啶的N－4 位、鸟嘌呤的N－7 位或胞嘧啶的C－5 位，分别有不同的酶催化。
在高等真核生物中，DNA甲基化仅发生在CpG二核苷酸G5′侧的C上。
胞嘧啶的甲基化可能参与基因的表达调控、发育调节、基因组印迹和X染色体灭活，DNA甲基化异常与肿瘤等疾病有关。
同样，已有诸多研究表明，细胞衰老过程也伴随着DNA甲基化水平的改变。
如体外培养的人胚肺二倍体成纤维细胞DNA甲基化水平随细胞代龄的增加而降低，并且衰老时DNA的甲基化呈现出不均一性［1］。
DNA甲基化已成为当前分子生物学的研究热点之一，而对其抑制剂以及分析方法的研究也有了长足的进步。
本文将综述近年来DNA甲基化研究的新进展。
1 DNA 甲基化转录抑制机制DNA 甲基化与基因表达分化调控的相互关系假说已提出多年。
此假说源于1979 年Mc Ghee 等发现与鸡β珠蛋白基因比邻的胞苷甲基化后，该基因转录受抑制的现象。
DNA甲基化修饰的检测方法及其应用DNA甲基化修饰是一种重要的表观遗传学调控方式，它可以通过改变DNA序列的化学性质来影响基因的表达。
在生物体发育、细胞分化以及疾病进程中都起着至关重要的作用。
因此，发展一种准确、高效的DNA甲基化修饰检测方法对于基础研究和临床应用具有重要的意义。
一、传统的DNA甲基化检测方法传统的DNA甲基化检测方法包括甲基化切割和甲基化敏感PCR两种方式。
甲基化切割方法是通过限制性内切酶的作用来切割特定的DNA序列，从而实现对于甲基化和非甲基化DNA的区分。
然而，这种方法需要事先限定切割位点，且需要大量的DNA样本和复杂的分离纯化过程，因此不适合于高通量的检测应用。
甲基化敏感PCR则是一种比较常用的分析DNA甲基化的方法。
它利用甲基化酶特异性甲基化DNA的特性，通过特定的引物和PCR扩增技术来检测DNA甲基化的状态。
然而，这种方法对于非标记的模板DNA敏感度较低，而且不允许检测甲基化的位点。
二、以高通量测序为基础的DNA甲基化检测方法高通量测序已经成为目前最常用的DNA甲基化检测方法。
它能够实现对全基因组的DNA甲基化修饰状态的鉴定和研究，并可以对不同种类的细胞和组织进行比较分析。
其中，全基因组甲基化分析技术（WGBS）是一种最为具有代表性的高通量测序技术。
该技术基于二代测序技术，对于全基因组DNA进行测序分析，能够对甲基化位点进行高效检测及定量化。
采用WGBS技术进行DNA甲基化分析的优点在于能够高通量、高清晰、高精度地检测全基因组的甲基化水平，且可以获得高分辨率的甲基化位点和甲基化水平的详细信息。
但是，WGBS技术也存在一些局限性，比如需要高昂的测序成本和大量的数据处理，同时也需要较高的DNA质量和量。
除了WGBS技术之外，还有一些新兴的高通量测序技术正在被应用于DNA甲基化的检测和分析，如MeDIP-Seq、RRBS、TAB-Seq和OXBS等。
这些技术相较于WGBS技术具有更高的分辨率、更低的测序成本和更少的数据处理，可以用于小样本或低质量的DNA检测。
DNA 甲基化及检测方法研究进展李媛媛, 龚晓, 包云飞, 洪亚辉(湖南农业大学生物科学技术学院, 湖南长沙 410128摘要:DNA 甲基化是一种重要的遗传修饰, 是表观遗传学 (epigenetics 研究的重要内容。
综述了目前常用的甲基化检测方法的原理及其在检测 DNA 甲基化中的优缺点, 如 MSAP 检测方法、亚硫酸氢盐法、基因芯片技术等。
随着对表观遗传学研究的深入, DNA 甲基化检测方法也有了快速的发展, 将有利于科学工作者更快更好的检测出 DNA 甲基化。
关键词:DNA 甲基化; 亚硫酸氢盐法; MSAP ; 芯片技术中图分类号:Q75文献标识码:A 文章编号:1006-060X (2010 13-0015-03Research Advances of DNA Methylation and Its Detection MethodsLI Yuan-yuan, GONG Xiao, BAO Yun-fei, HONG Ya-hui(Collegeof Bio-science and Technology, HNAU, Changsha 410128, PRCAbstract:DNA methylation is an important genetic modification and an important part of epigenetics. The principles,advantages and disadvantages of common methylation detection methods (MSAPmethod, sodium bisulfite method and chip technology, etc. were reviewed. With the further study on epigenetics, the detection method of DNA methylation has developed rapidly to detect DNA methylation faster and better.Key words:DNA methylation; sodium bisulfite method; MSAP; chip technology DNA 甲基化是一种重要的遗传修饰,是表观遗传学 (epigenetics 研究的重要内容[1]。
其主要形式包括 5-甲基胞嘧啶 (5-mC 、 N6-甲基腺嘌呤 (N6-mA 及 7-甲基鸟嘌呤 (7-mG 。
在哺乳动物中, DNA 甲基化是必不可少的, 它广泛存在于转座子元件、功能基因编码群和重复的 DNA 中, 且几乎所有的甲基化存在于 CpG 二核苷酸对中。
在植物中, 5-甲基胞嘧啶主要出现在 CpG 二核苷酸对及 CNG 三核苷酸对中,大约有 20%~30%的核基因组 DNA 胞嘧啶处于甲基化状态。
1DNA 甲基化的机制及 DNA 甲基转移酶DNA 甲基化作用机制是在甲基转移酶(DNA methyltransferase , MTase 的催化作用下从甲基供体S-腺苷酰甲硫氨酸 (SAM 分子中的甲基化基团添加到 DNA 分子中的碱基上,最常见的是加在胞嘧啶上, 形成 5-甲基胞嘧啶 (5-mC [2]。
DNA 甲基化状态通过 DNA 甲基转移酶来维持。
细胞中存在几种甲基化酶:一种是维持型甲基转移酶, 需以半甲基化的双链 DNA 为模板, 指导新合成的链甲基化; 一种是全新甲基化酶, 不依赖半甲基化 DNA 分子中的甲基化模板而从新开始合成 5mC [3]。
在植物中, 大部分非 CG 位点的甲基化由从头合成甲基化酶催化。
全新甲基化酶可以使以前没有被修饰过的 DNA 产生甲基化,即重新甲基化, 其作用位点为 CG 、 CNG 和 CNN 序列。
植物细胞中存在染色质甲基化酶,是植物所特有的一类甲基化酶 ,该酶催化位于异染色质区和甲基化位点沉默区的 CNG 序列的甲基化 [4]。
2检测甲基化的方法目前, 甲基化检测的方法大致有以下几类:(1 利用甲基化敏感的限制性内切酶结合聚丙烯酰胺凝胶电泳 (MSAP 进行多态性检测; (2 利用亚硫酸氢盐修饰法; (3 芯片技术。
2.1MSAP 检测方法目前研究植物基因组甲基化多采用该种检测方法,MSAP 是在扩增片段长度多态性 (AFLP 基础上, 把该法中的内切酶替换为对甲基化敏感程度不同的一对同裂酶 HpaII 和 MspI 。
这对酶可识别 CCGG 位点,但对甲基化的敏感程度不同:前者对内、外侧胞嘧啶甲基化敏感, 后者只对外侧胞嘧啶甲基化敏感,而绝大多数基因组甲基化发生在胞嘧啶内侧, 因此可以用 MspI 来识别 CCGG , 用 HpaII 来鉴别这些序列是否甲基化。
这是一种简便的成本较低的检测 DNA 甲基化的方法,实验结果位点明确收稿日期:2010-04-12作者简介:李媛媛 (1985- , 女, 湖南益阳市人, 硕士研究生, 研究方向为分子细胞遗传学。
通讯作者:洪亚辉湖南农业科学 2010, (13 :15~17Hunan Agricultural SciencesDOI:10.16498/ki.hnnykx.2010.13.008且容易解释, 但也存在一定的缺点:由于甲基化位点不仅仅存在于 CCGG ,也可能存在于 CG 中, 故 CG 中的甲基化会被忽略, 造成结果的误差。
2.2亚硫酸氢盐法亚硫酸氢盐可将未甲基化的胞嘧啶 C 转化为尿嘧啶 U , 然后进行 PCR 扩增, U 将与 A 配对产生 T ,而甲基化的 C 则不会被亚硫酸盐修饰,这样 DNA 包含的甲基化信息就转变为具有差异的 DNA 序列 [5]。
如今在 Sodium bisuIfite 法基础上又产生了许多甲基化检测的方法,包括如 DNA 甲基化荧光 PCR 检测、结合亚硫酸氢钠处理和酶解分析法、甲基化敏感性高分辨率熔解、甲基化敏感的单核苷酸的扩增、酶的区域性甲基化特异性分析、芯片杂交技术等等。
2.2.1甲基化特异性 PCR 法(MSP 甲基化特异性 PCR 也是检测基因甲基化的经典方法。
MSP 法的原理是用亚硫酸氢盐处理目的 DNA ,然后设计针对甲基化和非甲基化序列的引物并进行 PCR 扩增, 最后通过琼脂糖凝胶电泳, 确定与引物互补的 DNA 序列的甲基化状态 [6]。
MSP 法中引物设计的要求:(1 设计两对引物, 其末端均设计至检测位点结束; (2 两对引物中一对结合处理后的甲基化 DNA 链,另一对结合处理后的非甲基化 DNA 链。
检测 MSP 扩增产物,如果用针对处理后甲基化DNA 链的引物能扩增出片段, 则说明该被检测的位点存在甲基化;若用针对处理后的非甲基化 DNA 链的引物扩增出片段,则说明被检测的位点不存在甲基化。
MSP 法具有灵敏度较高、应用范围广的优点。
2.2.2DNA 甲基化荧光 PCR 检测 DNA 甲基化荧光 PCR 检测是利用重亚硫酸盐处理目的 DNA 片段后,设计一个能与待测位点区互补的探针, 在其5’ 末端标记一个荧光报告基团, 3’ 末端标记一个荧光淬灭基团, 随后进行实时定量 PCR 。
如果探针能够与 DNA 杂交, 则在 PCR 引物延伸时, Taq 酶发挥其5’ 至3’ 外切酶活性, 将能与模板杂交的探针切碎, 报告基团与淬灭基团分离, 荧光信号释放, 可被检测, 测定每个循环报告荧光的强度即可得到该位点的甲基化水平情况 [7]。
该方法具备灵敏度高、所需样本量少、不需要电泳分离、可重复等优点。
缺点是费用高, 测定每个位点都要用两端标有荧光素的探针和一对引物, 且受较多因素影响。
2.2.3结合亚硫酸氢钠处理和酶解分析法 (CO-BRA 亚硫酸氢钠处理的 DNA 经PCR 扩增后会产生新的酶切位点。
目的片段扩增后用识别序列需包含 CG 的内切酶消化, 如 BstUI (识别 CGCG 。
若其识别序列中的 C 发生完全甲基化, 则 PCR 扩增后保留为 CGCG ,此时 BstUI 能够识别并进行切割; 若待测序列中, C 未发生甲基化, 则 PCR 扩增后转变为 TGTG , BstUI 不可识别此位点, 不能进行切割 [7]。
这样酶切产物经电泳分离、探针杂交、扫描定量后即可得出原样本中甲基化的比例。
该法的优点是:方法相对简单, 不需预先知道 CpG 位点及样本序列; 可进行甲基化水平的定量研究; 需要样本量少。
缺点是:只能获得特殊酶切位点甲基化情况, 因此检测结果呈阴性也不能排除样品 DNA 中甲基化存在的可能。
2.2.4甲基化敏感的单核苷酸的扩增 (Ms — SnuPE 甲基化特异的单核苷酸扩增能对不同甲基化特异位点进行快速定量, 是一种快速估计特异性 CpG 位点甲基化情况的定量方法。
其原理是先用重亚硫酸盐处理基因组 DNA 后 PCR ,然后取等量扩增产物置于两管中,分别作为 Ms — SnuPE 单核苷酸引物延伸的模板。
设计用于 Ms — SnuPE 延伸的引物, 其3’ 末端紧靠待测目的碱基。
同时在两个反应体系中加入等量的引物、同位素标记的 dCTP 或 dTTP 、 Taq 酶等。
如待测位点被甲基化, 则被同位素标记的 dCTP 会在延伸反应中连至引物末端; 如果未被甲基化, 则标记的 dTTP 可参与反应。
末端延伸产物经琼脂糖凝胶电泳分离和放射活性测定后可得出 C /T 值, 此值为甲基化与非甲基化的比值,由此分析得到目的片段中 CpG 位点的甲基化情况 [8]。
2.2.5甲基化敏感性高分辨率熔解 (MS-HRM 高分辨率熔解是一种最新的遗传学分析方法, 是一种不需要 PCR 产物后续操作的简单且灵敏的检测基因甲基化水平的方法。
采用重亚硫酸盐处理 DNA 模板后在 PCR 反应前, 在非 CpG 岛位置设计一对针对经亚硫酸氢钠处理后 DNA 链的引物, 这对引物中间包含有意义的甲基化 CpG 岛,一旦这些 CpG 岛发生甲基化, 胞嘧啶不发生变化, 而未甲基化的胞嘧啶转变成胸腺嘧啶, 样品中的 GC 含量发生了变化, 最终被转化成了熔解曲线 Tm 值之间的差异。
CpG 位点在小的扩增片段内的相对位置也会对熔解峰的形状产生影响, 因此, 根据 Tm 值和熔解峰的形状可以检测出样本的甲基化位点和甲基化程度 [9]。
2.3甲基化检测芯片技术基因芯片技术的出现为检测 DNA 甲基化的高第 13期湖南农业科学 16!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!!(上接第 14页3小结与讨论细极链格孢菌蛋白激发子处理棉种均能促进棉种萌发和提高发芽率,尤以处理浓度3μg/mL+浸泡 6h 的处理效果比较显著。
