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基因工程复习资料整理核酸酶:生物体内存在一类对DNA和RNA作用的酶核酸外切酶:是一类能从多核苷酸链的一端开始按序催化降解核苷酸的酶。
按作用的特性差异可以将其分为单链的核酸外切酶和双链的核酸外切酶。
核酸内切酶:使DNA分子在内部特定的位点上断裂的酶工具酶:基因工程:利用现代分子生物学技术，特别是酶学技术，对遗传物质DNA直接进行体外重组操作与改造，将一种生物（供体）的基因转移到另外一种生物（受体）中去，从而实现受体生物的定向改造与改良。
基因表达:(gene expression)是指细胞在生命过程中,把储存在DNA顺序中遗传信息经过转录和翻译,转变成具有生物活性的蛋白质分子。
融合蛋白:（fusion protein）：是指由克隆在一起的两个或两个以上的不同基因的编码序列组成的融合基因，转译产生的单一的多肽序列。
融合基因:（fusion gene）：是指应用DNA 体外重组技术构建的，一类具有来自两个或两个以上的不同基因核苷酸序列的新型基因。
载体:在基因工程操作中，把能携带外源DNA进入受体细胞的DNA分子叫载体。
基因组DNA:指含有整个物种所有基因序列的核酸，相对于细胞质基因如质粒DNA，线粒体DNA而言的核基因cDNA文库:以mRNA为模板在反转录酶的作用下将形成的互补DNA（cDNA）建立基因文库基因文库:将某种生物细胞的整个基因组DNA切割成大小合适的片断，并将所有这些片断都与适当的载体连接，引入相应的宿主细胞中保存和扩增。
理论上讲，这些重组载体上带有了该生物体的全部基因，称为基因文库。
基因组文库:用限制性内切酶切割细胞的整个基因组DNA，可以得到大量的基因组DNA片段，然后将这些DNA片段与载体连接，再转化到细菌中去，让宿主菌长成克隆。
这样，一个克隆内的每个细胞的载体上都包含有特定的基因组DNA片段，整个克隆群体就包含基因组的全部基因片段总和质粒:是独立于染色体意外的能自主复制的双链闭合环状DNA分子同尾酶:Isocaudamers 识别序列不同，但能切出相同的粘性末端同裂酶:Isoschizomers 识别位点的序列相同的限制性内切酶供体细胞:提供DNA的细胞受体细胞:可摄取外源DNA并使其稳定维持的细胞，具有应用价值或理论价值。
名词解释1.基因工程基因工程是值在体外合成或重组特定的DNA，再与载体连接，最后导入到宿主细胞内表达、扩增出人们需要的蛋白质，而且使这种性状可遗传给后代的技术。
包括上游技术和下游技术。
2.基因工程制药基因工程制药是通过基因工程的方法生产药物，具体包括获得目的基因、构建重组质粒、构建基因工程菌、培养工程菌、产物分离纯化、产品加工检验等步骤。
3.逆转录逆转录（reverse transcription）是某些RNA病毒由逆转录酶直接利用RNA为模板合成DNA的过程。
4.CDNA以生物细胞的mRNA为模板，在逆转录酶的作用下合成cDNA的第一条链，然后在合成双链DNA，并将合成的cDNA双链重组到质粒载体或噬菌体载体上，倒入宿主细胞进行增殖。
在这个过程中合成的双链DNA叫做cDNA。
5.引物引物是人工合成的单链DNA小片段，碱基顺序分别与所要扩增的模板DNA双链的5’端相同。
是PCR的起始点。
6.表达载体所谓表达载体（expression vector）是指具有宿主细胞基因表达所需的调节控制序列，能使外源基因在宿主细胞内转录和翻译的载体。
7.克隆载体克隆载体（cloning vector)是把一个有用的制药DNA片段通过重组DNA技术，送进受体细胞中进行繁殖的工具。
8.载体载体（vector），指在基因工程重组DNA技术中将DNA片段（目的基因）转移至受体细胞的一种能自我复制的DNA分子。
9.报告基因载体分子上有一种特殊意义的基因序列，它们表达的目的是为了证明载体已经进入宿主细胞，并将含有外源基因的宿主细胞从其他细胞中区分并挑选出来。
这种基因就是报告基因。
10.启动子启动子是位于结构基因5'端上游的DNA序列，能被RNA聚合酶识别并结合，具有转录起始的特异性11.PCR聚合酶链式反应是一种体外放大扩增特定DNA片段的分子生物学技术，它主要包括变性、退火、延伸三个过程，并且多次循环。
12.包涵体包涵体（inclusion body）是存在于细胞质中的一种不可溶的蛋白质聚集折叠而形成的晶体结构物。
专题一基因工程1、基因工程的原理是，是在水平上进行设计和施工。
2、限制酶主要是从生物中分离纯化出来的。
3、限制酶能够识别双链DNA分子的某种，并且使每一条链中部位的两个核苷酸之间的键断开。
4、限制酶切割产生的DNA片段末端通常有两种形式：和。
5、DNA连接酶可分为和两大类。
二者都缝合键，但是前者只能连接末端。
6.运载体具备的条件：①有一个至多个，以便于。
②能进行，以便于保持遗传信息的连续性。
③有特殊的，以便于。
7、基因工程中使用的载体有：、和等。
其中最常用的是。
8、质粒本质上是小型环状的。
9、基因工程的基本操作程序主要包括四个步骤：、、、。
10、利用PCR技术扩增目的基因的原理是11、基因工程操作程序的核心步骤是12、构建好的基因表达载体包括、、和四部分。
13、启动子是一段有特殊结构的，是识别和结合的部位，能驱动基因。
终止子也是一段有特殊结构的，位于基因的。
14、标记基因的作用：；常用的标记基因是。
15、将目的基因导入植物细胞时受体细胞既可以是也可以是。
采用最多的方法是，其次还有和等。
16、将目的基因导入动物细胞时最常用的方法是。
此方法的受体细胞必须是。
17、原核生物细胞作为基因工程受体细胞的原因是，其转化方法中要先用处理受体细胞，使其成为细胞，18、目的基因的检测与鉴定(1)首先要检测目的基因是否插入受体细胞染色体DNA上，方法是采用技术。
(2)其次还要检测，方法是采技术。
(3)最后检测目的基因是否翻译成蛋白质，方法是采用。
19、探针本质上是用放射性同位素标记的含有基因的一段DNA单链。
1。
基因工程复习归纳第一章绪论1.基因工程的定义：是指按照人们的愿望，经过严密的设计，将一种或多种生物体（供体）的基因与载体在体外进行拼接重组，然后转入另一种生物体（受体/宿主）内，使之按照人们的意愿稳定遗传、并表达出新的性状的技术。
2.基因工程概念的发展：遗传工程→DNA重组技术→分子/基因克隆（Molecular/Gene→基因工程→基因操作。
应用领域以“基因工程”、“DNA重组”为主基因工程基因工程的历史性事件1973：Boyer和Cohen建立DNA重组技术1978：Genetech公司在大肠杆菌中表达出胰岛素1982：世界上第一个基因工程药物重组人胰岛素上市1988：PCR技术诞生1989：我国第一个基因工程药物rhIFNα1b上市2003: 世界上第一个基因治疗药物重组腺病毒-p53上市3.基因工程的三大关键元件基因（供体）：外源基因、目的基因载体：能将外源基因带入受体细胞，并能稳定遗传的DNA分子（克隆载体、表达载体）。
宿主（受体）：，能摄取外源DNA、并能使其稳定维持的细胞（组织、器官或个体）。
4.基因工程的基本步骤（切、接、转、增、检（大肠杆菌是中心角色）（1）目的基因的获取：从复杂的生物基因组中，经过酶切消化或PCR扩增等步骤，分离出带有目的基因的DNA片断。
（2）重组体的制备：将目的基因的DNA片断插入到能自我复制并带有选择性标记（抗菌素抗性）的载体分子上。
（3）重组体的转化：将重组体（载体）转入适当的受体细胞中。
（4）克隆鉴定：挑选转化成功的细胞克隆（含有目的基因）。
（5）目的基因表达：使导入寄主细胞的目的基因表达出我们所需要的基因产物。
第二章 DNA重组克隆的单元操作一、用于核酸操作的工具酶1.限制性核酸内切酶(主要存在于原核细菌中，帮助细菌限制外来DNA的入侵)。
限制性核酸内切酶的功能与类型其中II型限制性核酸内切酶：切割位点专一，适于DNA重组，是DNA重组中最常用工具酶。
基因工程：称基因操作、重组DNA。
基因工程是以分子遗传学理论为基础，以分子生物学和微生物学的现代方法为手段，将不同来源的基因(DNA 分子)，按预先设计的蓝图，在体外构建杂种DNA 分子，然后导人活细胞，以改变生物原有的遗传特性，获得新品种，生产新产品，或是研究基因的结构和功能。
穿梭载体：含有细菌质粒和克隆的真核生物DNA片段的杂种质粒，有两个复制起点和既能在细菌又能在真核细胞中进行选择的选择标记，所以，很容易从一宿主转到另一个宿主乙。
穿梭质粒：指一类由人工构建的具有两种不同复制起点以及相应的选择标记基因，因而可在两种不同种属的受体细胞中复制和检测的质粒载体。
同裂酶：不同来源的限制性内切核酸酶具有相同的识别序列，产生完全相同的黏性末端。
重组率：在连接反应结束后，含有外源DNA片段的重组分子数与所投入的载体分子数之比。
cDNA文库：由cDNA法构建的基因文库，只含有某一生物体的所有蛋白质编码序列，一般不含有DNA调控序列。
基因组文库：由鸟枪法构建的基因文库，含有某一生物染色体的所有DNA片段，包括基因编码区和间隔区DNA。
感受态：受体细胞最易接收外源DNA片段而实现转化的一种特殊生理状态。
同尾酶：一些来源不同的限制性核酸内切酶识别的靶序列各不相同，但都产生相同的粘性末端，这类酶称为同尾酶。
接头：是一段含有某种限制性核酸内切酶识别序列的人工合成的寡聚核苷酸，通常是八聚体和十聚体。
转化：将质粒DNA 或以它为载体构建的重组质粒导入细菌中的过程称为转化。
星号活性：Ⅱ类限制性核酸内切酶虽然具有特异性的识别序列和切割的位点，但是当酶解条件发生变化时，酶切反应的专一性可能会降低，导致同种酶识别多种序列，这种现象称为限制性核酸内切酶的星号活性。
动物乳腺生物反应器：能够分泌乳汁的转基因动物生产其他来源的基因产品，并通过乳腺分泌出来。
细菌的限制—修饰系统：细菌中有作用于同一DNA 的两种酶，即分解DNA 的限制酶和改变DNA 碱基结构使其免遭限制酶分解的修饰酶。
1. 基因工程概念：基因工程是一门以分子遗传学为理论基础、以分子生物学和微生物学的现代技术方法为手段的新兴交叉学科，它诞生于1973年，其发展十分迅速，新知识、新概念、新技术不断涌现，并广泛渗透到生命科学的各个领域，带动了整个生命科学的发展，是现代生物技术中的核心技术。
它为人类创造新生物开辟了新天地。
2. 基因工程的定义：基因工程是将不同来源的基因（DNA分子），按照工程学的方法进行设计，在体外构建成杂种DNA分子，然后导入受体细胞，并在受体细胞内复制、转录、表达的操作。
基因工程又称DNA重组技术。
3. 基因工程的特点及实施条件：基因工程的最大特点是分子水平上的操作，细胞水平上的表达。
其实施包括四个必要条件：工具酶、基因、载体和受体细胞。
4. 基因工程的基本步骤：（1）分离制取带有目的基因的DNA片段；（2）DNA片段和载体DNA 在体外连接；（3）将重组DNA分子导入合适的受体细胞，并扩增繁殖；（4）从大量的细胞繁殖群体中，筛选出获得了重组DNA分子的重组体克隆；（5）外源基因的表达和产物的分离纯化。
5. DNA复制的特点：（1）DNA的复制是从特定的复制起始点开始并按5’-3’的方向进行；（2）DNA 分子的半保留复制；（3）DNA分子的半不连续复制；（4）DNA分子复制是通过DNA聚合酶及各种相关酶蛋白、蛋白因子的协同有序的工作完成的；（5）DNA分子复制具有高度的精确性和准确性。
6. DNA的变性、复性与杂交：在高温、强碱及某些试剂存在的条件下，双链DNA分子氢键断裂，两条链完全分离，形成单链DNA分子，这种情况称为DNA变性。
DNA的复性是指变性DNA在适当的条件下，二条互补链全部或部分恢复到天然双螺旋结构的现象，它是变性的逆转过程。
热变性DNA一般经缓慢冷却后即可复性，此过程称之为“退火”。
杂交的基本原理是应用核酸分子的变性和复性的性质，使来源不同的DNA（或RNA）片段按碱基互补关系形成杂交双链分子。
基因工程复习重点一、载体PTXBⅠOri 原核生物复制起点T7 promotor T7启动子是最强的启动子，指导转录起始。
Lac opterator 乳糖操纵基因，可被Lac I编码的阻遏蛋白结合抑制转录。
SD 原核生物翻译起始时核糖体的识别序列位于mRNA上MCS 多克隆位点可插入外源基因，不影响其复制。
内含多个酶切位点、如图。
Intein 内含肽CBD chitin binding domain（几丁质结合位点）可与Tag（亲和标记）结合Stop code 终止密码子Amp氨苄抗性基因可用作抗性筛选的重要标记Lac I 乳糖调控基因编码阻遏蛋白二、质粒提取原理：答：三种溶液：溶液1：50 mmol/l 葡萄糖- --维持渗透压，防止DNA受机械损伤降解；25 m mol/l Tri· Cl （pH 8.0)---维持pH;10 m mol/l EDTA (pH 8.0)------螯合Ca2+, DNase 失活，保护DNA溶液2：0.2 mol/ NaOH----------核酸变性（pH>12或pH<3) (解链）1% SDS-----------------蛋白变性，裂解细胞。
溶液3：7.5 mol/L NH4AC （pH 7.6) -------沉淀蛋白，大分子核酸，调节pH,使小分子核酸复性（可溶）。
其它溶液：(1)2M NH4AC------------------------------沉淀蛋白，溶解核酸；(2)异丙醇-----------------------------沉淀质粒(3)70％乙醇----------------沉淀质粒，除去异丙醇，盐分。
(4) RNase--------------------------------除去细菌RNA过程及作用：(1) 1.5 ml 菌液，12000 rpm * 1 min, 弃上清（repeat) －－收集细菌(2)溶液1 (200 ul), 剧烈混匀－－－－－－－－－－－－－提供缓冲液(3)溶液2 (400 ul)，温柔混匀，冰中5 min;－－－－－－－裂解细胞，蛋白核酸变性(4)溶液3 (300 ul), 温柔混匀，冰中10 min;－－－－－－－质粒复性(5)13000 rpm* 5 min, 取上清；－－－－－－－－－－－－除去细菌蛋白，基因DNA(6)540 ul 异丙醇，室温10 min;－－－－－－－－－－－－沉淀质粒(7)14000 rpm * 10 min, 弃上清；－－－－－－－－－－－－除去可溶性杂质(8)100 ul 2M NH4AC(9)13000 rpm* 5 min, 取上清；(10)100 ul 异丙醇，室温10 min;(11)14000 rpm * 10 min, 弃上清；(12)70%乙醇500 ul, 14000 rpm * 10 min, 弃上清；－－－－－除去异丙醇，盐分(13)烘干10-30 min, －－－－－－－－－－－－－－－－－除去乙醇(14)50 ul ddH2O (含0.1 mg/ ml RNase), 37°C* 30 min.－－－－除去细菌RNA(15)电泳鉴定三、连接反应答：1、总体积为10 ul ；2、16 ℃连接过夜；（为什么是16 ℃？答：连接反应包括两步一是将碱基50%连接（变性）：Tm=2（A+T）+4（G+C），一般在8℃左右。
1、有关基因工程 PPT 中出现的概念术语的英文写法需掌握genetic engineering 基因工程open reading frame, ORF 开放读码框exon 外显子intron 内含子recombination 重组replication 复制transcription 转录translation 翻译expression 表达purpose gene 目的基因functional cloning 功能克隆phenotypical cloning 表型克隆differential screening 差异筛选法subtractive hybridization, SH 差减杂交法DDRT-PCR mRNA 差别显示技术representative differentiation analysis, RAD代表性差异分析suppression subtractive hybridization, SSH抑制性差减杂交mapbased gene cloning 图位克隆transposon tagging cloning 转座子标签克隆denaturation 变性anealling 退火extension 延伸polymerase chain reaction PCR 聚合酶链反应anchored PCR 锚定PCR Inverse PCR 反向PCR gene library 基因文库vector 载体restriction endonuclease 限制性内切酶ligase 连接酶intermediate expression vector 中间表达载体chimeric gene 嵌合基因disarmed vector 卸甲载体Co-integrated vector 共整合载体Cis-vector 顺式载体binary vector 双元载体trans vector 反式载体green fluorescent protein,GFP 绿色荧光蛋白Part4purpose gene 目的基因totipotency 全能性vitrification 玻璃化agrobacterium- mediated 农杆菌介导genetic transformation 基因转化leaf disc transformation 叶盘转化法DNA-Direct Introduction DNA 直接导入liposome 脂质体liposome fusion 脂质体融合法liposome injection 脂质体注射法electroporation 电穿孔法gene gun, particle gun, biolistics,biological ballstics, microprojectile 基因枪法germ line transformation 种质转化microinjection 显微注射法direct injection or macroinjection 直接注射法pollen–tube pathway 花粉管通道法Part5transgenic plant 转基因植物total DNA 植物细胞总DNA CTAB (cetyltriethylammonium bromide)十六烷基三乙基溴化铵SDS (Sodiumn-Dodecyl Sulfate) 十二烷基磺酸钠gus β- 葡萄糖苷酸酶基因gfp 绿色荧光蛋白基因antigen 抗原antibody 抗体ELISA (enzyme-linked immuno sorbent assay):酶联免疫吸附法Part6GMOs 转基因生物gene transfer 基因逃逸via gene-deletor technology 外源基因清除male sterility 雄性不育seed sterility 种子不育marker free 无标记2、第一章绪论中关于基因工程发展历史中关于理论发现和技术发明的几个重要事件、全球转基因作物现状概况理论发现：(1)遗传物质的化学本质是DNA (Avery等，1944)(2)DNA双螺旋结构模型和半保留复制机制(Watson and Crick, 1953)(3)遗传密码的破译(Nirenberg等，1964)和“中心法则”(Crick, 1957)技术发明：(1)限制性核酸内切酶的发现与DNA的切割技术(Smith和Wilcox, 1970)、(2)DNA连接酶的发现(Weiss和Richardson，1966)与DNA片段的连接(Berg和Jackson, 1972)、(3)基因工程载体的发现与应用(Cohen,1973)为基因工程技术提供了技术保障。
基因工程复习提纲-完善复习提纲1．什么是基因？基因：DNA分子中含有特定遗传信息的一段核苷酸序列，是遗传物质的最小功能单位。
2．基因工程的诞生基因工程诞生于1973年。
1973－1974年，美国科学家科恩等以大肠杆菌为材料，成功地进行了三次基因工程试验。
试验结果证明，用基因工程可以打破不同物种间在亿万年中形成的天然屏障，任何不同种类生物的基因都有可能通过基因工程技术而组合到一起。
人类进入了激动人心的基因工程时代。
3．基因工程的定义及三大基本元件。
定义：基因工程是指重组DNA技术的产业化设计与应用，包括上游技术和下游技术两大组成部分。
上游技术指的是基因重组、克隆和表达的设计与构建（即重组DNA技术）；而下游技术则涉及到基因工程菌或细胞的大规模培养以及基因产物的分离纯化过程。
三大基本元件：限制性核酸内切酶（restriction enzymes）/DNA连接酶（ligase）/基因工程载体（vector）4．基因工程的研究内容(1) 从生物有机体复杂的基因组中，分离出带有目的基因的DNA片段；(2) 在体外，将带有目的基因的DNA片段连接到能够自我复制并具有选择标记的载体分子上，形成重组DNA分子;(3) 将重组DNA分子引入（转）到受体细胞(亦称宿主细胞或寄主细胞);(4) 从大量的细胞繁殖菌落中，筛选出具有重组DNA分子的细胞克隆;(5) 将目的基因克隆到表达载体上，导入寄主细胞，使之在新的遗传背景下实现功能表达，产生出所需要的物质。
5．基因工程的技术准备及技术支撑。
技术准备技术支撑：核酸凝胶电泳技术核酸分子连接技术/细菌转化技术/DNA序列分析技术/寡核苷酸合成技术/基因定点突变技术/聚合酶链式反应（PCR）技术5．基因工程的基本用途分离、扩增、鉴定、研究、整理生物信息资源大规模生产生物活性物质设计、构建生物的新性状甚至新物种基因工程在农业生产中的应用1.提高植物的光合作用效率2.提高豆科植物的固氮效率3.转基因植物4.转基因动物基因工程在工业中的应用1.纤维素的开发利用2.酿酒工业基因工程在医药上的应用1.用转基因植物或动物生产药物2.用微生物生产药物3.设计高效高特异性的生物制剂4.研制疫苗5.基因诊断6.法医鉴定7.基因治疗基因工程在环境保护中的应用1.检测水污染2. 生物降解7．核酸酶的分类1）根据核酸底物分RNA酶（Rnase）/DNA酶（Dnase）/底物非专一性核酸酶；2）根据作用方式分内切核酸酶（endonuclease）/外切核酸酶（exonuclease）；3) 根据对底物碱基专一性分碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列高度专一性）非碱基专一性核酸酶（切割部位的碱基序列随机性）8．细菌中的防卫系统：限制与修饰现象。
第一章基因工程：在分子水平上对基因进行操作的复杂技术，将外源基因通过在体外重组导入受体细胞内，使这个基因在受体细胞内复制、转录、翻译表达的过程。
基因工程药学：应用基因工程技术，研制和开发核酸、多肽和蛋白质药物的理论、方法和应用的一门学问。
基因工程药物的特征：第一，基因工程药物来源的过程应当是外源核酸分子在不同种寄主细胞中进行繁殖，能够跨越天然物种屏障，把来自任何一种生物的基因放置在新的生物细胞中，而这种生物与原生物毫无亲缘关系。
第二，所表达基因工程药物的DNA小片段在新的寄主细胞中进行扩增，实现很少量的DNA样品拷贝出大量的DNA分子，而且是大量的没有任何其他DNA序列污染的，绝对纯净的DNA分子群体，再由这些DNA分子群体经转录、翻译、翻译后蛋白质折叠、修饰最后成为具有生物活性的基因工程药物。
基因工程药学的主要研究内容：一，用基因工程技术制备体内缺乏的多肽或蛋白质，来替代或补充体内对这类活性多肽或蛋白质的需求。
二，研究蛋白质的生物学活性。
三，研究基因工程药物的临床应用。
基因工程技术方法：1、目的基因的获取2、基因表达载体的构建3、目的基因导入受体细胞4、阳性克隆的筛选鉴定5、表达蛋白的生产和纯化6、理化、生物活性和毒性的一系列检测。
第二章基因克隆主要包括：1、连接外源基因和克隆载体，构建重组DNA分子2、将重组DNA分子导入受体细胞，使外源基因随受体细胞的分裂而复制、扩增。
限制restriction：限制性内切酶将侵入细菌体内的外源DNA切成小片段。
修饰modification：细菌自身的DNA碱基被甲基化酶甲基化修饰所保护，不能被自身的限制性内切酶所识别切割。
平末端blunt or flush end：有些限制性核酸内切酶能够在识别序列中间的同一个位置进行将DNA双链切断，产生的DNA末端为平末端。
产生的平末端DNA可以任意连接，但连接效率低。
黏性末端sticky end：大多数的限制性核酸内切酶在两条链错开2~4个核苷酸处切断，这样产生的DNA末端带有5‘突出或者3’突出的DNA单链，这样的末端称为黏性末端。
连接效率高，从3‘末端切割的产生的是3‘黏性末端，5’末端切割的产生的是5‘黏性末端。
位点偏爱site preference：有些限制性内切酶对同一底物的不同位点表现出偏爱切割的特性，即对不同位置的同一识别序列表现出不同的切割效率。
这种现象就叫做位点偏爱。
熟悉：酶切反应条件1、缓冲液：缓冲剂，Mg2+，DTT(二硫苏糖醇)，BSA（小牛血清白蛋白）分为三组低盐组（0~50mmol/L）、中盐组（50~100mmol/L）、高盐组（100~150mmol/L）2、限制性内切酶的反应温度一般为37℃（Taq为65℃，Apo I为50℃）3、反应时间：通常为一个小时或者更多，酶延长反应时间，可减少酶的用量4、终止酶切反应的方法：EDTA螯合镁离子（10mmol/L）、加热（65℃或80℃处理20min）、苯酚抽提去除蛋白和试剂盒纯化DNA（用于耐高温的）星号活性star activity：指在非最适的反应条件下，有些酶的识别特异性会降低，表现出松弛的专一性避免的星号活性方式：1、较少的甘油浓度2、保证反应体系内无有机溶剂3、减少酶的用量，防止过度酶切4、控制酶切反应的pH 5、适当提高缓冲液离子强度。
甲基化酶用于保护宿主的DNA不被相应的限制酶所切割。
DNA聚合酶的共同特点：都能够把脱氧核糖核苷酸连续地加入双链DNA分子引物链的3’-OH 末端；催化核苷酸的聚合作用，而不发生从引物模板链上解离的情况。
DNA聚合酶I有三种不同的酶催活性：① 5‘→3’的聚合酶活性。
②5‘→3’的核酸外切酶活性。
③ 3‘→5’的核酸外切酶活性。
熟悉：DNA聚合酶I可以被分割成两个片段①具有完全的5‘→3’的核酸外切酶活性。
②具有完全的5‘→3’的聚合酶活性和3‘→5’的核酸外切酶活性。
Klenow DNA 聚合酶：具有DNA聚合酶I的5‘→3’的聚合酶活性和3‘→5’的核酸外切酶活性。
用途：1、修补经限制性核酸内切酶产生的3‘隐蔽末端。
2、标记DNA片段的末端。
3、合成cDNA克隆中cDNA的第二条链。
4、DNA序列测定。
5、DNA定点突变。
T7DNA聚合酶的优点：1、持续合成能力强，一旦与模板链结合就会不间断的合成互补链2、3’→5‘外切酶活性强，单链和双链都能水解3、不受DNA二级结构的影响，其他合成酶受DNA二级结构的影响。
第三章基因组文库和cDNA文库的异同两者获取核酸的来源不同，基因组文库来源于染色体DNA，cDNA文库是从细胞中分离总RNA 和mRNA，然后以mRNA为模板反转录合成cDNA，与载体相连，转化宿主细胞而成。
两者建库的技术路线不同，产生的基因结构不同，应用也不同。
如果研究的目标是要弄清楚一种蛋白质的氨基酸序列，则可以根据克隆的cDNA分子的核苷酸序列直接推导。
如果要研究的是控制基因表达活动的调控序列，或者是在mRNA分子中不存在的某些特定序列，有关这类的信息就只能从染色体基因组DNA中获得。
在mRNA群体中有些mRNA的拷贝数很多，它们的量几乎占总mRNA的50%~90%，但种类却很少，被称为高丰度mRNA。
另外的一些mRNA拷贝数很少，低于总mRNA的0.5%，但种类却很多，称为低丰度mRNA。
第四章聚合酶链式反应PCR：是一种选择性体外扩增DNA或RNA片段的技术，又称为无细胞分子克隆或特异性DNA序列体外引物定向酶促扩增法。
它与分子克隆和DNA测序并称为分子生物学的三大主流技术，构成了分子生物学的主要实验基础。
PCR的基本原理：与细胞内DNA复制相似，以拟扩增的DNA分子为模板，一对与模板链分别互补的寡聚核苷酸片段为引物，在耐热DNA聚合酶的作用下，按照半保留复制的机制，沿着模板链上延伸合成新的DNA。
PCR的步骤：一、变性通过升温使目标DNA双螺旋的氢键断裂，形成作为反应模板链的单链DNA。
变性的温度由G+C的含量决定，含量越高，解离温度越高。
变性的时间由模板DNA的长度决定，长度越长，解离时间越长。
二、退火将反应体系冷却至特定温度，使引物与模板DNA的互补区结合，形成模板-引物复合物。
退火温度过高，则使引物和模板DNA不能很好地结合，扩增效率下降。
退火温度过低，则使引物非特异性的和模板DNA结合，形成非特异性DNA片段。
退火温度通过预实验来确定，一般比引物与模板的熔解温度Tm低3~5°三、延伸将反应体系的温度提高至热稳定DNA聚合酶的最适工作温度，并维持一段时间。
一般的Taq酶最适工作温度为72~78。
在耐热DNA聚合酶的作用下，引物为起点，以4种单核苷酸为底物合成新的DNA链PCR反应的五要素：Mg2+，引物，4种脱氧核糖核苷酸混合物，模板DNA，Taq DNA聚合酶PCR反应体系一般包括7个组分：二价阳离子，一价阳离子，缓冲液，一对寡核苷酸引物，热稳定DNA聚合酶，模板DNA，脱氧核苷三磷酸引物设计的一般原则：1、引物的长度一般在18bp~25bp，常用为20bp2、两个引物的Tm差异最好在2~5°，保证两个引物的正确退火。
3、引物的碱基：G+C的含量最好在40%~60%之间，含量过少则导致扩增效果不好，含量过多则导致非特异性条带的出现，ATGC最好随机排布，避免出现4个以上嘌呤或者是嘧啶连续排列。
4、避免引物内部或两个引物的核苷酸序列互补，从而减少引物二聚体的形成和引物二级结构的形成5、3’端最好是G或者C，不要GC连排6、引物的3’端必须与模板互补，5‘端可以不互补。
实时定量PCR的定义：在PCR反应体系中加入荧光基团，利用荧光信号累积实时监测整个PCR进程，最后通过标准曲线对模板中特定基因进行定量分析。
原理：正常状态下，该探针的5’端报告荧光基团的激发光被3‘端的猝灭基因所抑制而无法被检测到。
在PCR退火过程中，该探针与模板结合且结合位置在两个引物之间。
在延伸阶段，Taq酶沿着DNA模板移动到荧光基团的结合位置时发挥其5’→3‘核酸外切酶的活性将荧光探针切断，此时5’端的荧光基团被释放且产生可以被检测到的荧光信号。
临界点循环数Ct：在PCR管内荧光信号达到了设定的临界点时所需循环数。
起始拷贝数越多Ct越小。
第五章原核细胞表达系统的优点：成本低廉，生产量高，操作简单，蛋白表达量高。
缺点：缺乏适当的转录后和翻译后加工机制，所以只能表达克隆的cDNA，不宜表达基因组DNA，而从真核细胞来源的蛋白质在其中无法正确折叠和糖基化修饰，表达的蛋白质常常形成不溶性的包涵体，为后续纯化带来一定的困难。
理想的基因工程载体共同特征：1、本身是复制子，具有自主复制能力2、易于从宿主细胞内分离纯化3、有克隆位点，常具有多个酶切位点4、有选择性标记，利于重组体的筛选和鉴定5、分子量较小，易于操作和利于容纳较长的DNA片段6、具有较高的遗传稳定性严紧型质粒：其复制与宿主细胞染色体的复制偶联，且每个细胞中只有1到十几个拷贝数松弛型质粒：其复制与宿主细胞染色体复制不偶联，每个细胞中有几十个到几百个拷贝数，更重要的是其拷贝数在宿主细胞蛋白质合成和染色体复制停止时仍能继续扩增。
噬菌体载体的优点1、能携带外源DNA片段长度较大，且感染能力大于质粒转化细菌的能力2、可以克隆较大的外源基因黏粒载体（柯斯质粒）特点：1、具有langda噬菌体的某些特性：能携带合适的外源DNA，在体外被包装成噬菌体颗粒之后，能高效转导对langda噬菌体敏感的的大肠埃希菌。
2、具有质粒的某些特性：具有质粒复制子，在宿主细胞内能像质粒一样复制，并且在氯霉素的作用下，获得进一步的扩增。
3、具有高容量的克隆能力。
4、具有与同源序列的质粒进行重组的能力。
宿主细胞的条件：1、易于重组子的导入2、限制酶和重组酶的缺陷3、遗传稳定性好4、安全性高5、功能互补6、具有较好的翻译后加工机制7、蛋白水解酶基因缺陷或表达水平低重组体导入宿主细胞的方式1、转化transformation：将质粒或者是重组质粒DNA导入大肠埃希菌细胞内，并使其获得新的表型的过程。
2、感染infection（转导transduction）：以噬菌体、柯斯质粒和病毒为载体的重组DNA分子，在体外被包装成具有感染能力的病毒或者是噬菌体颗粒，感染适当的细胞，并在细胞内扩增的过程。
3、转染transfection：指将重组表达载体导入真核细胞的过程。
外源蛋白：包涵体，融合蛋白，整合型外源蛋白，寡聚型外源蛋白，分泌型外源蛋白第六章真核表达组件：复制子，启动子和增强子，加poly a信号，剪接信号，选择性标记基因哺乳动物基因表达载体的类型质粒型表达载体SV40病毒载体特点：1、可以在各种哺乳动物转染细胞中获得低水平到中等水平的表达，但转染COS细胞可获得高水平表达。
