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第5章基因工程菌的发酵

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第五章微生物与发酵工程

第五章微生物与发酵工程

第五章微生物与发酵工程一、单选题（35分）：1.操纵细菌的抗药性、固氮、抗生素生成等性状的基因位于（ ）A. 核区B.线粒体C. 核糖体D.质粒 2.通常用来作为菌种鉴定的重要依据是（ ）A. 细菌体积 B ．细菌形状 C ．菌落特点 D.细菌结构 3．要从多种细菌中分离出金黄色葡萄球菌，培养基要用 （ ）A. 加入青霉素的培养基 B ．加入高浓度食盐的培养基 C ．固体培养基 D.液体培养基 4．下列与微生物的代谢活动专门旺盛无关的缘故是 （ ）A ．表面积与体积比大B ．数量多C ．对物质的转化利用快 D. 表面积大 5．下列微生物的产物中没有菌种特异性的一组是 （ ）A ．氨基酸、核苷酸、多糖、毒素、激素B ．核苷酸、维生素、多糖、脂类、氨基酸C ．多糖、脂类、维生素、抗生素、氨基酸D ．氨基酸、多糖、维生素、色素、抗生素 6．可用于观看细菌运动的培养基是 （ ）A ．固体培养基B ．半固体培养基 C.液体培养基 D.天然培养基 7．研究微生物的生长是以群体为单位的，这项研究不包括 （ ） A ．菌落的生长 B ．繁育 C.群体细胞数增加 D.个体的体积增大 8．作为生产用和科研材料用的菌种，常选 （ ） A.稳固期 B ．衰亡期C ．调整期 D. 对数期9．下列不属于微生物的是 （ )A.原核生物B.原生生物C.真菌D.微小动植物10．在微生物生长的过程中，细胞形状最多和数目最多的时期是 （ ）A.对数期、稳固期B.衰亡期、对数期C.稳固期、衰亡期D.衰亡期、稳固期11．环境中氧含量的状况，对不同代谢类型的微生物群体的生长具有不同的阻碍，下列菌中无明显阻碍的是 （ ）A ．酵母菌B ．产甲烷杆菌 C.破伤风杆菌 D ．乳酸菌12．微生物群体生长状况的测定方法能够是 （ ）:①测定样品的细胞数目 ②测定次级代谢产物的总含量 ③测定培养基中细菌的体积 ④测定样品的细胞重量A ．②④ B．①④ C.①③ D.②③13．微生物代谢的调剂属于 （ ）A ．神经调剂 B.激素调剂 C ．酶的调剂 D.基因调剂14．在细菌培养中，所制备的斜面培养基形成的斜面的长度不超过试管总长的（ ） A.l ／5 B ．2/3 C ．1/4 D ．1/215．在培养基的配制过程中，具有如下步骤，其正确顺序为 （ ） ①溶化 ②调pH ③加棉塞 ④包扎 ⑤培养基的分装 ⑥称量A.①②⑥⑤③④ B ．⑥①②⑤③④ C ．⑥①②⑤④③ D ．①②⑤④⑥③ 16．通过阻碍微生物膜的稳固性，从而阻碍营养物质吸取的因素是（ ） A.温度B. pHC.氧含量 D ．前三者的共同作用 17．在实际生产中，对数期的长短取决于（ ）①培养罐的大小 ②接种量的大小 ③培养基的多少 ④代谢产物合成的多少 A.②④ B ．②③ C ．①② D ．①③18．发酵是利用微生物生产有用代谢产物的一种生产方式，通常说的乳酸发酵属于 （ ） A.固体发酵 B ．液体发酵 C ．氨基酸发酵 D ．需氧发酵 19．圆褐固氮菌可利用的氮源是 （ ） A ．氨 B ．分子氮 C ．尿素 D ．蛋白陈 20．多数真菌的最适pH 出为（ ）A ．5．0～6．0 B. 6．0～7．0 C ．4．0～5．0 D.3．0～4．0 21．酵母菌培养过程中的生长曲线如图所示：a 、b 、c 、d 分别表示不同的生长时期，其中适于作为生产用菌种的时期是A aB bC cD d22．关于微生物代谢产物的说法中不正确的是 （ ）A.初级代谢产物是微生物生长和繁育所必须的B.次级代谢产物并非是微生物生长和繁育所必须的C.次级代谢产物在代谢调剂下产生D.初级代谢产物的合成无需代谢调剂23．单细胞蛋白是通过下列何种方法获得的 （ ）A ．基因工程B ．细胞工程C ．发酵工程 D.酶工程24．某药厂用谷氨酸棒状杆菌发酵生产谷氨酸，结果代谢产物没有谷氨酸而产生乳酸及琥珀酸，其缘故是 （ ）A．温度操纵不适B．通气量过多 C. pH呈酸性 D.溶氧不足25．下列可用于生产谷氨酸的菌种是（）A.谷氨酸棒状杆菌、金黄色葡萄球菌B．链球菌、大肠杆菌C.谷氨酸棒状杆菌，黄色短杆菌D．大肠杆菌、乳酸菌26．发酵过程中，可不能直截了当引起pH变化的是（）A．营养物质的消耗B．微生物呼出的CO２C．微生物细胞数目的增加D．次级代谢产物的积存27．能为发酵工程提供菌种的是（）A.植物体细胞杂交B．动物细胞融合 C. 目的基因转移 D.聚乙二醇处理大肠杆菌28．依照酶在生物体内存在的部位，可分为胞内酶和胞外酶，下列酶中属于胞外酶的是（）A.呼吸酶B.光合酶C．消化酶D．解旋酶29．在生产实践中，假如接种量大，则细菌生长的情形是（）A.调整期延长B.调整期缩短C.对数期缩短D.稳固期后移30．微生物体内抗毒素、抗生素、色素等的形成时期要紧是在( )A.调整期B.对数期C.稳固期D.衰亡期31．所有细菌都具有特点是（）A 差不多上异养生物B 仅在有水条件下繁育C 仅在有氧条件下生长D 生存温度都超过80℃32．关于灭菌和消毒的不正确的明白得是（）A．灭菌是指杀灭环境中的一切微生物的细胞、芽孢和孢子B．消毒和灭菌实质上是相同的C．常用灭菌方法有加热法、过滤法、紫外线法、化学药品法 D．接种环用烧的法灭菌33．构成流感病毒的结构是（）A.荚膜、衣壳、核酸B.鞭毛、核酸、衣壳C.囊膜、鞭毛、核酸D.囊膜、衣壳、核酸34．下图是表示温度对微生物的生长阻碍，其中正确的是（）35．酵母菌培养液常含有一定浓度的葡萄糖，但当葡萄糖浓度过高时，反而抑制微生物的生长，缘故是（）A.碳源供应太充足B.细胞会发生质壁分离C.改变了酵母菌的出值D.葡萄糖不是酵母菌的原料二、多选题（10分）：36．发酵工程的第一个重要工作是选择优良的单一纯种。

植酸酶基因工程菌的发酵研究

植酸酶基因工程菌的发酵研究
发酵产酶有一定的抑制作用。
关键词 ： 酸酶 ； 酵 ； 植 发 植酸 酶基 因工 程菌
植 酸 酶 （ ｈ ｔ ｅ） 一 种 新 型 食 品 与 饲 料 添 加 剂 ， 能 １ ｏ Ｌ Ｂ ｐ ６ ０。 ｐ Ｙ ｓ 是 ａ 它 ｍ Ｌ／ Ｐ Ｓ， Ｈ ．
催 化 植酸 （ ） 盐 水解 为肌 醇 及无 机磷 酸 ， 进微 量 元素 及 蛋 促
从 ０ ０ ５ ｏ ／ 的植 酸钠 溶 液 中释 放 １ ｍ Ｌ 机 磷 所 需 的酶 ． ０ １ｍ Ｌ Ｌ ｎ ｏ 无
Ｙ Ｄ种子液 ： ％ 母提取物 ； ％蛋 白胨 ； ％葡萄糖 。 Ｐ １酵 ２ ２
增 殖 培养 基 ： 母 提 取 物 １ ｇ Ｌ 蛋 白胨 ２ ｇ Ｌ 酵 母 量 为 一 个 酶 活 单 位 。 酵 ０ ／， ０ ／， 氮 源 （Ｎ ） ３ ４ ｇ Ｌ 生 物 素 ０ ４ ｇ Ｌ 甘 油 ｌ Ｌ Ｌ ０ １ １４ 植酸酶基 因工程菌摇瓶发酵产酶条件 的研究 Ｙ Ｂ １． ／ ， ． ｍ ／ ， ０ ｍ ／ ， ． ．
ｍ ０ ０ ７ ｍ ｌ Ｌ Ｌ ． ０ ６ ｏ ／ 植酸 钠溶 液 ）在 分 光 光 度 计 上 测 Ｏ ４ ５ ｍ ， Ｄ １ｎ
１
材 料 与 方 法
植 酸 酶 基 因工 程 菌 Ｅ ２ ， 本 实 验 室 构 建 。 一 ２为
１ １ 供试菌株 ．
１２ 培养基及试剂配制 ．
琼 脂 。
ｍ ／ Ｐ Ｓ， Ｈ ． ｏｌ Ｌ Ｂ ｐ ６ ０。
种子活化与种子液的制备 ： 将实验室保存的植酸酶基因工
诱导培养基 ： 酵母提取物 １ ｇ Ｌ 蛋 白胨２ ｇ Ｌ 酵母 程 菌Ｅ ２ 划线于Ｙ Ｄ ０ ／， ０ ／， 一２ Ｐ 培养基平板上 ，８ ℃～３ ℃温箱 中培养 ， ２ ０

植酸酶基因工程菌的发酵研究

植酸酶基因工程菌的发酵研究

步的酶学性质研究 ， 其最适温度 、Ｈ、 热性等都能 ｐ 耐 很好的满足生产需要 ， 有很高的应用潜在价值 。在实 验室条件下对植酸酶基 因工程菌 （ 一 ） Ｅ２ 进行发酵研 ２ 究， 为发酵生产作探索性研究。
微量元素及蛋 白质等营养成分 的吸收。植 酸酶广泛 存在于动物 、 植物和微生 物中， 目前实际应用 的植酸
６ ０；ｍｅｈ ｎ ｌ ｐ ｅ ｄ ｄ ａ ｕ ｔ ． ， ｔ ａ ｏ ｐ ｎ ｅ ｍｏ ｎ ：１ ５％ ；ａ ｄ ｆ ｌ ｇ ｌ ｕ ｄ ｖ ｌ ｍｅ ０ ． Ｅ ｔ ｅ ｌ ｌｒ ｐ ｙ ａ ｅ ａ ｃ ｓ １ ６ ７ Ｕ ｍＬ ｗａ ｂ ａ ｎ ｉ ｉ ｉ ｉ ｏｕ ：１ ％ ｌｎ ｑ ｘｒ ｅｌ ａ ｈ ｔｓ ｓ ｍｕ ｈ ａ ６ ４１ ． ／ ｓ ｏ － ａ ｕ ４
Ａｂ ｔ ａ ｔ Ｔ ｅ ｆ ｒ ｎ ｉｇ ｐ ｏ ｅ ｓ ｓ ｏ ｈ ｅ ｉ ｎ ｉ ｅ ｒ ｇ ｓ ａ ｎ Ｅ一 ２ ｆｒｐ ｏ ｕ ｉ ｇ ｐ ｙａ ｅ ｗ ｒ ｔ ｄ ｅ ．Ｔ ｅ ｏ ｔ ｍ ｏ ｄ ｔ ｎ ｒ ｓ ｒ ｃ ： ｈ ｅｍｅ ｔ ｒｃ ｓ ｅ ｆ ｅ ｇ ｎ ｃ ｅ ｇ ｎ ｅ ｉ ｔ ｉ ２ ｏ ｒｄ ｃ ｎ ｈ ｔｓ ｅ ｅ ｓｕ ｉ ｄ ｎ ｔ ｎ ｒ ｈ ｐｉ ｍｕ ｃ ｎ ｉ ｏ ｓ ｆ ｉ ｏ ｌ ｕ ｄ ｆｒ ｅ ｔｔ ｎ ｗ ｒ ：ｉｏ ｕ ａｉ ｎ ａ ｅ ｂ ｕ ６ ｈ ｎ ｃ ｌ ｔ ｎ ａ ｕ ｔ １ ％ ；ｍｕ ｔ ｌ ａ ｉｎ ｔ ｉ ｉ ｅ ｑ ｍ ｎ ａｉ ｅ ｅ ｎ ｃ ｌ ｔ ｇ ：ａ ｏ ｔ ３ ；ｉ ｏ ｕ ａｉ ｍｏ ｎ ： ｏ ｏ ｏ ０ ｌｐｉ ｔ ｉ ｉ ｃ ｏ ｍｅ：７ ；ｆ ｒ ｅ ｔ ｔ ｎ ｌ ｕ ｄ ｐ ： ２ｈ ｅ ｍ ｎ ａｉ ｉ ｉ Ｈ ｏ ｑ

第五章 发酵工程

第五章 发酵工程

• 2，灭菌与消毒的区别
• 灭菌：用物理或化学方法杀死或除去环 境中所有微生物，包括营养细胞、细菌 芽孢和孢子
• 消毒：用物理或化学方法杀死物料、容 器、器皿内外的病源微生物。
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二、培养基灭菌的目的 1，在发酵过程中夹杂其它杂菌造成的后果： • 生产菌和杂菌同时生长，生产菌丧失生产能力； • 在连续发酵过程中，杂菌的生长速度有时会比生 产菌生长得更快，结果使发酵罐中以杂菌为主； • 杂菌及其产生的物质，使提取精制发生困难 • 杂菌会降解目的产物； • 杂菌会污染最终产品，杂菌会污染最终产品； • 发酵时如污染噬菌体，可使生产菌发生溶菌现象
●
2）温度可能会影响终产物的质量
例如： 苏云金杆菌的发酵，一般在30-31℃进行，这样形成的晶体 毒力强。若发酵温度提高到37℃以上，虽然菌体生长繁殖较快， 最终含菌数也较高，但生物毒力较低，直接影响产品的质量。
3）温度还可能影响生物合成的方向
例如： 四环素发酵中金色链霉菌同时能产生金霉素。在低于30℃下， 该菌合成金霉素能力较强；温度提高，合成四环素的比例提高； 在温度达到35℃时，则只产生四环素，金霉素的合成停止
发酵过程泡沫控制的方法
• 物理消沫法 • • 化学消沫法
消泡剂选择的原则：
① 对发酵过程无毒，对人、畜无害，不影响生物合成。
② 消泡作用迅速，效果高和持久性能好。
③ 能耐高压蒸汽灭菌而不变性，在灭菌温度下对设备无腐蚀 性或不形成腐蚀性产物。 ④ 不影响以后的提炼过程。 ⑤ 不干扰分析系统，如溶解氧、pH测定仪的探头。
• 第一阶段：发酵原料的预处理
• 第二阶段：发酵过程的准备
• 第三阶段：发酵过程
• 第四阶段：产品的分离与纯化

基因工程菌发酵培养的流程

基因工程菌发酵培养的流程

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1. 菌种复苏和激活，从菌种库中取出保藏的菌种，在无菌条件下培养，激活其生理活性。

工程菌的知识

工程菌的知识

工程菌的知识基因工程大肠杆菌发酵的研究摘要：基因工程菌的发酵工艺研究在生物高技术产业化的发展中具有重要的意义。

研究结果表明，每１０Ｌ发酵液可得１～２ｋｇ湿菌体，发酵时间从一般的２４～３０ｈ缩短到６～８ｈ，５Ｌ、１５Ｌ、１５０Ｌ发酵罐都可得重复性的结果。

这项发酵工艺研究不仅适用于E.coli各种不同类型的表达启动子的工程菌，也适用于野生菌株疫苗等的生产，将对我国基因工程产业化起重要作用。

关键词基因工程菌,高密度发酵,人干扰素α22b ,鲑鱼降钙素,鱼生长激素, K88K99 基因工程疫苗作者：巫爱珍. 孙玉昆.刊名：生物工程学报讨论:含PL 启动子的E. coli 工程菌的表达及温度敏感株活菌疫苗的生产。

要求细菌在较低的温度(30 ℃) 发酵增殖,在一定时间内提高菌体密度,然后迅速提高温度诱导目的产物的表达。

这类菌表达产物的表达量取决于二个因素:一是在30 ℃发酵过程中尽可能提高菌体密度,二是快速升温诱导,要同时解决这二个问题是较困难的,目前不少基因工程研究室或生产厂对于这类菌的发酵均遇到上述同类的问题,即菌体密度不高和表达量低,他们为了得到足量菌体只好采用扩大发酵体积,显然不是良策,因为含PL 启动子的工程菌在发酵过程中发酵体积越大(500～1000L) ,其表达效率愈低,并大大增加了抽提分离表达产物的工作量、设备投资、运转费及污水处理量。

而本文报道的高密度发酵技术能同时解决以上的问题,发酵时间短(约8h) ,菌体密度及表达效率高,生产车间小型化,能节省大量后处理的设备投资、人力、能源、废物废水处理量少,符合发展现代化生产的要求。

对于不需温度诱导表达,在30 ℃发酵的工程菌或野生菌应用我们的工艺技术发酵,当发酵持续6 小时,菌体仍在直线增殖的情况下,如果延长发酵时间,菌体将继续增加。

E. coli 的不同工程菌或野生菌具有不同的特性,在发酵过程中我们随之对发酵条件作了相应的改变,均取得高密度的发酵结果。

(完整版)生物技术制药习题答案(夏焕章版)

第一章绪论填空题1. 生物技术制药的特征高技术、高投入、高风险、高收益、长周期。

2. 生物药物广泛应用于医学各领域，按功能用途可分为三类，分别是治疗药物、预防药物、诊断药物。

3.现代生物药物已形成四大类型：一是应用DNA重组技术制造的基因重组多肽、蛋白质类治疗剂；二是基因药物；三是来自动物植物和微生物的天然生物药物；四是合成与部分合成的生物药物；4.生物技术的发展按其技术特征来看，可分为三个不同的发展阶段，传统生物技术阶段；近代生物技术阶段；现代生物技术阶段。

5.生物技术所含的主要技术范畴有基因工程；细胞工程；酶工程；发酵工程；蛋白质核酸工程和生化工程；选择题1.生物技术的核心和关键是（A ）A 细胞工程B 蛋白质工程C 酶工程D 基因工程2. 第三代生物技术（ A ）的出现，大大扩大了现在生物技术的研究范围A 基因工程技术B 蛋白质工程技术C 海洋生物技术D细胞工程技术3.下列哪个产品不是用生物技术生产的（D ）A 青霉素B 淀粉酶C 乙醇D 氯化钠4. 下列哪组描述（A ）符合是生物技术制药的特征A高技术、高投入、高风险、高收益、长周期B高技术、高投入、低风险、高收益、长周期C高技术、低投入、高风险、高收益、长周期D高技术、高投入、高风险、低收益、短周期5. 我国科学家承担了人类基因组计划（C ）的测序工作A10% B5% C 1% D 7%名词解释1.生物技术制药采用现代生物技术可以人为的创造一些条件，借助某些微生物、植物或动物来生产所需的医学药品，称为生物技术制药。

2.生物技术药物一般说来，采用DNA重组技术或其它生物新技术研制的蛋白质或核酸来药物称为生物技术药物。

3.生物药物生物技术药物是重组产品概念在医药领域的扩大应用，并与天然药物、微生物药物、海洋药物和生物制品一起归类为生物生物药物。

简答题1.生物技术药物的特性是什么？生物技术药物的特征是：（1）分子结构复杂（2）具有种属差异特异性（3）治疗针对性强、疗效高（4）稳定性差（5）免疫原性（6）基因稳定性（7）体内半衰期短（8）受体效应（9）多效应和网络效应（10）检验特殊性2.简述生物技术发展的不同阶段的技术特征和代表产品？（1）传统生物技术的技术特征是酿造技术，所得产品的结构较为简单，属于微生物的初级代谢产物。

基因工程菌的发酵控制

基因工程菌的发酵控制近年来，基因工程已开始由实验室走向工业生产，一些珍稀药物如胰岛素、干扰素、人生长激素等已先后面市，但从许多研究中发现，基因重组菌的培养与发酵有其自身的特点。

从培养工程的角度应考虑诸如营养源浓度的控制（碳源、氮源等）、最适生长条件的控制等因素；从生物学上应考虑诸如质粒稳定性的控制、质粒拷贝数的控制、转录效率和翻译效率的提高及代谢产物向菌体外的分泌等主要因素。

1 、营养源浓度的控制由于大多数基因重组菌不能把所需的基因产物分泌到胞外，而只能靠破碎细胞后提取，因此要获得基因产物，首先必须得到大量菌体。

为此基因重组菌的发酵一般采用高浓度菌体培养的方法，如大肠杆菌培养时最高可达125g 干菌体/L 发酵液，酿酒酵母可达145g 干菌体/L 发酵液。

但要得到高浓度菌体，必须要提供高浓度的营养物质，而营养源浓度过高，渗透压也就高，反过来又会抑制重组菌的生长。

此外，许多基因重组菌常是维生素或氨基酸的营养缺陷型菌株，为维持菌体生长，也必须添加必需量的生长因子营养物。

常采用在调节pH 的同时补加氨基酸混合液和葡萄糖的方法。

使整个培养期间，葡萄糖和氨基酸的浓度几乎保持恒定，菌体持续以最高生长速度生长，得到高浓度菌体。

2 、质粒的不稳定性及其控制在重组菌工业化生产过程中，质粒的不稳定性是一个极为重要而独特的问题。

带有质粒的细胞生长较慢，生长速率与所带质粒的大小成反比。

此外，高水平克隆基因产物的生成也会导致生长缓慢或生长异常（表达越高，生长越慢）。

由于质粒的不稳定性，在繁殖传代过程中还会有一部分细胞部分甚至完全丢失质粒，导致所需产物的产量下降。

质粒不稳定包括分离性不稳定和结构性不稳定两种类型。

前者是细胞分裂过程中质粒没有分配到子细胞中而导致整个质粒的丢失；后者是由于重组质粒DNA 发生缺失、插入或重排而引起的质粒结构变化。

为了在工业化生产时使质粒的丢失降低到最低程度，除了构建合适的重组菌外，还应对重组菌进行一系列发酵试验，选择最佳的发酵条件。

基因工程菌发酵及相关技术交流

基因工程菌发酵及相关技术交流~！长期以来，生物、化学、医学、发酵工程等等相关专业出身的技术人员，无论是那一种，在学校所处。

比如规模小，控制更精确，产物易失活等。

工程菌的发酵由于没有一个通用方案，可能全国各家实验室、研究所、高校所用的发酵条件千差万开这个题目的目的就是想让大家在基因工程菌发酵方面有一个平台，说说所犯的一些错误，讲讲实=======================================欢迎大家把自己在基因工程菌构建及发酵过程中所遇到的一些问基因工程菌涉及的东西很多，目前应用比较多的有原核表达系统（大肠杆菌和枯草杆菌）以及真核=======================================个人观点：基因工程药物的发酵生产也许是目前和微生物技术方关于中国基因工程药物一、中国基因工程药物产业化发展历史新中国成立近50年来，医药工业的发展已达到相当的规模，医药企业在4000家以上，其中约三分不断增加，一个以生物高新技术为主的产业，日益发展壮大，并逐步成为一个独立的新型产业，有改革开放以来，我国政府一直把医药生物技术产业作为重点建设行业来发展，早在“七五”就mRNA，反转录成DNA，构建质粒pBV867，转化到大肠杆菌N6405株中表达成功。

经过多年的中试研rHUIL－2等，在其表达量上有所突破，构建的工程菌均具有产业化生产价值，为我国基因工程制从“七五”末期到“八五”中期我国研究基因工程药物以仿制为主，如 rHUIFNα2b、 HGH、进入90年代以来是我国生物技术产业蓬勃发展的时期。

这一阶段表现为：1．仿制产品已步入工业化生产阶段，如HGH、rHUIFNα2b、EPO等。

2．重复研制产品也将进入试生产，如rHUIFNα2a、rHUIL－2等。

3．重复引进产品不断涌入，如G－SCF、GM－CSF、EPO、rHUIFNα2b等。

4．基因治疗、基因诊断和人类基因组计划也在这时期同时启动。

基因工程菌的稳定性


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发酵罐的组成有：
发酵罐体、保证高传质作用的搅 拌器、精细的温度控制和灭菌系 统、空气无菌过滤装置、残留气 体处理装置、参数测量与控制系 统、培养液配制和连续操作系统。
对发酵罐要求： 提供菌体生长最适生长条件， 培养过程不得污染， 保证纯菌培养， 培养及消毒过程不得游离异物， 不能干扰细菌代谢活动等。
温度还影响蛋白质的活性和包 含体的形成。
⒋ 溶解氧的影响
对于好氧发酵,溶解氧浓度是重 要的参数。
好氧微生物利用溶解于培养液 中的氧气进行呼吸。
若能提高溶氧速度和氧的利用 率，则能提高发酵产率。
发酵时，随DO2浓度的下降， 细胞生长减慢，ST值下降，发酵后 期下降幅度更大。
外源基因的高效表达需要大量 的能量，促进细胞的呼吸作用，提 高对氧的需求。
第五节 基因工程菌的 稳定性
基因工程菌在传代过程中常 出现质粒不稳定的现象。
质粒不稳定可分为： 分裂不稳定 结构不稳定
分裂不稳定：指工程菌分裂时出现一 定比例不含质粒子代菌的现象。
结构不稳定：指外源基因从质粒上丢 失或碱基重排、缺失所致工程菌性 能的改变
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5.2.2 比生长速率
• 许多基因工程菌外源蛋白质的生产显示出 与生长速率正相关的特点。 • 故保持较高的比生长速率可提高目标蛋白 质的产量。 • 对于外源基因需诱导表达的基因工程菌发 酵，可分为菌体生长和外源基因诱导表达 两个阶段。分别控制合适的生长和表达条 件。
5.2.3培养条件
• 5.2.3.1 溶氧 • 外源基因的高表达需要细胞合成大量的 mRNA和重组蛋白，占用细胞的mRNA合成酶 和核糖体等资源，消耗更多的营养和能量， 给宿主细胞带来了很大的代谢负担，在培 养中显示更高的维持系数，因此基因工程 菌发酵中，一般应提供足够的氧以满足其 代谢的需要。 • 但仍需通过实验确定最佳的供氧水平。
Imanaka的基因工程菌脱落性 不稳定的模型
• 设： • 质粒丢失的概率为p， • 基因工程菌和丢失质粒的宿主菌分别以恒定 的比生长速率增殖。
S为限制性底物浓度，X+为带有重组质粒的菌体浓度， X—为丢失重组质粒的菌体浓度， a和b为系数。 μ ＋和μ －分别是带有重组质粒和丢失重组质粒菌体 的比生长速率，开始培养时菌体浓度分别是X0+和X0—。
5.2.3ቤተ መጻሕፍቲ ባይዱ3
pH
• 发酵pH可能对重组蛋白的生产有很大的影 响，主要原因是细胞分泌的蛋白酶会造成 重组蛋白的降解，而蛋白酶的活性则与pH 有很大的关系。
5.2.4 外源基因表达的诱导强度
• 基因工程菌的构建中通常考虑采用可诱导 的强启动子，但强启动子表达外源基因时， 高表达会对宿主细胞的代谢带来很大的负 担，影响细胞的生长和质粒的稳定性，故 在进行发酵时可分成两个阶段（生长和生 产）。 • 诱导剂的用量可以影响被诱导的启动子调 控的基因表达水平。
5.1.1.1 培养基的影响
• 基因工程菌在复合培养基中显示较高的质 粒稳定性。 • 在基本培养基中造成基因工程菌比例下降 的主要原因是基因工程菌和宿主菌比生长 速率的差异。 • 限制性底物种类对质粒稳定性有很大的影 响。对于给定的基因工程菌，培养时选用 恰当的限制性底物有可能明显提高质粒稳 定性，但需要进行实验确认。
• 由于基因工程菌中质粒的复制与维持以及 外源基因的表达需要消耗更多的物质和能 量，丢失重组质粒的宿主菌更具有生长的 优势，故α一般在1-2之间。
分批发酵过程基因工程菌质粒丢失的模型
dX＋/dt =μm＋S(1－p)X＋/(Ks＋S) dX－/dt =μm－SX－/(Ks＋S) ＋ μm＋SX＋p/(Ks＋S)
影响外源基因表达水平的因素
• • • • • 5.2.1 5.2.2 5.2.3 5.2.4 5.2.5 培养基 比生长速率 培养条件 外源基因表达的诱导强度 代谢产物的影响
5.2.1 培养基
• 培养基的设计要点，要能满足基因工程菌 的高密度培养，均衡的培养基的设计是关 键，多由实验确定最优的培养基。
5.1.1.3 外源基因的表达的影响
• 外源基因的高表达会引起重组质粒的不稳 定性。
5.1.1.4 其它培养条件的影响
• 温度：温度升高，基因工程菌的质粒稳定 性变差。 • pH和溶氧：由不同的实验数据看，没有明 显的规律可循。应对所用的菌种进行研究， 然后决定采用哪种工艺参数，才能保证质 粒的稳定性。 • 固定化：菌体经固定化后，质粒的稳定性 较好。主要原因可能是经固定化后的菌传 代次数较少。尚未形成质粒丢失的个体。 • 操作方式：周期性补料比分批培养的方式 的质粒稳定性较好。
避免乙酸对生长造成危害的措施
• 故通过限制葡萄糖的浓度（如补料发酵）， 维持较低的比生长速度，当比生长速率低 于临界值时，加强混合，使葡萄糖尽快分 散，可避免乙酸的生成。 • 采用不产生乙酸的菌株，或采用对乙酸耐 受性好的菌株也是避免乙酸对生长造成危 害的措施。 • 碳源种类的合理选择及搭配（如用甘油、 果糖、酮基戊二酸或延胡索酸为碳源可减 少乙酸的生成）。
5.2.5 代谢产物的影响
• 大肠杆菌在葡萄糖为培养基时，产生乙酸，乙酸 浓度过高，会影响菌体的生长，对外源基因表达 也有抑制作用。 • 对碳源供应应加以有效的控制，如采用流加葡萄 糖的方式。 • 有时也发现即使流加葡萄糖，也产生乙酸，可能 原因是搅拌不匀，致使流加的葡萄糖局部浓度过 高。 • 或加入其它碳源（如甘油）代替葡萄糖。 • 也可采用不产乙酸的菌，或采用对乙酸具有耐性 的菌株。
丢失本身的生长 丢失后转变过来的
dS/dt = －dX＋/dtY+ － dX－/dtY－ dP/dt =αdX＋/dt ＋ βX＋
5.2
影响外源基因表达水平的因素
• 外源基因表达水平的影响因素包括： • 基因剂量、转录和翻译效率、启动子、中 止编码、重组DNA的稳定性、mRNA的稳定性、 重组蛋白质的稳定性、宿主细胞和载体的 特性、偏爱密码子等因素。 • 此外，外源基因表达水平的影响因素还包 括：基因工程菌的培养条件、反应器的操 作和过程控制。
• 进行基因工程菌的高密度培养时，由于菌 体浓度很高，OUR相应也很高，而反应器的 KLa值有限，易造成供氧的限制。措施：增 大搅拌转速，增加空气流量，升高罐压， 甚至通入纯氧。 • 一般高的要求控制空气饱和度的80%，一般 不低于30%。
• 5.2.3.2 温度 • 对于采用温度调控基因表达的基因工程菌， 发酵过程可分为生长和表达两个阶段，分 别维持不同的培养温度。 • 温度也会影响重组蛋白的降解。降低培养 温度可以减少重组蛋白的降解。 • 发酵温度还会影响重组蛋白在细胞内的溶 解状态。
• bS ＋ X¯ →2 X ¯
• 经时间t的培养后，基因工程菌传代n次。可以推导 出基因工程菌在培养液中的比例Fn为： • Fn＝ （1－α－ p）/ ［1－α－p ×2n(a＋p－1)］ • α＝ μ－/μ＋
• α反映了丢失和带有重组质粒的细胞生长速率的差异。 • α一般在1-2之间。 α小于0，说明基因工程菌失去耐药性而被杀死
5.1.1.2 比生长速率的影响
• 判断质粒的稳定性的指标：传代数(而不是 丢失全部质粒所需时间)； • 质粒的稳定性与重组菌的比生长速率有关。 但不同的基因工程菌质粒稳定性与比生长 速率的关系呈现不同的规律。 • 一些基因工程芽孢杆菌在较高的比生长速 率下显示较差的质粒稳定性。
• 而未经重组的菌，比生长速率一般快于重 组菌。原因：代谢活动较少。 • 故两者的比生长速率有差异(Δμ)。这是 连续培养时，重组菌质粒不稳定性下降的 主要原因。 • 质粒稳定性也与带质粒细胞丢失质粒的概 率(p)有关。 • 在连续培养中，稀释率(D)越大，基因工程 菌在培养液中的比例下降加快。因为D增大， 同时带动Δμ和p的增大。
表5-7高密度培养酵母菌元素组成 （发酵过程原理P169）
元素 P 最低量 (g/L) 1.9 推荐量 (g/L) 2.2-10 元素 Fe 最低量 (g/L) 0.006 推荐量 (g/L) 0.0090.08
K
Mg Ca
1
0.15 0.06
1.5-10
0.3-1.2 0.08-0.8
Zn
Cu Mn
本章主要内容
• 5.1 基因工程菌的稳定性 • 5.2 影响外源基因表达水平的因素 • 5.3 基因工程菌的高密度发酵
5.1 基因工程菌的稳定性
• 5.1.1 培养条件对稳定性的影响 • 5.1.2 发酵过程中群体组成的变化
• 基因工程菌的稳定性是实现外源基因产物 高水平生产的基本条件。 • 外源基因是通过重组的载体进入受体菌中。 以质粒和噬菌体的方式。 • 外源基因位臵：质粒中，被整合到受体菌 中的染色体中。
影响基因工程菌质粒稳定性的因素
遗传因素
质粒的结构 质粒的拷贝数 宿主细胞特性 选择性遗传标记 外源基因表达水平
环境因素
培养基 限制性底物 比生长速率 溶氧 温度 发酵操作方式
5.1.1 培养条件对稳定性的影响
• • • • 5.1.1.1 5.1.1.2 5.1.1.3 5.1.1.4 培养基的影响 比生长速率的影响 外源基因的表达的影响 其它培养条件的影响
5.3 基因工程菌的高密度发酵
• 高密度发酵的优点：提高产物的生成速率、 提高目标产物的浓度，有利于进一步的产 品分离，减少反应器的体积。 • 分批培养不可能获得高菌体密度的发酵液， 通常采用补料分批培养实现。 • 5.3.1 高密度发酵 • 5.3.2 代谢副产物生成的防止 • 5.3.3 例
• 但高密度培养的实现并不一定意味外源基 因的高表达。应结合发酵动力学研究，建 立基因工程菌高密度培养的工艺条件，并 结合反应器的合理设计，配臵，操作和控 制，才能实现高效表达的目标。 • 5.3.1 高密度发酵的培养基优化 • 高密度发酵，关键是菌体生长所需的营养 成分合理。培养基的优化非常重要。 • 常用培养基中有些元素过量。
0.002
0.0006 0.0006
0.0030.04 0.0010.01 0.00090.008
S
0.1
0.2-5
5.3.2
代谢副产物生成的防止
• 不恰当的发酵工艺会造成严重的代谢副产 物积累，造成原料的浪费，抑制基因工程 菌的生长和外源基因的表达。
大肠杆菌积累乙酸问题
• 大肠杆菌在葡萄糖培养基中很容易积累乙 酸。供氧不足时更是如此。在形成乙酸后， 即使增加葡萄糖的浓度，也不能恢复菌体 的比生长速率。大肠杆菌积累乙酸的机理 不清。一般认为是由于三羧酸循环流量的 限制、呼吸链流量的限制等引起。有时， 由于流加葡萄糖时，葡萄糖未得到及时的 分散稀释，也会造成乙酸的产生。
基因工程菌的不稳定性的两种情况
• 分离(或脱落)不稳定性(Segregational instability)：基因工程菌的生长和繁殖 过程中，因重组质粒在子代细胞中的分配 问题，造成重组质粒的丢失；丢失重组质 粒的细胞在非选择性培养基中一般具有生 长优势。培养液中一旦出现丢失重组质粒 的细胞，基因工程菌细胞在培养液中的比 例会随时间快速下降(竞争不稳定性)。 • 结构不稳定性(structural instability)： 重组基因的突变造成。