下载文档原格式
·临床研究·肝癌、肝硬化和乙肝患者血清里BLM自身抗体表达量的研究鲍林春，王兴林，贺敏，吴健，张传跃，张望明（黔西南布依族苗族自治州人民医院 检验科，贵州 黔西南562400）摘要：目的研究肝癌、肝硬化和乙肝患者血清里BLM自身抗体表达量情况。
方法采用ECL化学发光法鉴定BLM蛋白的纯度，采用间接ELISA法对20例恶性肿瘤患者54例肝硬化患者、70例乙肝患者和40例健康体检者外周血血清中抗BLM解旋酶自身抗体进行检测，对OD值进行比较分析。
结果 BLM蛋白纯度高，可作为抗原包被ELISA96孔板。
应用间接ELISA法测OD值比较发现：肝癌患者和肝硬化患者血清抗BLM解旋酶自身抗体量明显低于正常对照组（P<0.001）。
结论检测乙肝患者BLM自身抗体表达量对于肝病慢性化的进展，将成为一项新的临床预测指标。
关键词：BLM自身抗体；肝癌；肝硬化和乙肝中图分类号：R657.3+1 文献标识码：A DOI：10.3969/j.issn.1671-3141.2016.104.0900 引言在DNA解旋酶中RecQ解旋酶家族占据着一个非常重要的角色，这个家族在整个生物进化过程中都一直延续着相当高的保守性，并且在维持各种生物体的遗传基因稳定性方面和细胞的正常代谢过程等方面都显得格外重要[1]。
BLM基因突变使姐妹染色单体互换率（sister chrom a tic exchange，SCE）增高，细胞DNA修复功能降低，这样受损的DNA很容易随细胞分裂而传入子细胞，细胞稳定性下降；临床表现为免疫缺陷，恶性肿瘤易患体质等等。
本研究对乙肝、肝硬化及其肝癌患者血清中的BLM解旋酶自身抗体表达量差异进行研究，内容如下：1 资料和方法1.1 资料。
研究对象：1.1.1 慢性迁延性肝炎乙型（CPH）70例，男 45例，女25例，年龄20~60岁。
慢性活动性肝炎乙型（CAH）30例，均为男性，年龄 l9~62岁。
人类RecQ解旋酶在DNA损伤修复通路中的作用肖芸;张爱华【摘要】人类RecQ解旋酶是一种多功能DNA解旋酶,在DNA损伤修复及维护基因组稳定性中起着重要作用.本文综合介绍了RecQ解旋酶的结构与生物学特性及其在多条DNA损伤修复通路中的作用,以及RecQ解旋酶在疾病治疗中的应用前景和人类RcCQ解旋酶缺陷与肿瘤、遗传性疾病、环境相关疾病的关系.【期刊名称】《癌变·畸变·突变》【年(卷),期】2010(022)002【总页数】4页(P157-160)【关键词】RecQ解旋酶;DNA损伤修复;疾病【作者】肖芸;张爱华【作者单位】贵阳医学院毒理学教研室,贵州贵阳550004;贵阳医学院毒理学教研室,贵州贵阳550004【正文语种】中文【中图分类】Q783;Q71;R3人类RecQ解旋酶是一种多功能的DNA解旋酶，能利用水解三磷酸核苷(NTPs)产生的能量分离双核苷酸链，在DNA代谢的多个方面发挥重要作用。
RecQ解旋酶广泛存在于原核、真核生物和病毒体内，在人体细胞内至少有5种RecQ解旋酶，包括RECQ1、BLM(RECQ2)、WRN(RECQ3)、RECQ4和RECQ5，其中BLM、WRN和RecQ4基因突变可分别导致Bloom综合征(Bloom syndrome，BS)、Werner综合征(Wernersyndrome，WS)和Rothmund-Thomson综合征(Rothmund-Thomsonsyndrome，RTS)，这些遗传性疾病的共同特征为基因组不稳定性增加，并有易患肿瘤倾向［1-2］。
DNA损伤修复机制是机体重要的防御机制，能及时修复环境中有害物质对机体造成的损害，避免损伤累积引起基因组不稳定性增加。
本文综合介绍了RecQ解旋酶的结构与生物学特性及其在多条DNA损伤修复通路中的作用，以及RecQ解旋酶在疾病治疗中的应用前景和人类RecQ解旋酶缺陷与肿瘤、遗传性疾病、环境相关疾病的关系。
• 60 •国际遗传学杂志2021年2月15日第44卷第1期丨ntj Genet Feh.15 ,2021，Vol.44, No. 1• •SUMO化修饰对维持基因组稳定性的作用王雨思u张祎u2计薇u2吴杰〃1哈尔滨医科大学医学遗传学研究室150081; 2中国遗传资源保护与疾病防控教育部重点实验室（哈尔滨医科大学）150081通信作者：吴杰，Email:wujie@【摘要】基因组的稳定性是细胞正常生长、发育等过程的必须条件。
当D N A复制过程中出现损伤，进行及时的应答与修复对于维持基因组稳定性至关重要。
在DNA损伤应答的过程中，翻译后修饰对于蛋白的调控与维持基因组稳定性及完整性具有重要意义。
本文将对在DNA损伤修复应答过程中SUMO化修饰的研究进展进行阐述。
【关键词】SUMO化修饰；DNA损伤修复基金项目：国家自然科学基金（81301751 );黑龙江省博士后科研启动资助（LBH-Q16163);哈尔滨医科大学伍连德科学青年基金（WLD-QN201701 )DOI：10.3760/231536-20200820-00073The role of SUMO modification in maintaining genomic stabilityWang Yusiu, Zhang Ti1'2, Ji Wei12, Wu Jieu1L aboratory o f M edical Genetics, Harbin Medical University, Harbin 150081, China, 2K ey Laboratory o f P reservation o f H uman Genetic Resources and Disease control in China (Harbin Medical University), Ministry o fEducation, Harbin 150081, China.Corresponding author: WuJie, Email: ***************[Abstract ] Genomic stability plays an essential role in the process of growth and development.When damage occurs during DNA replication, prompt response and repair are critical to maintain the stability of genome. Studies have shown that post-translational modification plays an important role in regulatingproteins and maintaining genomic stability and integrity during DNA damage response. In the present paper, the research progress of sumoylation in response to DNA damage repair is reviewed.【Key words 】Sumoylation; DNA damage repairFund program：National Natural Science Foundation of China (81301751); Postdoctoral Scientific Research Development Fund of Heilongjiang Province (LBH-Q 16163); Wu Lien-Teh Youth Science Foundation of Harbin Medical University (WLD-QN 201701).DOI :10.3760/231536-20200820-00073在DNA复制过程中，对遗传物质的精准控制 是维持基因组稳定性的必要条件。
综述原发性卵巢功能不全遗传学病因的研究进展摘要：原发性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI）的高度遗传异质性使遗传病因研究正面临巨大挑战。
已知的特发性卵巢功能不全散发病例中基因变异发生率可达约25%～30%。
目前广泛认为POI是一种由多基因决定的遗传倾向性疾病，不同人群间及不同种族间存在显著差异。
近年来，基因组测序技术被广泛用于散发病例的家系研究，成功发现了包括HFM1，SYCE1，STAG3，MCM8，MCM9，CLPP，HSD17B4，SOHLH1，eIF4ENIF1，RCTBT1，RCBTB1，SGO2，PSMC3IP和NUP107等诸多POI致病基因，巧合的是，其中大多都是参与减数分裂或DNA 损伤修复的重要调控因子。
卵巢功能不全涉及的候选基因之多，致病基因突变率之低，综合征型POI表型之复杂，都使找到真正的POI 致病基因难度增加。
POI的病因研究具有极大的发展前景，其诊疗也将因此得到革命性的革新。
本文综述了近年来通过不同研究方式得到的POI遗传学相关基因，为临床诊断和患者的临床个性化诊治提供理论基础。
关键词: 原发性卵巢功能不全，卵巢早衰，基因突变，遗传致病因素原发性卵巢不全的定义与发展原发性卵巢功能不全（primary ovarian insufficiency，POI）最早由Fuller Albright提出以区分继发性卵巢功能不全[1]。
2008年美国生殖医学学会（ASRM）正式使用该术语取代卵巢早衰（premature ovarian failure，POF）[2, 3]，并以FSH 水平、生育能力和月经情况将疾病进程分为“隐匿性原发性卵巢功能不全”（occult POI）和“临床性原发性卵巢功能不全”（overt POI）[4]。
隐匿性POI主要以不孕为主诉，前期表现出正常月经及生化水平，仅有生育力下降，临床检查双侧卵巢总窦卵泡数<6个，抗苗勒管激素（AMH）水平低于0.5~1.1ng/ml(1ng/ml=7.14pmol/l)[2]，通常在1～6年后发展为临床性POI，低AMH反映卵巢储备低下，也预示着生育力保存治疗成功率可能较低。
RecQ解旋酶分子特性的研究【摘要】：Waston和Crick提出DNA双螺旋结构后,不仅引导人们发现了DNA聚合酶,它作用于DNA以一条链为模板聚合形成一条新的DNA链;而且也让科学家们寻找到一种酶能够在DNA复制时破坏互补碱基对的氢键结构而打开DNA双螺旋结构。
随后,相似功能的酶在RNA复制中也被发现。
这类酶被科学家称为解旋酶。
解旋酶是一类能解开核苷酸双链的酶,它广泛存在于从病毒到人类等多种生物体中。
自1976年人类在大肠杆菌(EsherichiaColiE.coli)中发现了第一个解旋酶,至今已有上百种解旋酶被发现,而且这一酶家族成员还在不断扩大。
解旋酶广泛存在于多种生物体中,有些生物还同时具有多种不同类型的解旋酶。
尽管解旋酶种类繁多,人们在研究过程中发现,这类蛋白酶在其氨基酸序列上有一定的同源性和相似性。
分析表明,这些同源序列在进化过程中构成了几个高度保守的区域,这些区域执行不同的酶功能。
人们根据酶的二维结构和一级序列,把解旋酶分为几大家族来分类研究。
经过多年的研究,人们发现解旋酶具有多种功能,在细胞内它们参与DNA复制、修复、转录重组以及RNA接拼、核糖体组装、蛋白质翻译,端粒稳定。
最近,还发现个别解旋酶甚至参与机体天然免疫反应机制。
解旋酶已不仅仅只是分开核酸双链结构的一类酶,它的生物功能远不止此。
解旋酶第二大家族中的RecQ解旋酶亚家族在核酸代谢过程中起了关键的作用,这一家族参与DNA复制、DNA 修复、重组、转录甚至端粒稳定机制。
人们发现在人体中存在RECQ1、BLM、WRN、RECQ4和RECQ5这五种RecQ解旋酶家族成员。
其中,BLM、WRN、RECQ4编码基因缺陷会导致人类相应的疾病发生,它们分别为Bloom综合症(BS)、Werner综合症(WS)、Rothmund-Thomson综合症(RTS)、RAPADILINO综合症和Baller-Gerold综合症。
这些疾病虽然在人类中都是极其罕见的隐形遗传疾病,但是在分子水平都表现为基因组高度不稳定性、染色体异常(染色体断裂、缺失、重排、姐妹染色体交换等)和对DNA损伤因子敏感性增加。
recqdna解旋酶结构与功能及其相互关系的研究【序号1】recqdna解旋酶结构与功能及其相互关系的研究在现代生命科学领域，DNA修复和重组是一个备受关注的研究方向。
recqdna解旋酶是这一领域中的重要分子，它在DNA修复和重组过程中发挥着关键的作用。
为了更好地理解recqdna解旋酶的结构、功能和其与其他分子的相互关系，科学家们进行了广泛而深入的研究。
本文将从简单到复杂、由表及里地介绍recqdna解旋酶，并探讨其结构和功能以及与其他分子的相互作用。
【序号2】recqdna解旋酶是一种拥有重要生物学功能的酶。
在DNA 修复和重组过程中，它起到了解旋双链DNA的关键作用。
研究表明，recqdna解旋酶在细胞中具有多种功能，包括DNA损伤修复、染色体稳定性维持和基因组稳定性的维护等。
这些功能使得recqdna解旋酶在生物体内发挥着重要的生物学作用。
【序号3】关于recqdna解旋酶的结构研究，科学家们发现，其结构由多个功能模块组成。
其中包括一个N末端单链结合模块、一个内旋酶模块和一个ATP酶活化模块。
这些模块相互作用并协同工作，形成了recqdna解旋酶的完整结构。
通过解析recqdna解旋酶的结构，我们可以更好地理解其功能和与其他分子的相互关系。
【序号4】recqdna解旋酶在DNA修复和重组过程中的功能主要有两个方面：一是识别和结合双链DNA上的损伤位点，二是通过解旋酶活性将损伤的DNA链进行解卷。
识别和结合损伤位点的过程中，recqdna解旋酶通过其N末端单链结合模块与DNA发生相互作用，从而将其定位于损伤位点。
而解旋酶活性则是通过其内旋酶模块和ATP酶活化模块的协同作用实现的。
这两个功能的发挥使得recqdna解旋酶能够高效地修复和重组DNA。
【序号5】recqdna解旋酶还与其他分子之间存在相互作用和相互调节的关系。
研究表明，recqdna解旋酶可以通过与其他DNA结合蛋白、核酸修复酶和修饰酶等发生相互作用来调节其功能。
抗recq解旋酶单克隆抗体的制备、鉴定及应用-概述说明以及解释1.引言概述部分的内容可以描述抗recq解旋酶单克隆抗体的研究背景和重要性。
以下是一个示例：1.1 概述在细胞内，DNA解旋酶(recQ解旋酶)在DNA复制、修复和重组过程中起着至关重要的作用。
recQ解旋酶家族在多种生物中广泛存在，其中包括人类、酵母菌和大肠杆菌等。
由于其在维持基因组稳定性和DNA修复中的重要作用，recQ解旋酶成为了生物医学研究的热点。
本文针对recQ解旋酶的研究，重点关注了抗体的制备、鉴定及应用。
抗体是一种具有高度特异性和亲和力的蛋白质，可用于检测目标分子的存在、定位和功能研究。
单克隆抗体是一种由单一克隆细胞产生的抗体，具有更高的特异性和亲和力，被广泛应用于生命科学研究和临床诊断。
本文将详细介绍抗recQ解旋酶单克隆抗体的制备、鉴定及应用过程。
在制备部分，我们将介绍所使用的材料和方法，并阐述如何选择和制备抗原以获得高效的免疫效果。
鉴定部分将介绍常用的鉴定方法，如免疫组化和免疫印迹等，以及抗体的特异性和亲和力检测方法。
应用部分将探讨抗recQ解旋酶单克隆抗体在生物学功能研究、医学诊断和治疗以及蛋白质相互作用研究中的重要应用。
本研究对于揭示recQ解旋酶的生物学功能以及其在疾病诊断和治疗中的应用具有重要意义。
同时，该研究为进一步深入理解recQ解旋酶的机制和开发相关治疗策略提供了基础。
对于未来的研究，我们希望通过不断优化和改进抗recQ解旋酶单克隆抗体的制备和应用技术，进一步拓展其在疾病研究和治疗中的潜力。
1.2 文章结构本文按照以下结构进行组织和展开：第2节正文部分分为三个小节，分别是抗recq解旋酶单克隆抗体的制备、抗recq解旋酶单克隆抗体的鉴定以及抗recq解旋酶单克隆抗体的应用。
在制备部分中，我们详细描述了所使用的材料和方法，包括抗原的选择和制备以及单克隆抗体的制备过程。
在鉴定部分，我们介绍了相关的鉴定方法，并详细讨论了抗体的特异性和亲和力检测以及稳定性和纯度检测。
两个密切相关的RecQ解旋酶在拟南芥的同源重组和DNA修复中起接抗性的作用作者来自于德国卡尔斯鲁厄大学RecQ解旋酶家族在DNA复制、重组、修复等方面均发挥着重要作用。
人类编码WRN （Werner Syndrome Protein）、BLM（Bloom Syndrome Protein）RecQ基因发生突变可分别导致Werner综合征、Bloom综合征。
RecQ功能的缺失常常伴随着由交换抑制子的缺失造成的超重组。
在拟南芥基因组中已发现有7个不同的RecQ基因。
AtREC4A和4B就是其中的两个。
敲出这些基因会导致拮抗性的表型。
在Mus81突变的情况下，REC4A 突变体表现出对DNA损伤事件较敏感，增强同源重组（HR）和致死性。
而且，RECQ4A的突变会部分抑制由AtTOP3a突变所造成的致死表型，这个现象先前已经在单细胞真核生物的RecQ同源物中被证明。
总之，这些事实强烈的说明在植物中，RECQ4A在功能上与酿酒酵母的SGS1以及哺乳动物的BLM是等效的。
恰恰相反，与4A密切相关的RECQ4B的突变体却表现对诱变不敏感，在mus81突变的情况下不能生长发育，而且不能抑制由TOP3a 缺失导致的致死性。
因此，与其他所有已知真核生物的RecQ同源物不同，AtRECQ4B被特别地认为是用来促进交换而不是抑制交换。
关键词： BLM Cross suppression HJ编码RecQ的解螺旋酶基因存在于目前所研究过的所有的原核生物与真核生物中。
已完成测序的基因组序列数据说明，RecQ基因数目从低复杂性生物到那些高等复杂生物是逐渐增加的。
在E.coli和酿酒酵母中，存在单个RECQ基因，而在哺乳动物或植物中却发现存在5到8个。
因此，在高等真核生物中RECQ解旋酶的功能似乎已通过增加其数目的方式来适应它们基因组的复杂性。
在大多数情况下，RECQ基因的敲出在不同的生物比如细菌、酵母、哺乳动物、植物中都会导致超重组这一表型。
RECQ1解旋酶在人脑胶质瘤中的表达及意义的开题报告标题：RECQ1解旋酶在人脑胶质瘤中的表达及意义摘要：胶质瘤是一种常见的中枢神经系统肿瘤，其发病机制仍然不清楚。
RECQ1解旋酶是一种DNA helicase，参与DNA修复和转录调控。
在胶质瘤中，RECQ1解旋酶的表达水平与肿瘤的恶性程度有关。
本文旨在探讨RECQ1解旋酶在人脑胶质瘤中的表达及其意义。
关键词：RECQ1解旋酶；脑胶质瘤；表达水平；意义一、研究背景和意义胶质瘤是一种罕见的肿瘤，其发病机制仍然不清楚。
过去的研究表明，细胞周期调节、DNA修复和转录调控等多种机制参与了胶质瘤的发生和发展。
RECQ1解旋酶是一种DNA helicase，与DNA双链断裂修复和DNA转录调控密切相关。
近年来，研究表明，RECQ1解旋酶的表达水平与多种肿瘤的恶性程度有关，但其在胶质瘤中的作用仍然不清楚。
因此，探究RECQ1解旋酶在胶质瘤中的表达水平及其意义，对于胶质瘤的诊断和治疗具有重要的意义。
二、研究方法1. 实验对象收集符合诊断标准的人脑胶质瘤患者样本。
2. 实验设计采用免疫组织化学（IHC）检测RECQ1解旋酶在人脑胶质瘤中的表达水平，并分析其与肿瘤病理学特征的关系。
3. 数据分析通过统计学方法，分析RECQ1解旋酶在人脑胶质瘤中的表达水平与肿瘤分级、复发和预后的关系。
三、预期结果通过实验结果，预计可以确定RECQ1解旋酶在人脑胶质瘤中的表达水平，并进一步探究其与肿瘤病理学特征的关系。
结果将为今后的胶质瘤诊断和治疗提供有力的理论依据。
四、结论RECQ1解旋酶参与了多种DNA修复和转录调控的生物学过程，其表达水平与多种肿瘤的恶性程度有关。
在胶质瘤中，RECQ1解旋酶的表达水平与肿瘤的分级、复发和预后有关。
因此，RECQ1解旋酶在胶质瘤的诊断和治疗中具有重要的意义。
2024年人教B版选择性必修3生物下册月考试卷49考试试卷考试范围：全部知识点；考试时间：120分钟学校：______ 姓名：______ 班级：______ 考号：______总分栏题号一二三四五六总分得分评卷人得分一、选择题(共6题，共12分)1、《书经》中的“若作酒醴，尔惟曲蘖”提到酿酒必须要用酒曲。
酒曲是以谷物为原料，破碎加水压制而成。
富含酵母菌等多种微生物，经水浸泡后投人蒸熟的米即可用于酿酒。
下列相关说法不正确的是（）A. 酒曲中含有微生物分泌的多种酶B. 浸泡酒曲的过程中微生物代谢加快C. 酒曲中的酵母菌通过无氧呼吸将谷物中的糖转化为酒精D. 夏季气温升高，需使用煮沸的水浸泡酒曲以防杂菌污染2、将马铃薯胰蛋白酶抑制剂基因Pin-Ⅱ导入杨树细胞，培育成了抗虫杨树。
下图表示含目的基因的DNA分子和农杆菌质粒，图中Ap r表示氨苄青霉素抗性基因，Ne r表示新霉素抗性基因；箭头表示识别序列完全不同的4种限制酶的酶切位点。
下列叙述不正确的是（）A. 目的基因插入到质粒的T-DNA上，才能整合到受体细胞染色体中B. 为使目的基因与质粒高效重组，最好选用EcoRI和PstIC. 成功导入重组质粒的细胞会表现为不抗氨苄青霉素、抗新霉素D. 可用DNA分子杂交或抗原-抗体杂交技术检测目的基因是否表达3、下面是哺乳动物受精过程示意图；数字表示过程，字母表示结构。
下列有关叙述正确的是（）A. a结构的名称是透明带B. 受精之前，精子需在睾丸的曲细精管中获能C. 精子发生顶体反应释放的顶体酶，由高尔基体合成D. c、d分别为雄原核和雌原核4、下列有关干细胞的叙述，错误的是（）A. 干细胞是具有分裂和分化能力的细胞B. 造血干细胞可定向诱导分化成机体所有种类的细胞C. 胚胎干细胞在饲养层细胞上培养能够维持不分化的状态D. 移植胚胎干细胞可使退化的组织得以修复并恢复正常功能5、某二倍体药用植物甲（染色体组成为MM）含有有效成分A；二倍体药用植物乙（染色体组成为NN）含有有效成分B。
RecQ解旋酶分子特性的研究【摘要】：Waston和Crick提出DNA双螺旋结构后,不仅引导人们发现了DNA聚合酶,它作用于DNA以一条链为模板聚合形成一条新的DNA链;而且也让科学家们寻找到一种酶能够在DNA复制时破坏互补碱基对的氢键结构而打开DNA双螺旋结构。
随后,相似功能的酶在RNA复制中也被发现。
这类酶被科学家称为解旋酶。
解旋酶是一类能解开核苷酸双链的酶,它广泛存在于从病毒到人类等多种生物体中。
自1976年人类在大肠杆菌(EsherichiaColiE.coli)中发现了第一个解旋酶,至今已有上百种解旋酶被发现,而且这一酶家族成员还在不断扩大。
解旋酶广泛存在于多种生物体中,有些生物还同时具有多种不同类型的解旋酶。
尽管解旋酶种类繁多,人们在研究过程中发现,这类蛋白酶在其氨基酸序列上有一定的同源性和相似性。
分析表明,这些同源序列在进化过程中构成了几个高度保守的区域,这些区域执行不同的酶功能。
人们根据酶的二维结构和一级序列,把解旋酶分为几大家族来分类研究。
经过多年的研究,人们发现解旋酶具有多种功能,在细胞内它们参与DNA复制、修复、转录重组以及RNA接拼、核糖体组装、蛋白质翻译,端粒稳定。
最近,还发现个别解旋酶甚至参与机体天然免疫反应机制。
解旋酶已不仅仅只是分开核酸双链结构的一类酶,它的生物功能远不止此。
解旋酶第二大家族中的RecQ解旋酶亚家族在核酸代谢过程中起了关键的作用,这一家族参与DNA复制、DNA 修复、重组、转录甚至端粒稳定机制。
人们发现在人体中存在RECQ1、BLM、WRN、RECQ4和RECQ5这五种RecQ解旋酶家族成员。
其中,BLM、WRN、RECQ4编码基因缺陷会导致人类相应的疾病发生,它们分别为Bloom综合症(BS)、Werner综合症(WS)、Rothmund-Thomson综合症(RTS)、RAPADILINO综合症和Baller-Gerold综合症。
这些疾病虽然在人类中都是极其罕见的隐形遗传疾病,但是在分子水平都表现为基因组高度不稳定性、染色体异常(染色体断裂、缺失、重排、姐妹染色体交换等)和对DNA损伤因子敏感性增加。
在临床上表现为过早衰老、Ⅱ型糖尿病、骨质疏松、动脉硬化和极度容易发生癌症。
大部分病人都是最终发生不同癌症而死亡。
这一临床共同现象引起了人们的关注和研究热潮。
对解旋酶的结构功能、作用机制的研究不仅可以认清核酸代谢过程,还能帮助我们揭示癌症发病的某些相关机理。
同时了解病毒解旋酶的结构与功能,为抗病毒药物的研制提供了新的靶点和思路。
解旋酶具有四大基本生物化学活性:NTP水解活性、DNA或RNA结合活性、核酸链解链活性和核酸链退火配对活性。
在二价金属离子(比如Mg~(2+))和NTP的存在下,解旋酶便表现出水解NTP的性质,大部分酶水解ATP和dATP,一些酶则能水解其他的核苷酸,比如TIP和GTP。
当解旋酶与DNA或RNA结合后,利用水解核苷酸产生的能量,推动酶在核酸链上的移动,从而解开互补的两条核酸链。
随着研究的深入,人们发现有些解旋酶在核酸修复过程中能促使核酸链配对重组。
这使得我们意识到解旋酶在基因稳定过程中的作用越来越重要。
但是并不是所有的解旋酶成员都表现出这四种基本生化功能,这与酶自身的结构有密切的关系,酶的结构决定了它所能表现的作用机制和生化活性。
长期以来,科学家们一直研究探索解旋酶的结构与其功能间的相互关系,力求发现解旋酶本质的运作机制。
RecQ解旋酶家族尽管蛋白种类繁多,在氨基酸序列上同源性不高,但有限的同源序列构成了数个典型的功能区域:从N端向C端方向,分别为位于氨基酸序列中间段的解旋酶核心区域,RecQC 端区域(RecQ-Ct)和解旋酶RNaseD保守区域(HRDC),这些区域具有不同的功能,并相互协调共同执行解旋酶的运作机制。
解旋酶核心区域是解旋酶标志性结构,它由一段高度保守的氨基酸序列组成,含有7个保守区域,负责结合NTP、NTP水解和DNA结合。
RecQ-Ct区域是RecQ解旋酶家族唯一含有的结构特征,但不是所有RecQ成员都含有这一结构域。
RecQ-Ct区域包含两个重要的亚结构域:由四个α螺旋和四个保守的半胱氨酸残基组成的结构平台,因能特异结合锌离子而被命名为锌结合区域或锌指结构(zinc-bindingmotif,zincfinger,ZBM);序列上不太保守的翼型螺旋亚结构域(winged-helix,WH)。
目前发现RecQ-Ct结构域主要负责酶与核酸的结合、酶自身的折叠作用。
HRDC 区域位于解旋酶氨基酸序列的C端,在部分RecQ成员中缺失,对这一结构域的认识甚浅,一些研究表明HRDC区域能够增强解旋酶对NTP 水解和解链活性。
虽然解旋酶不同的结构域负责不同的酶功能,但解旋酶核心区域、RecQ-Ct和HRDC区域并不是各自独立的,它们互相之间相互作用相互协调,共同完成酶的生理作用机制。
本文就以RecQ 解旋酶家族中BLM、RECQ5和枯草杆菌RecQ(BacillussubtilisRecQ)为实验对象,来研究解旋酶不同结构域之间是如何相互影响、相互牵制。
从而了解解旋酶结构与其功能相互间的关系,揭示解旋酶的作用机制。
首先我们把焦点放在RecQ解旋酶的RecQ-Ct区域,想了解这一区域是如何与解旋酶核心区域相互作用,相互之间存在何种联系,来共同维持解旋酶整体的酶活性平衡。
我们以RECQ5为研究模型,RECQ5是人体5种解旋酶之一,虽然至今未发现它与任何人类疾病有关,但是有实验证明RECQ5与BLM蛋白密切相关,能协助BLM蛋白维持染色体的平衡。
而且RECQ5解旋酶天然存在三种异构体:RECQ5α、REQ5β和RECQ5γ。
其中REQ5β最大,含有解旋酶核心区域和RecQ-Ct 区域,相对的RECQ5α最小,只含有解旋酶核心区域结构。
这两种异构体成为研究RecQ-Ct结构域功能,和解旋酶核心结构域相互关系最理想的天然模型。
实验结果揭示,RECQ5α既没有ATP水解能力,也不表现解链活性,却展示出对互补核酸链的退火配对作用。
REQ5β则表现出较弱的退火配对能力和较强的解链活性。
一系列实验证明,其中RecQ-Ct区域的保守结构—锌结合区域起到了重要作用,不仅增加酶对DNA的结合能力,而且起到了分子开关的作用,能够通过对DNA结合的增强来抑制解旋酶核心区域的退火配对活性,同时改变蛋白构型启动解链过程。
我们率先提出RecQ-Ct区域锌指结构与解旋酶核心区域相互作用的机制模型,初步揭示两者之间的相互联系,了解RecQ解旋酶结构与结构之间,结构与功能间的相互关系。
在对RecQ解旋酶核心区域与RecQ-Ct区域认识的基础上,进一步研究位于氨基酸序列最C端的HRDC区域的功能,探究HRDC与解旋酶核心区域、RecQ-Ct 区域的相互关系。
本文利用RecQ解旋酶家族中枯草杆菌RecQ(BacillussubtilisRecQ,SubRecQ)亚家族为研究模型,它由两个成员组成。
这两种RecQ解旋酶的典型结构差异在于一个含有HRDC区域,而另一个则HRDC区域缺失。
为研究提供了理想的天然结构模型。
结果表明,具有HRDC区域的SubRecQ酶,表现出解旋酶基本的生化活性,并能有效地解开一些DNA复制与修复中DNA错误结构甚至是Holliday结构。
相对地,SubRecQ如果缺失HRDC区域,虽能具有较弱ATP水解活性,解链活性,但无法解开某些复杂的DNA复制与修复中间体结构,同时也不具有解开Holliday结构的能力。
两种解旋酶的DNA结合活性与DNA退火配对活性无明显差异。
分析认为,HRDC 结构能辅助增强解旋酶的ATP水解活性与解链活性,在解开复杂的DNA结构过程中起到了关键的作用。
RecQ解旋酶家族中的BLM蛋白是迄今在人体中发现的5种解旋酶之一,BLM编码基因的缺陷会导致疾病Bloom综合症的发生。
而且BLM蛋白具有RecQ解旋酶家族典型的结构特征,因此它成为理想的研究模型。
本实验室致力于BLM 蛋白生化活性的研究已有多年,发现完整的BLM蛋白能表现出解旋酶全部的基本生物功能,也了解了其各个结构区域负责哪些酶功能。
在研究其结构与功能的相互关系的过程中我们发现,BLM蛋白的解旋酶核心区域含有高度保守的精氨酸残基靠近于与其结合的ATPγ磷酸位置,称为精氨酸指结构。
我们推测这一结构负责ATP的结合与水解活性。
蛋白结构分析表明,BLM蛋白解旋酶核心区域还有两个保守的精氨酸残基—R979与R982。
突变这两个残基位点后,发现BLM对ATP 的水解能力明显下降,同时丧失解链能力,但对ATP结合与DNA结合能力并无影响。
R982突变体的ATP水解和解链活性减弱幅度比R979突变体更为明显。
运用目前公认的精氨酸指检测试剂—原钒酸盐(Vi)探测BLM蛋白的精氨酸指结构,Vi能与镁离子、ADP和酶形成复合物,从而抑制酶对核苷酸5’端三磷酸催化活性,试验结果表明Vi能非竞争性抑制R982精氨酸残基对ATP的水解作用,对R979精氨酸无抑制作用,从而确定BLM蛋白R982氨基酸残基形成了精氨酸指结构。
我们还发现R982精氨酸指能与其周围其他一些解旋酶核心区域的重要残基相互作用,促进对ATP的招募和水解。
在此我们也从一个新的角度揭示解旋酶是如何与ATP和核酸结合启动ATP的水解,随后引起蛋白构型变化并将水解产生的化学能源用于解链过程的作用机制。
解旋酶的结构是其生化活性的前提,不同保守功能区域分别具有不同的功能,彼此之间相互作用,互相协调,来完成酶的整个运作机制。
除了解旋酶核心区域外,RecQ-Ct与HRDC区域也是解旋酶重要的结构,结构的缺失与突变会不同程度影响酶的功能,增加或者减弱某些酶活性。
解旋酶结构特征的完整保证了其在细胞中维持核酸代谢稳定的重要地位。
【关键词】：【学位授予单位】：华东师范大学【学位级别】：博士【学位授予年份】：2010【分类号】：Q55【目录】：SUMMARYINCHINESE(中文摘要)12-16SUMMARYINFRENCH(RESUME)16-18SUMMARY18-20A BREVIATIONS20-23CHAPTER1GENERALINTRODUCTION23-951. DIFFERENTHELICASEFAMILIES25-32SUPERFAMILY126SUPERF AMILY226-27SUPERFAMILY327-29SUPERFAMILY429-31OTHERS UPERFAMILIES31-322.HELICASE-GENERALPROPERTIESOFHELI CASESANDMODEOFACTION32-392.1BIOCHEMICALPROPERTIES OFHELICASES32-372.1.1NTPbindingandhydrolysisofNTP322.1.2Nucl eicAcidsbinding32-332.1.3UnwindingActivityandModeofAction33-362.1 .4AnnealingActivity36-372.2THEMULTIPLEFUNCTIONSOFHELICA SES37-39HelicaseandDNAreplication37-38HelicaseandDNArepair38Hel icaseandRNAmetabolism38-393.THERECQFAMILYOFDNAHELICAS ES39-753.1GENERALFEATURESANDSTRUCTURALORGANISATI ON39-443.2THEESCHERICHIACOLIRECQ44-483.2.1GeneticBackgro und443.2.2BiochemicalandstructuralPropertiesofE.coliRecQ44-453.2.3R oleingenomicstability45-483.2.4RecQhelicasesfromothermicroorganisms 483.3YEASTRECQFAMILYHELICASES48-523.3.1Saccharomycescere visiaeSgs148-513.3.1.1Sgs1CellularPhenotype48-493.3.1.2BiochemicalP ropertiesofSgs1493.3.1.3InteractionPartnersandModelsforgenomeinstabili ty49-513.3.2SchizosaccharomycespombeRqh151-523.3.2.1Biochemicalp roperites513.3.2.2Functionintelomeremetabolism51-523.4RECQHELICA SESINHUMAN52-753.4.1HumanRECQ152-56HumanRECQ1andgienomestability52-55Biochemicalproperties55StructureofhumanRECQ155-56 3.4.2BLM-TheBloomSyndromeHelicase56-62Bloom’sSyndrome(BS)56-58BSCiellularPhenotype58BLMproteinanditsinteractionpartners58-623.4. 3WRN-TheWernerSyndromeHelicase62-67TheWiernerSyndrome62-63 WSCellularPhenotype63-65WRNproteinanditsinteractionpartners65-673.4.4RECQ4/RTS-TheRothmund-ThomsonSyndromeProtein67-71TheRoth maund-ThomsonSyndrome(RTS)67-68RTSCellularPhenotype68-69REC Q4protein69-713.4.5RECQ571-75DiscoveryofRECQ571-72Biochemical propertiesofRECQ572-75RECQ5andSCEs754.PROPOSE75-784.1THEE NZYMATICREGULATIONROLEOFZINCFINGERMOTIFINRECQFA MILYHELICASE75-764.2THEFUNCTIONALASPECTSOFHRDCDO MAININRECQHELICASEFAMILY764.3THESPECIALSTRUCTURA LFEATUREOFARGININEFINGERINRECQFAMILYHELICASE76-78 REFERENCES78-95CHAPTER2RESULTS95-219ⅠZINCBINDINGMOTIFINRECQ5BACTSASAMOLECULARSWITCH TURNINGSTRANDANNEALINGINTODNAUNWINDING96-128AC KNOWLEDGEMENTS97-98SUMMARY98-99INTRODUCTION99-10 2MATERIALSANDMETHODS102-109PROTEINSANDDNASUBSTR ATES102-105QUANTIFICATIONOFTHEPROTEIN-BOUNDZN~(2+)I ONS105ATPBINDINGASSAY105-106ATPASEASSAY106DNABINDI NGASSAY106-107DNAHELICASEACTIVITYASSAY107-108DNAST RAND-ANNEALINGASSAY108-109RESULTSANDDISSCUSSION109-124RECQ5HELICASEDOMAINALONECATALYZESSTRANDANN EALING,BUTNOTSTRANDSEPARATION109-116THERECQ5HELIC ASEDOMAINBINDSATPEFFICIENTLY,BUTDISPLAYSAPOORATPA SEACTIVITY116-117AZINC-BINDINGMOTIFISESSENTIALFORTH EHELICASEACTIVITYOFRECQ5B117-120MOLECULARMECHANI SMOFINTRAMOLECULARSTIMULATIONOFCATALYTICACTIVIT YMEDIATEDBYTHEZINCBINDINGMOTIF120-121MODELFORTHE ROLEOFTHEZINC-BINDINGMOTIFINTHEFUNCTIONOFRECQHE LICASES121-124CONCLUDINGREMARKS124-125REFERENCES12 5-128ⅡBIOCHEMICALCHARACTERIZATIONOFHELICASEACTIVITYAN DDNASUBSTRATESPECIFICITYOFBACILLUSSUBTILISRECQHEL ICASES128-174ACKNOWLEDGEMENT129-130SUMMARY130-131I NTRODUCTON131-133MATERIALSANDMETHODS133-141REAGE NTS133NULEICACIDSUBSTRATES133TEMPLATESELECTIONAN DAMINOACIDSEQUENCEALIGNMENT133-136PROTEINEXPRESS ION136-137PROTEINPURIFICATION137QUANTIFICATIONOFZIN CIONBOUNDTOSUBLANDSUBSHELICASES137-138SIZEEXCLUSI ONCHROMATOGRAPHYOFSUBL138A TPASEASSAY138DNAHELI CASEASSAY138-139PROTEIN-DNABINDINGASSAYBYEMSA139D NASTRAND-ANNEALINGANDSTRAND-EXCHANGEASSAY139-1 41RESULTS141-165MOLECULARMODELLING141-143CLONING,PRODUCTIONANDPURIFICATIONOFRECQHELICASEFROMBACIL LUSSUBTILIS143-145DNA-DEPENDENTATPASEACTIVITY145-148 DNAUNWINDINGACTIVITIESASSAYVERSUSB.SUBTILISRECQH ELICASESCONCENTRATION148POLARITYANDPROCESSIVITYO FTHEB.SUBTILISRECQHELICASES148-153B.SUBTILISRECQHELI CASEACTIVITYONBLUNT-ENDEDANDGAPPEDDNASUBSTRATE S153-155B.SUBTILISRECQHELICASEACTIVITYONFORKEDDUPL EXDNAWITHINCREASING3’AND5’-TAILLENGTH155B.SUBTILIS RECQHELICASESTARGETDNAREPLICATIONANDREPAIRINTER MEDIATES155-160BINDINGOFTHEPUTATIVEB.SUBTILISRECQT ODNASUBSTRATES160-162B.SUBTILISRECQHELICASESPOSSES SDNASTRAND-ANNEALINGACTIVITYANDPROMOTEDNAEXCH ANGEWEAKLY162-165DISCUSSION165-170REFERENCES170-174Ⅲ.THEARGININEFINGEROFTHEBLOOMSYNDROMEPROTEIN:IT SSTRUCTURALORGANIZATIONANDITSROLEINENERGYCOUPLI NG174-219ACKNOWLEDGEMENTS175-176SUMMARY176-177INT RODUCTION177-182MATERIALSANDMETHODS182-189PLASMID CONSTRUCTIONANDSITE-DIRECTEDMUTAGENESIS182PROTEI NEXPRESSIONANDPURIFICATION182-183DNASUBSTRATESPRE PARATION183ATPASEASSAY183-184DNAUNWINDINGACTIVITY ASSAY184-185DNABINDINGASSAY185-186DNAANNEALINGACT IVITYBYEMSA186ATP-BINDINGASSAYS186-188PREPARATIONOFORTHOV ANADATESOLUTIONS188-189RESULTS189-211DESIGN, EXPRESSION,ANDPURIFICATIONOFBLMMUTATIONS189-191VII NHIBITSANDUNCOUPLESATPASEANDDNAUNWINDINGACTIVI TIESOFBLM191-194HELICASEANDATPASEACTIVITIESOFTHEM UTANTENZYMES194-199ALLMUTANTSDISPLAYNORMALATPAN DDNABINDINGABILITIES199-206ARGININERESIDUESMUTANTS DISPLAYNORMALANNEALINGABILITIES206-207VIINHIBITIONS TUDYREVEALSTHATR982FUNCTIONSASANARGININEFINGER2 07-211DISCUSSION211-216REFERENCES216-219CHAPTER3GENE RALCONCLUSIONANDPERSPECTIVE219-2251THESPECIALFUNC TIONOFZINCBINDINGMOTIFINRECQFAMILYHELICASES220-221 2THEFUNCTIONOFTHEHRDCDOMAININRECQHELICASEFAMIL Y221-2223THESPECIALSTRUCTURALFEATUREOFARGININEFIN GEROFRECQFAMILYHELICASE2224PERSPECTIVE222-224REFER ENCES224-225CHAPTER4APPENDIXES225-244Ⅰ.MATERIALSANDMETHODS226-2441.PLASMIDSCONSTRUCTI ON226-232A.PCRANDGELEXTRACTION226-227REAGENTSANDI NSTRUMENTS226PROTOCOL226-227B.PLASMIDCONSTRUCTIO N227-232REAGENTSANDINSTRUMENTS227-228PROTOCOL228-2 322.PROTEINEXPRESSIONANDPURIFICATION232-235REAGENTS ANDINSTRUMENTS232-233PROTOCOL233-2353.WESTERNBLOT 235-238REAGENTSANDINSTRUMENTS235-236PROTOCOL236-2384.ATPASEACTIVITY238-239REAGENTSANDINSTRUMENTS238PR OTOCOL238-2395.HELICASEACTIVITYEXAMINATION239-242RE AGENTSANDINSTRUMENTS239-240PROTOCOL240-2426.DETER MINEZINCIONCONCENTRATIONOFHELICASE242-244REAGENT SANDINSTRUMENTS242PROTOCOL242-244Ⅱ.LISTOFPUBLICATIONS244 本论文购买请联系页眉网站。
