阳离子脂质体基因载体的细胞转染研究_姜云霞

阳离子脂质体转染效率的主要影响因素魏云波;高平;刘书花;徐清忠【摘要】基因治疗的关键问题是选择合适的载体将外源基因有效保护，并完成穿膜入胞-入核-表达这一完整传递过程。

其中，传递载体的转染效率高低对基因治疗有重要意义。

本文对影响阳离子脂质体这一重要非病毒基因表达载体转染效率的多种因素进行了综述。

【期刊名称】《北方药学》【年(卷),期】2012(000)011【总页数】1页(P86-86)【关键词】阳离子脂质体;转染效率;细胞;基因【作者】魏云波;高平;刘书花;徐清忠【作者单位】山东省分析测试中心济南 250014;山东省地质环境监测总站济南250014;山东省分析测试中心济南 250014;山东省分析测试中心济南 250014【正文语种】中文【中图分类】R94加强基因/药物的靶向治疗，进行严重威胁着人类健康重大疾病的防治研究，是我国经济发展及健康研究的重中之重[1]。

基因治疗的关键问题是选择合适的载体将外源基因有效保护，并完成穿膜入胞-入核-表达这一完整过程。

目前研究的基因载体主要包括病毒载体和非病毒载体两大类[2]，而非病毒载体中的阳离子脂质体以其免疫原性低、细胞毒性低、与外源基因结合能力强、可大规模制备等特点，被广泛应用于基因转染治疗研究中。

其中，提高阳离子脂质体转染效率是有效应用阳离子脂质体的关键[3]。

本文将对影响阳离子脂质体转染效率的因素进行了综述。

1 阳离子脂质体结构、外源基因种类及脂质体/基因的比例阳离子脂质体与外源基因（带负电荷）直接混合即可通过静电作用得到稳定的复合物（lipoplex），且不受该外源基因分子大小的限制。

不同制备方法制成的阳离子脂质体脂质成分对其转染效率影响较大，脂质复合物的分子构象变化、正/负电荷比例及相互作用方式也对转染效率有影响，特别是脂质复合物形成不同构象变化以避免核酸酶降解[4]。

另外，相同阳离子脂质体对不同外源基因的转染效率也有所不同，一般认为，环状DNA的转染效率高于线状DNA，越小的基因其转染效率越高[3]。

阳离子脂质体递送STAT3 siRNA抑制黑色素肿瘤细胞探究邹瑞;彭正松【摘要】利用阳离子脂质体作为载体,用其搭载鱼精蛋白与STAT3 siRNA复合物,通过一系列实验证实该复合体系可显著抑制STAT3基因在黑色素瘤细胞B16中的表达,促进肿瘤细胞的凋亡.首先对载体材料进行了一系列表征测定,检测了不同复合比例下载体和siRNA复合物的粒径和电位.利用载体和siRNA的复合物对B16细胞进行转染并测定转染效率,随后对复合材料的毒性进行了检测.此外还进行了细胞凋亡、平板克隆、荧光定量PCR以及Western Blot等一系列实验来进一步确定载体复合物的有效性.实验结果表明,阳离子脂质体搭载复合了鱼精蛋白的STAT3siRNA表现出了良好的靶向治疗性及优秀的递送效率,且复合体系稳定性良好,毒性低.【期刊名称】《西昌学院学报（自然科学版）》【年(卷),期】2019(033)001【总页数】6页(P28-33)【关键词】阳离子脂质体;鱼精蛋白;siRNA;STAT3【作者】邹瑞;彭正松【作者单位】西华师范大学生命科学学院,四川南充 637009;西华师范大学生命科学学院,四川南充 637009;西昌学院农业科学学院,四川西昌 615000【正文语种】中文【中图分类】R739.51998年，华盛顿卡耐基研究院的Fire A 等首次在秀丽隐杆线虫（C.elegans）发现了一个双链RNA能够沉默蠕形秀丽隐杆线虫基因表达，并证明上述现象属于转录后水平的基因沉默[1]，这一现象正式被称为 RNA 干扰（RNAi）。

从 1999年人们发现RNAi 现象[2]的存在到 2001年，RNAi 技术正式应用于哺乳动物细胞基因功能的研究中[3]，短短几年内，RNAi技术得到了飞速发展。

毫无疑问，若RNAi技术能有效应用于临床，这将是基因治疗领域的一大突破。

RNAi 能够抵抗转基因或外源性病毒的侵犯。

在体外设计与靶基因mRNA 同源互补的双链RNA后，将这段双链RNA 导入目的细胞，其能够通过同源互补，从而靶向性地降解该mRNA，达到靶基因沉默的效果。

阳离子脂质体介导肽核酸转染K562细胞的研究王偲颖;林靖;韩媛媛;张华;黄盛文【摘要】目的优化阳离子脂质体介导肽核酸(PNA)转染K562细胞的条件.方法以阳离子脂质体lipofectamine 2000为载体,将标记有FITC荧光基团的PNA转染K562细胞,在荧光显微镜下观察并计算其转染效率,采用Cell Counting Kit(CCK-8)检测其细胞毒性.应用正交试验筛选出最佳的PNA和脂质体的用量及比例,并优化稀释用培养基血清浓度,以获得最优的转染效果.结果以2.5× 105/mL～3×105/mL的细胞密度接种,100 μL/孔的培养基中加入PNA 6.25 pmol,PNA与脂质体的体积比为1∶3.5,稀释用培养基未加胎牛血清时,细胞转染效率和细胞毒性最佳,转染效率为87.2％,细胞存活率(RGR)为94.1％.结论 PNA可通过阳离子脂质体转染进入K562细胞,优化条件后得到的细胞转染效率和细胞存活率能够满足基因表达研究的实验要求.【期刊名称】《贵州医药》【年(卷),期】2016(040)004【总页数】3页(P341-343)【关键词】K562细胞;肽核酸;脂质体转染;细胞毒性【作者】王偲颖;林靖;韩媛媛;张华;黄盛文【作者单位】贵州医科大学附属贵州省人民医院检验科,贵州贵阳550002;贵州医科大学附属贵州省人民医院输血科,贵州贵阳550002;贵州医科大学附属贵州省人民医院检验科,贵州贵阳550002;贵州医科大学附属贵州省人民医院检验科,贵州贵阳550002;贵州医科大学附属贵州省人民医院检验科,贵州贵阳550002【正文语种】中文【中图分类】R394.3β-地中海贫血(简称β地贫)是我国南方各省常见的常染色体隐性遗传病，目前尚无有效的根治方法[1]。

重新激活β地贫患者体内的γ-珠蛋白基因表达，提高HbF 的合成量是治疗这类疾病的重要策略[2]。

PYR是一种SWI/SNF类染色质重组复合体，通过转录因子Ikaros与相应的DNA序列结合，其结合位点在δ-珠蛋白基因上游1 kb处一段250 bp长富含嘧啶碱基的序列。

阳离子脂质体转染操作方法
阳离子脂质体转染是一种常用的基因传递实验技术，可以将核酸载体有效地转染至细胞内。

下面是阳离子脂质体转染的基本操作方法：
1. 细胞培养：选择适合的细胞培养基及条件，将要转染的细胞在培养皿中培养至指定的生长状态，通常是80%～90%的细胞密度。

2. 制备DNA-脂质体复合物：将目标DNA与阳离子脂质体以适当比例混合，制备成DNA-脂质体复合物。

复合物的制备条件可以根据实际情况进行优化，一般来说，将DNA与脂质体按照质量比1:3～1:5混合，在无菌条件下保持15～30分钟使其充分结合。

3. 转染：将DNA-脂质体复合物均匀滴加至细胞培养皿中，注意避免产生气泡，插入培养皿中心。

轻轻摇晃培养皿使其均匀分布，然后将培养皿放回密闭的培养箱中，继续培养。

4. 代谢酶抑制：在培养细胞转染后的前24小时内，添加代谢酶抑制剂（如10 μg/mL的氨基葡萄糖苷或10 mM的2-脱氧-D-葡萄糖）来提高转染效率。

5. 培养：根据需要的实验设计，继续培养细胞，通常在转染后24～72小时进行下一步的实验。

需要注意的是，每个细胞系对阳离子脂质体的适应性不同，因此在实际操作中需要进行不同的试验优化。

同时，与脂质体浓度、DNA浓度、转染时间等因素也需要进行优化。

阳离子脂质材料及其在基因转染中的应用高韩;巨佳;马茜茜;李晨;张邦乐【摘要】Objective To review the structure and efficacy of cationic lipids in order to design efficient nonviral vectors and provide further application in gene therapy .Methods The structure and gene transfection performance of the existing cationic lipids were analyzed ,and the effect on transfection activity was discussed .Results Cationic lipids have great potential in gene transfection ,and their specific structures play an important role in gene transfection .Conclusion The analysis of structure and function can provide some ideas to construct more efficient gene delivery vectors .%目的通过对已报道的阳离子脂质材料的结构及其应用的综述,为该类基因转染载体的合理设计和进一步应用提供借鉴.方法对已有的各种阳离子脂质材料的结构及基因转染特性进行分析,并探讨其对基因转染的影响.结果阳离子脂质材料在基因转染中有着巨大的应用潜力,特定的脂质材料结构赋予其在基因转染中不同的效能.结论对阳离子脂质材料结构特征的综合分析,为进一步合理构建新的高效阳离子脂质体基因递送载体提供了思路.【期刊名称】《西北药学杂志》【年(卷),期】2017(032)006【总页数】5页(P813-817)【关键词】阳离子脂质材料;阳离子脂质体;基因转染;基因递送;非病毒载体【作者】高韩;巨佳;马茜茜;李晨;张邦乐【作者单位】第四军医大学药学院,西安 710032;第四军医大学药学院,西安710032;第四军医大学药学院,西安 710032;第四军医大学药学院,西安 710032;第四军医大学药学院,西安 710032【正文语种】中文【中图分类】R94基因治疗是通过一定的方式将目的基因递送到靶器官、组织或细胞内，使其修复缺损基因或调节特定基因的表达，从而达到治疗疾病目的的生物医学治疗方法。

两种阳离子脂质体介导基因转染的比较研究支德福1, 3, 王冰3, 崔韶辉3, 杨宝灵3，赵不凋3, 赵轶男3,姜云霞2, 于世钧1, 张树彪3*(辽宁师范大学 1. 化学化工学院, 2. 生命科学学院, 辽宁大连 116029;3. 大连民族学院生命科学学院生物技术与资源利用国家民委-教育部重点实验室, 辽宁大连 116600)关键词: 基因载体; 阳离子脂质体; Lipofectamine 2000; DOTAP; 转染中图分类号: R963 文献标识码:A 文章编号: 0513-4870 (2009) 05-0553-05Comparison of two kinds of cationic vectors-mediated gene deliveryZHI De-fu1, 3, WANG Bing3, CUI Shao-hui3,YANG Bao-ling3, ZHAO Bu-diao3, ZHAO Yi-nan3,JIANG Yun-xia2, YU Shi-jun1, ZHANG Shu-biao3*(1. College of Chemistry and Chemical Engineering, 2. College of Life Science, Liaoning Normal University, Dalian 116029, China; 3. Key Laboratory of Biotechnology and Bioresources Utilization, The State Ethnic Affairs Commission-Ministry of Education, College of Life Science, Dalian Nationalities University, Dalian 116600, China)Abstract: In order to study the important factors involved in cationic liposome-mediated gene transfer, Lipofectamine 2000 or DOTAP was evaluated using three types of cells (Hep-2, MCF-7 and SW-480) in vitro transfection efficiencies. Different properties of the two reagents were analyzed and compared by DNA arrearage assay and MTT assay. Both Lipofectamine 2000 and DOTAP had strong capability to combine with DNA; Lipofectamine 2000 can get higher transfection efficiency of the three cells by using GFP as report gene, meanwhile, DOTAP can also get higher transfection efficiency against Hep-2 cell. However, DOTAP showed lower transfection efficiency against MCF-7 and SW-480 cell. On the other hand, the cytotoxicity assay showed that over 85% cell viability of MCF-7 cell could be achieved both by Lipofectamine 2000 and DOTAP under the optimal transfection condition. Relatively speaking, Lipofectamine 2000 has very high transfection efficiency in a broad range of cell lines, but because of the special selectivity of cell type on liposome, DOTAP also has a broad application prospect.Key words: gene vector; cationic liposome; Lipofectamine 2000; DOTAP; transfection基因治疗作为一种革命性的治疗手段，对免疫缺陷病、肿瘤等多种疾病的疗效已得到验证[1−3]。

基因治疗研究中脂质体介导的基因转移技术
李崇辉
【期刊名称】《生物技术通讯》
【年(卷),期】1998(000)002
【摘要】对于脂质体的深入研究特别是阳离子脂质体的研制使其逐步成为重要的基因转移载体之一,并且初步应用于基因治疗研究,同时多种靶向脂质体的研制也为体内靶向基因转移和表达奠定了基础。

本文就脂质体的结构、功能、在基因治疗研究中的应用以及各种靶向脂质体的研制进行了介绍。

【总页数】5页(P124-128)
【作者】李崇辉
【作者单位】军事医学科学院毒物药物研究所;北京;100850;解放军总医院基础所【正文语种】中文
【中图分类】Q789
【相关文献】
1.脂质体介导质粒pcDNA3.1/ KDRn3基因在转染小鼠视网膜组织中的表达及定位 [J], 左玲;栾永昕;姜扬;裴颖;苏冠方
2.阳离子脂质体Lipofectin介导的β-半乳糖苷酶基因在HepG2及GRC细胞株中的表达 [J], 程香普;段芳龄;张智清;陈庆华;李振峰;赵治国;崔静;卢高峰
3.病毒介导的基因转移技术在海洋无脊椎动物中的研究进展 [J], 陈学美;申晓彤;李炎;郭华荣;;;;
4.大鼠肝移植中脂质体介导IL-10基因转染供肝的实验研究 [J], 张栋;高东宸;张忠
涛;王宇
5.脂质体介导基因转移技术在尘肺研究中的初探 [J], 张慧峰;李秋营;张欣樵
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多肽型阳离子脂质体的研究进展赵轶男, 张树彪, 崔韶晖, 王胜男, 孙 杨(大连民族学院生命科学学院,辽宁大连116600)摘 要:多肽型阳离子脂质体作为一种重要的非病毒基因载体,克服了其他阳离子脂质体转染效率低、具有一定细胞毒性的缺点,在基因转运方面具有广阔的应用前景。

在近年来多肽型阳离子脂质体研究的基础上,论述了多肽型阳离子脂质体在类脂的结构设计、脂质体制备及其在基因转运方面应用的研究现状,展望了多肽型阳离子脂质体的发展方向。

关键词:多肽;阳离子脂质体;非病毒载体;基因转运中图分类号:R 941 文献标志码:A 文章编号:0367 6358(2010)11 0701 04T he Development of Poly peptide Cationic Liposom eZH AO Yi nan, ZH AN G Shu biao, CU I Shao hui, WANG Sheng nan, SUN Yang(Colle ge of L if e S cience ,Dalian N ationa lities Univ er sity ,L iaoning Dalian 116600,China)Abstract:As an impo rtant non viral gene v ecto r,poly peptide catio nic lipo som e has ov ercome som e disadvantag es of o ther cationic liposomes,such as low transfection efficiency and cell tox icity ,and show n a potential application in disease treatment and g ene transfer.Based on the studies of recent years,sum marizes the latest development of po lypeptide catio nic liposome for gene deliv ery ,including the str ucture design of po lypeptide lipid,liposomal preparation and the applicatio n in the field of gene transfer,and it also g ives som e sugg estio ns on the dev elo pment trend of poly peptide catio nic liposo me for g ene delivery.Key w ords:poly peptide;cationic liposome;non v iral vector ;g ene transfectio n收稿日期:2010 05 15基金项目:国家自然科学基金(20876027)、教育部新世纪优秀人才支持计划(NC ET 08 0654)作者简介:赵轶男(1979~),女,硕士,研究方向:非病毒基因载体。

阳性脂质体介导基因转染及其研究进展ChineseJournalofNewDrugs2007,V ol,16No.23中国新药杂志2007年第l6卷第23期阳性脂质体介导基因转染及其研究进展郑肖利,陈建明(第二军医大学药学院药剂教研室,上海200433)[摘要]基因治疗是一种很有前景的治疗模式,而阳性脂质体介导的基因转染是目前基因治疗的研究热点之一.现综述近5年来有关阳性脂质体的文献,介绍了阳性脂质体的基本组成,并从生物学,理化性质及制剂学等几个方面介绍了影响阳性脂质体/DNA复合物转染效率的主要因素,最后从新的阳性脂质成分及阳性脂质体或阳性脂质体/DNA复合物的表面修饰等方面介绍了近年来有关改善阳性脂质体介导基因转染的研究进展.[关键词]阳性脂质体;阳性脂质体/DNA复合物;转染效率;基因治疗[中图分类号]R459.9;R944.9[文献标识码]A[文章编号]1003—3734(2007)23—1930—06DevelopmentofcationicliposomesforgenedeliveryZHENGXiao-li,CHENJian-ming(DepartmentofPharmaeeuties,SchoolofPharmacy,SecondMilitaryMedicalUniversity,S hanghai2130433,China)[Abstract]Genetransfectionmediatedbycationicliposomeshasbeenoneofthemostimporta ntresearchspotsingenetherapywhichisapromisingtherapymode.Thisarticlereviewedliterat uresoncat- ionicliposomesinrecentfiveyearsandintroducedthecationicliposomescomponents,themainfactors thatinfluencethetransfectionefficiencyoflipoplexesonbiology,physico-chemicalpropert yandpharma-ceutics.Thisreviewalsointroducednewcationiclipidsandsurfacemodificationsforliposo mesorlipo- plexesthatrelatedtonewtrendsaimingatimprovingcationicliposomesmediatedgenedelive ry.[Keywords]cationicliposomes;lipoplexes;transfectionefficiency;genetherapy基因治疗(Genetherapy)是指通过载体把核苷酸转入患者体内以达到某种治疗目的.基因治疗是一种很有前景的治疗模式,但是目前该治疗方法还有许多难题没有解决,其中最主要的一个问题是没有找到适合的载体把治疗用核苷酸送至靶器官细胞内的作用点,因此,寻找合适的载体是当前的热点问题.目前基因治疗载体可分两大类:病毒载体和非病毒载体.与病毒载体相比,非病毒载体有许多潜在的优势,如:毒性低,免疫原性以及潜在的致癌性都较低;转移的核苷酸大小范围广(从寡核苷酸到人工染色体均可);质量控制较方便;并且制剂方法较简单,剂量可控.在基因治疗中应用较多的是阳性脂质体(cationicliposome)介导的基因转染,目前已成为非病毒载体的最佳选择,并且逐渐为广大研究者所接受,具有广阔的发展空间和前景.1阳性脂质体的基本组成阳性脂质体又称阳离子脂质体,正电荷脂质体(positivelychargedliposome),是一种本身带有正电荷的脂质囊泡.目前大多数阳性脂质体是由一种中性脂质成分和一种或多种阳性脂质成分组成,其中基金项目:上海市科委基础研究重点项目(05JC14048)一1930一中性脂质成分起到稳定双层膜和降低阳性成分毒性的作用,同时提供阳性脂质的细胞渗透功能.阳性脂质成分又称细胞转染素(Cytofectin),是具有不同化学结构的两性分子,一般由带正电的亲水基团通过中间连接基团与疏水基团连接而成.阳性脂质成分为整个脂质体提供正电荷,而且具有在体外稳定性好,在体内可生物降解的特点,但均有一定的细胞毒性.现常用的中性脂质成分及细胞转染素的结构见图1～5.除了以上的基本组成,还可利用不同性能的材料,如多糖,亲水性阳离子聚合物,寡肽,糖蛋白和表面活性剂等对脂质体进行表面修饰,可调控其在生物体内的过程从而提高其转染效率.图1二油酰磷脂酰乙醇胺(DOPE)图2胆固醇(Cho1)ChineseJournalofNewDrugs2007,V o1.16No.23图3N一[1一(2,3一二油酰氧基)丙基]一Ⅳ,Ⅳ,Ⅳ一三甲基硫酸铵(DOTAP) 图42,3-二油酰氧一[2(精胺羧基酰胺)乙基]一Ⅳ,Ⅳ一二甲基1丙基三氟乙酸铵(DOSPA)图53B—lⅣ一(Ⅳ',Ⅳ二甲氨基乙基)J氨甲酰基'胆固醇(DC—Cho1)2影响阳性脂质体/DNA复合物(Lipoplexes,LD)转染效率的主要因素2.1生物学因素无论是体外转染还是体内转染,LD都必须克服一系列生物学的屏障.在体外,复合物首先要跨过带负电的磷脂双分子层结构,即细胞膜屏障;其次,复合物通过内吞作用进入核内体后,如何使复合物最大限度地从核内体中释放,并保证其不被溶酶体酶降解,则是转染的第二道屏障;最后,已释放出的DNA还要完成从胞浆到核孔的转运,最终到达核内才能实现目的基因的表达.在体内,基因转染还需要解决靶向性和克服体液内环境等问题:即如何将基因药物从注射部位定向地输送到病变的组织和细胞,并且能够有效维持药物体内稳定性和最低限度地降低各种调理素对基因转染的影响.2.1.1细胞外屏障LD在体液(如免疫血清)中极不稳定,极容易聚集或降解.疏水性的带负电荷的蛋白质如血清白蛋白与复合物结合可抑制其被细胞直接摄取.小分子的脂类如油酸和大分子的苷类如肝素也会破坏复合物结构的完整性,从而大大降低其转染效率.且阳性脂质体本身也很容易被单核巨噬细胞吞噬系统捕捉及破坏,这些都将导致LD在体液中的循环时间很短.尤其是静脉注射给药时很可能产生肺首过效应,这主要是因为肺部循环是注射复合物后遇到的第一个毛细血管床,在此LD很容易与肺内皮表面的肝素蛋白聚糖结合从而在肺部沉积.这也是静脉注射LD后在肺部的转染率往往比中国新药杂志2007年第16卷第23在其他器官如肝脏或脾脏中高很多的主要原因¨].2.1.2细胞内屏障目前大多认为DNA从核内体中释放出来以及DNA进入细胞核的过程是阳性脂质体介导基因转染的限速过程….DNA从核内体转移到细胞质再从细胞质转移到细胞核内这一系列的转移过程效率相当低,且在此过程中DNA很容易被大量的核酸酶降解导致转染失败.核膜也是DNA转移过程中的一大障碍,对于相对分子质量> 70X10的大分子,核膜将限制其进人细胞核,除非它能与细胞核的主动转运系统发生相互作用.但值得注意的是当细胞处于分裂期时由于核膜的暂时裂解,使得DNA进入核内的能力大大增强,有研究表明除非细胞处于有丝分裂期否则DNA是不可能进入细胞核内的.2.2理化性质及制剂因素除了上述生物学障碍之外,研究还表明LD的转染效率还与其本身的理化性质及其处方工艺等有关.目前研究较多的主要有复合物的粒径,专-电位,复合物的空间构型以及阳性脂质体膜电荷密度(单位面积膜所带电荷)等;制剂方面主要是阳性脂质体与DNA的电荷比对体内外转染效率的影响, 阳性脂质成分的分子结构对基因转染效果也有重要影响,且阳性脂质成分对不同的细胞系的转染能力也大不一样.2.2.1复合物粒径近来有研究发现粒径较大的复合物(>200am)的转染效率比粒径较小的复合物(50～100am)的转染效率要高.这很可能是因为大粒径的复合物更容易沉积在细胞膜上,促进细胞对复合物的摄取;也可能因为粒径不同引发的细胞内吞作用的机制不同;或是粒径大的复合物携带的质粒数多,这些都还有待进一步的研究. Rejman等研究了在细胞内吞作用中粒径的影响,结果表明粒径较小的粒子(<200am)通过网格蛋白介导的细胞内吞作用进入细胞后,被迅速运至溶酶体并被降解.而粒径较大的粒子(200am～1Ixm)则通过细胞膜内陷作用进入细胞,该过程比较缓慢,却使得DNA或LD在核内体到达溶酶体之前就可以从核内体中释放出来,从而避免其在溶酶体被降解.2.2.2阳性脂质体与DNA的比例很多研究都表明LD中两者的比例对基因转染效率及其毒性都有重要的影响.Agostina等..用DC-Chol(见图5)与DOPE(见图1)等质量比制备得到阳性脂质体,并将该阳性脂质体与DNA以不同的P(DC-Chol与DNA 一1931—的物质的量比,P为1.58时电荷比为1)进行体外转染实验证明,当P为5.8时,转染率最高,而P为24时毒性最大.同时实验还表明当电荷比靠近等电点(即电荷比为1)时,由于静电排斥作用最弱导致LD 易于聚集从而降低转染效率.而随着P的增大LD之间的静电排斥作用也随之增大,阻止了LD的聚集从而提高了转染效率.但是当P过大时,这种排斥作用反而不利于其转染(很可能因为过强的排斥作用阻止了其沉积在细胞膜上),且毒性明显增大. 2.2.3DNA的大小及构型研究表明质粒DNA的大小对转染效率有很大影响.有研究发现粒径较小的质粒的转染效率较高,这可能是因为较小的质粒DNA较容易从细胞质扩散至核周围,也比较容易通过核膜孔进入核内.Lukacs等发现大小在100bp以内的DNA片段可以在Hela细胞的细胞质中自由移动.而随着质粒DNA片段的增大,其在细胞质中的迁移能力也随之降低,当DNA片段大小达到2000bp或以上时就完全失去迁移能力. Katrien等将3种构型(超螺旋,开环及线型)的质粒DNA与DOTAP(见图3)/DOPE阳性脂质体复合得到的复合物分别转染V ero细胞,结果发现超螺旋LD的转染效率最高.实验还表明超螺旋DNA 的转染效率之所以会比其他2种构型的要高,并不是因为其在细胞核内的转录效率高,而很可能是因为其更容易从细胞浆中转移至细胞核内.3阳性脂质体用作基因载体的研究进展阳性脂质体作为基因载体虽有许多优势,但仍存在许多问题:转染效率仍较低;生物相容性及靶向性均有待提高;仍有潜在的细胞毒性等.近年来的研究大多针对这些问题对阳性脂质体进行改造,如开发新的阳性脂质成分;对阳性脂质体或LD进行表面修饰;更有效地压缩DNA从而提高转染效率;改善基因治疗给药方式等各种方法提高LD的转染效率.3.1开发新型的阳性脂质成分研究表明不同阳性脂质的分子结构及所带电荷不同对阳性脂质的基因转染效果影响很大,故研制高效且低毒的阳性脂质成分一直是研究的重点之一.目前开发的新型阳性脂质成分除了能够更有效地压缩携带DNA外,还能明显提高LD在血清中的稳定性.Kim等¨报道了一系列新型的阳性脂质成分,通过体内实验筛选得到DMKD(见图6)与DMKE (见图7)2种活性较高的阳性脂质成分,分别由1个赖氨酸残基,2条14碳烃链以及天冬氨酸残基或一1932一中国新药杂志2007年第l6卷第23期谷氨酸残基组成.使用这两种材料分别制得DMKD/Chol/Rho—PE和DMKE/Chol/Rho—PE阳性脂质体,以DOTAP/Chol/Rho—PE阳性脂质体为对照组体外转染4种不同的细胞系:Chang,HRT一18,293以及HepG2细胞,结果表明在这4种细胞系中DMKD脂质体与DMKE脂质体的转染效率均比DOTAP脂质体的高出3～10倍,且在HRT一18,293及HepG2细胞中,DMKE脂质体的转染效率显着高于DMKD脂质体.体外理化性质的研究表明DMKD及DMKE脂质体的膜完整性及电荷强度均高于DOTAP脂质体,这一特点对复合物与细胞膜的结合非常有利.Serika—wa等…将DC一6—14(见图8),DOPE以物质的量比5:2制备得到阳性脂质体,体外实验表明在含5%牛胎血清的缓冲液中1h该LD仍能保持结构完整且仍具有转染活性,而对照组lipofectAMINE/DNA复合物在含5%牛胎血清的缓冲液中15rain结构即被破坏.Antipina等¨则开发了一种pH敏感的阳性脂质体.如前所述DNA从核内体中释放出来是阳性脂质体介导基因转染的限速过程之一,而这种阳性脂质具有pH敏感的性质,即当复合物进入细胞后,由于核内体中pH值的改变,复合物形态和结构发生改变从而释放出DNA.且体外实验表明该阳性脂质与DNA在pH值4的环境中结合量远大于其在pH值8的环境中的结合量,这些都对其提高转染效率十分有利.RI2COzR\厂———————._1H2N/l2(CH2).J图6O,O'一二肉豆蔻酰一』v一赖氨酰谷氨酸盐酸盐(DMKD) H2N,【lH>～c—N,/co2R1.2HcI<一～]H2N/IcH2(CH2)cHl』C\/HaO一昌I\I.O图8O,O'一二肉豆蔻酰一N一(一三甲铵嘌呤内乙酰基)二乙醇胺盐酸盐(DC-6.14)ChineseJournalofNewDrugs2007,V o1.16No.233.2对阳性脂质体进行表面修饰静脉注射LD之后,其表面所带正电荷使其很容易与血细胞如巨噬细胞,单核细胞,中性粒细胞,血小板,红细胞等发生非特异性反应,不仅很可能导致LD还没有到达靶组织就发生解离或者被清除,还有可能会导致血液凝结,潜在的致炎反应以及转氨酶升高等现象的发生.因此科学家试图通过对阳性脂质体或LD进行表面修饰来解决这些问题.目前有很多这方面研究成功的例子,但也有研究表明该方面的研究还有待进一步完善.3.2.1多价阳离子脂质体提高压缩DNA能力目前通过常用的阳性脂质制得的脂质体多为单价阳性脂质体,通常不能有效地压缩DNA,从而影响其转染效率.近年来越来越多的研究在LD的制备过程中加入新的阳性成分来提高其压缩DNA的能力,这些阳性成分多为多价阳离子聚合物,蛋白质或多肽等,均能有效地压缩DNA.目前研究较多的材料是聚左旋赖氨酸(PLL),鱼精蛋白,衍生肽,合成肽,聚乙烯亚胺(PEI)等.其中PEI不仅有较强的DNA结合能力和细胞黏附能力而且具有强缓冲能力,是近年来的研究热点之一.但是单纯的PEI作为转基因载体体内应用存在毒性大及靶向性差等问题,因此研究者认为将PEI与阳性脂质体联合使用作为基因载体,可以产生一定的协同作用. Garcia等建立了一种由阳性脂质体,PEI和核酸组成的三元复合物.通过5种不同的制备方法以及不同的阳性脂质体:PEI:DNA(物质的量比)制备得到一系列三元复合物,以LD,阳离子聚合物/ DNA复合物为对照组,体外转染HepG2细胞,在60%胎牛血清存在的情况下,不同处方的三元复合物均比对照组表现出较高的转染效率以及较低的毒性.同时实验还证明了DNA压缩后的大小不仅影响其在体内的分布情况,而且影响其通过胞吞作用进入细胞的效率.Tagawa等16]则构建了一种由脂质体,mu(腺病毒核心肽),DNA组成的三元核酸给药系统(LMD). 该体系首先将质粒DNA与mu以1:0.6的质量比例混合得到MD复合物,该过程中DNA被充分压缩, 然后再将该复合物与阳性脂质体混合,最终脂质体: mu:DNA的质量比例为12:0.6:1.该给药体系表现出很高的稳定性,且体外转染时所需时间短(10min),质粒DNA的剂量小(0.001/zg/~L即有明显的基因表达).即使在100%血清中仍有转染能力(转染效率为在不含血清介质中的15%一25%).同时中国新药杂志2007年第16卷第23期体内实验也证实该体系在肺部有很高的转染能力.3.2.2立体稳定脂质体提高稳定性由于表面带了较多的正电荷,LD在体液环境中相当不稳定.静脉注射LD后由于带正电荷与血液中的带负电的蛋白质结合,导致其聚集并沉淀下来,并且很容易被网状内皮系统(RES)识别并清除.由此研究人员认为可以对阳性脂质体或LD进行表面修饰,将其制成立体稳定脂质体,抑制其与血清蛋白的结合,从而达到增加LD在血液中的稳定性,延长其在体内的循环时间的目的.目前研究较多也较常用的修饰成分为聚乙二醇(PEG),但也有很多有关新型的修饰成分的研究.Garinot等Ⅲ研究开发了一种两亲性的聚醚树状分子,并用其修饰双十八胺(DODA)/ DOPE阳性脂质体.他们以绿色荧光蛋白基因为报告基因,PEG修饰的阳性脂质体为对照组进行体内外实验.体外转染实验表明用该树状分子修饰的LD在血清中稳定性显着高于PEG修饰的LD.同时体内实验证明该树状分子修饰后的LD在体内循环时间比PEG修饰的复合物提高了5倍.Papanic- olaotl等则合成了一种新多价共聚物pI-IPMA (MA—GG—ONp),在pHPMA,聚[Ⅳ-(2-羟丙基)异丁烯酰胺]上接上二肽Gly—Gly来修饰阳性脂质体. 该共聚物可通过多个共价键与脂质体表面的伯胺连接形成亲水衣层,而PEG则是通过单个共价键连接形成亲水衣层.通过多个共价键连接更容易形成亲水衣层且制剂稳定性更高.用该聚合物修饰的LD 同样在血清中稳定性显着提高,但是体外转染实验却发现转染效率比普通LD要低.这可能因为修饰成分在阻止LD在血清中聚集沉淀的同时也阻止其在细胞膜上的沉积,影响了LD的细胞摄取.3.2.3表面修饰配体提高靶向性为了使药物能够有效地输送到靶组织,可以将能与靶组织特异结合的配体连接至药物的传递系统上,以提高靶组织的药物浓度.这一新型的药物传输理论也指导着基因给药.可用于基因给药的配体包括多肽,糖,蛋白等,如靶向肿瘤的配体有叶酸,转铁蛋白等;靶向肝细胞的配体有半乳糖,去唾液酸糖蛋白等.配体可以直接与阳性脂质体连接,也可以通过PEG链与脂质体共价相连,既能达到靶向目的,又能起到亲水性的屏蔽性能.Y an等合成了胆固醇-5一氧-Ⅳ- {4.[(1-亚氨基-2-D-硫代甘露糖-乙基)氨基]丁基t 甲酰胺(Man.C4.Cho1),该化合物具有一个氨基可以与pDNA通过静电结合,还有一个甘露糖残基可以与细胞膜上的受体结合.通过该化合物即可将甘露一1933—糖修饰于阳性脂质体的表面,进而达到靶向作用. 石靖等将阳性脂质体表面修饰PEG及豆甾醇糖苷(SG,一种含有胆固醇.B.D.葡糖苷的天然混合物,可以与肝实质细胞上的去唾液酸糖蛋白受体特异性结合),得到了一种靶向肝实质细胞的阳性脂质体.该阳性脂质体表现出较高的肝脏聚集性,且在肝实质细胞中的浓度显着高于普通阳性脂质体,在非实质细胞中的浓度则明显小于普通阳性脂质体.Morimoto等发现TRX.20可与硫酸软骨素糖蛋白发生特异性结合,因此制备得到了表面修饰有TRX?20以及PEG的阳性脂质体,不仅具有循环时间长(半衰期14h)的特点,且能与体外培养的人肾小球系膜细胞特异性结合,而与内皮细胞却无此特异性结合.体内分布实验表明该制剂具有很好的肾靶向性.以上这些对阳性脂质体的表面修饰还可以联合使用,通过共同修饰作用达到一种协同作用.Shige. ta等利用组氨酸的质子海绵效应以及半乳糖的肝细胞靶向性,制备得到Ga1.His.C4.Chol/DOTAP 阳性脂质体/DNA复合物.实验证明该复合物不仅具有与Ga1.C4?Chol/DOTAP阳性脂质体/DNA复合物相同的肝靶向性,且体外转染效率显着增高.3.3其他LD不仅可以静脉注射全身给药,而且可以通过皮肤等局部给药方式给药.透皮给药中,提高脂质体的形变能力是提高其透皮能力的有效途径,常用的方法是使用生物表面活性剂如胆酸钠,熊脱氧胆酸(UDCA)等对阳性脂质体进行修饰.Ruozi等即将UDCA加入到DOTAP阳性脂质体的脂质双分子层中,得到了具超弹性形变能力的阳性脂质体.细胞摄取实验表明,由于该LD具备了很好的弹性形变能力,因此更容易进入细胞.UDCA的抗氧化能力有效提高了脂质体脂质双分子层的稳定性.同时由于UDCA具有一定的抗细胞凋亡效应和细胞保护作用,经UDCA修饰的LD的毒性有效降低.4结语近年来研究人员通过开发新的阳性脂质成分,对阳性脂质体或LD进行表面修饰,提高载体压缩DNA的能力等来改善阳性脂质体介导基因转染的能力.这些方面的研究均有很大的进展,如提高了复合物的稳定性,靶向性,转染效率等.特别是有关阳性脂质体及其DNA复合物修饰方面的研究,Ko. starelos等…提出了自组装ABCD纳米给药体系的概念.该体系从里至外分为ABCD四层:A即经压——1934——中国新药杂志2007年第16卷第23期缩后的DNA;B为脂质层;C为生物稳定层,即脂质体表面修饰有PEG等;D为生物识别层,即脂质体表面修饰有配体等.可以看出通过改造这4层结构对LD进行系统完善是目前也是今后该领域的研究重点.另外,进一步揭示LD在体内的转移机制及其与细胞之间的反应机制等也是该领域研究的重点之一,该方面的研究对于改善阳性脂质体介导的基因转染具有重要的指导作用.相信随着这几个方向研究的深入,以阳性脂质体为载体的基因给药体系必将在基因治疗中发挥更大作用.[作者简介]郑肖利(1982一),女,硕士研究生.联系电话:(021)25074593,E—mail:***************.[通讯作者]陈建明(1964一),男,硕士生导师,主要从事药物制剂及其机制研究.联系电话:(021)25074593,E.mail:*************.[参考文献]KOSTARELOSK,MILLERAD.Synthetic,self-assemblyABCD nanoparticles:astructuralparadigmforviablesyntheticnon—viralvectors[J].ChemSocRev,2005,34(11):970—994.CHENGJ,ZEIDANR,MISHRAS,eta1.Structure—function correlationofchloroquineandanaloguesastransgeneexpression enhancersinnonviralgenedelivery[J].JMedChem,2006,49 (22):6522—6531.AHMADA,EVANSHM,EWERTK,eta1.Newmuhivalent cationiclipidsrevealbellcurvefortransfectionefficiencyversus membranechargedensity:lipid—DNAcomplexesforgenedelivery [J].JGeneMed,2005,7(6):739—748.ALMOFTIMR,HARASHIMAH,SHINOHARAY,eta1.Lipo—plexsizedetermineslipofectionefficiencywithorwithoutserum [J].MolMembrBiol,2003,20(1):35—43.REJMANJ,OBERLEV,ZUHORNIS,eta1.Size—dependentin—ternalizationofparticlesviathepathwaysofclathrin—andcaeolae?r mediatedendocytosis[J].BiochemJ,2oo4,377(1):159—169. 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阳离子脂质体转染效率影响因素的研究进展黄柯鑫【摘要】目前用于基因转染的载体主要有病毒载体和非病毒载体两大类.病毒载体的转染效率最高,但由于其容易造成感染和致癌性等安全性问题限制了它在临床中的应用.阳离子脂质体(cationic liposomes)是一种非常具有发展前景的非病毒基因载体.其生物膜特性,能使其转运的基因保持生物活性,保护基因免受溶酶体的降解,且具有无免疫原性、操作简单、对转移基因大小没有限制、重复性好、可自然降解等优点,而成为世界性的研究热点.【期刊名称】《医学理论与实践》【年(卷),期】2012(025)014【总页数】3页(P1704-1705,1710)【关键词】阳离子脂质体;转染;转染效率;影响因素【作者】黄柯鑫【作者单位】广东医学院神经病学,广东省湛江市,524000【正文语种】中文【中图分类】R33820世纪80年代，Felgner等首次通过实验证明了阳离子脂质体可用于DNA转染。

近年来，基因转染技术在生物学研究领域和临床应用都已取得了很大的进展。

阳离子脂质体安全性好、操作简单，被广泛用于DNA、RNA的细胞转染。

阳离子脂质体在基因转染的成功运用，为基因转移开辟了一条新途径，并显示出广阔的前景。

然而，阳离子脂质体参与体内外基因转染的过程中，受到诸多因素的影响，现就其进展综述如下。

1 脂质体介导的基因转移机制阳离子脂质体介导的基因转染主要通过胞吞作用进入细胞内，其机制可简述为：带正电的阳离子脂质体通过静电作用与带负电的基因（DNA或RNA）形成脂质－基因复合物（lipoplexes，简称脂质复合物），阳离子脂质体表面过剩的正电荷通过静电作用吸附于带负电的细胞膜上［1］，而脂质体本身具有的亲脂性，使脂质复合物通过细胞内吞或细胞膜融合作用进入细胞内形成内涵体；脂质复合物在细胞质中或进一步传递到细胞核内释放基因，从而在细胞内转录和翻译。

2 影响阳离子脂质体转染效率的因素2.1 阳离子脂质体的构型深入探究阳离子脂质体的构效关系，对提高其转染效率有着重要的意义［2］。