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96中国兽医杂志2019年(第55卷)第10期Chinese Journal of Veterinary Medicine肠道中药对实验小鼠肠道乳酸菌和抗病能力的影响陆英杰，傅禹铭，方焕新，汤诗婷，李文峰，黄淑坚(佛山科学技术学院生命科学与工程学院,广东南海528231)摘要:为了研究肠道中药即肠痢康对小鼠肠道乳酸菌和抗病能力的影响，取32只SPF级BALB/c雄性小鼠，随机平均分为2组:对照组和试验组。
试验组按照药量浓度计算进行饮水供给，空白组小鼠自由采食饮水，记录小鼠每天采食量，计算 料肉比;酯酶染色法检测试验第1周,2周,3周,4周的T、B淋巴细胞比值的动态变化;1个月后，将对照组和试验组中各8只小鼠进行致病性葡萄球菌的攻毒试验,观察小鼠发病后即全部处死,ELISA检测小鼠血清中的IgM和C3,生化方法检测天门冬氨酸氨基转移酶(AST)和丙氨酸氨基转移酶(ALT)；采集小鼠肝脏和脾脏进行常规病理学染色，同时无菌进行乳酸菌的检测。
结果显示，试验组的料肉比数值明显小于对照组(P<0.05)，显示对小鼠生长有显著性促进作用;试验组T、B细胞比值高于对照组，差异显著(P<0.05);攻毒后，中药试验组的IgM明显高于对照组，差异显著(P<0.05),AST和ALT的含量显著低于对照组;常规染色方法观察对照组的肝脏和脾脏损伤程度明显高于药物试验组,显示中药试验组对肝脏具有保护作用，提高免疫功能。
关键词:SPF小鼠；肠道中药；乳酸菌；免疫功能；抗病能力中图分类号：S853.7文献标志码:A 文章编号：0529-6005(2019)10-0096-03Effect of Enteric medicine for intestinal flora and disease resistance of experimental mice LU Ying-jie,FU Yu-ming,FANG Huan-xin,TANG Shi-ting,LI Wen-feng,HUANG Shu-jian(Foshan University,Nanhai528231,China)Abstract:In order to study the complex intestinal Chinese herbal medicine for lactobacillus and disease resistance of experimental mice,32mice were randomly into2groups,including control group and experimental group.The experimental group was given medicine with water according to the calculated drug concentration and the control group was given drinking water freely,and then we recorded the intake of diets to calculate feed conversion ratio.T and B cells were analyzed by ANAE at the first week,second week, third week and fourth week.One month later,8mice were infected with pathogenic staphylococcus respectively for the control group and experimental group.After the mice had infectious symptoms,all mice were killed.ELISA method was used to test IgM and C3in serium samples of all groups.AST and ALT were analyzed by biochemistry method.The liver and spleen of mice were stained by the common pathological method.Then the lactobacillus was tested with sterility.The results showed that the feed conversion ratio of the experimental group was less than the control group obviously(P<0.05),which suggested the obvious acceleration.The T and B specific value of the experimental group was higher than the control,and the difference was significant(P<0.05).The concentration of IgM in the medicine group was higher than that in the medicine group after infected with bacteria(P<0.05).AST and ALT were lower of the medicine group compared with the control group.The level of the damage liver and spleen in the control group was severer than that in the medicine group,suggesting the medicine protects the liver and strengths the immune function.Key words:SPF mice；enteric Chinese traditional medicine；lactobacillus；immune function；disease resistanceCorresponding author:HUANG Shu-jian,E-mail^jhuang.foshan@中药逐渐替代抗生素在饲料中的使用和添加，为抗生素逐渐减少使用奠定基础，同时随着科学家收稿日期：2018-04-03基金项目：国家重点研发计划项目资助(2018YFD0501200)；广东省教育厅预防兽医学重点实验室项目(2014KTSPTO37)作者简介：陆英杰(1970-),女，副教授，博士，从事动物医学教学与科研工作,E-mail：919220436@通讯作者:黄淑坚,E-mail:sjhuang.foshan@ 不断地对中药的深入研究，中药调节正常菌群,提高机体自身免疫能力及抗病能力是未来畜牧业养殖及防控疾病的关键技术手段和科学进行生态养殖的方向,而肠道中药对肠道菌群的影响如何,能否单独使用不需与益生菌协同，由此，本课题组根据中药法典配方，进行药物配伍方面的更改，研究以大黄、黄苓、黄柏和黄连为主要成分的肠道复方中药即肠痢康对动物机体肠道功能及抗病能力等方面的影响，尽而Chinese Journal of Veterinary Medicine中国兽医杂志2019年（第55卷）第10期97为临床找寻可靠、可行的防控疾病的方法提供有价值的参考资料。
农业部公告第381号——兽医生物制品说明书和标签目录文章属性•【制定机关】农业部(已撤销)•【公布日期】2004.06.02•【文号】农业部公告第381号•【施行日期】2004.06.02•【效力等级】部门规范性文件•【时效性】现行有效•【主题分类】畜牧业正文中华人民共和国农业部公告（第381号）根据《兽药管理条例》和《兽药标签和说明书管理办法》的规定，核准以色列雅贝克药物与化学工业有限公司等7家企业申报的29个兽医生物制品的标签和说明书（见附件），现予公告（详见中国兽药信息网站）。
二00四年六月二日附件：兽医生物制品说明书和标签目录(第五册)┏━━━━━━━━━━┯━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┓┃公司名称│产品名称┃┠──────────┼──────────────────────┨┃以色列雅贝克药物与化│鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗┃┃学工业有限公司│┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│鸡新城疫活疫苗（La Sota株）┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│鸡传染性喉气管炎活疫苗（Samberg株）┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│鸡传染性法氏囊病活疫苗（MB株）┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│鸡新城疫、减蛋综合征二联灭活疫苗┃┠──────────┼──────────────────────┨┃法国维克制药集团│伪狂犬病灭活疫苗┃┠──────────┼──────────────────────┨┃美国先灵葆雅动物保健│鸡新城疫活疫苗（La Sota株）┃┃公司│┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│鸡传染性喉气管炎活疫苗（D-805株）┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│鸡传染性喉气管炎活疫苗（LT-IVAX株）┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│鸡新城疫、传染性支气管炎二联活疫苗┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│种鸡球虫活疫苗┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│肉鸡球虫活疫苗┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│鸡传染性法氏囊病活疫苗（Mouthrop株）┃┠──────────┼──────────────────────┨┃中牧实业股份有限公司│猪口蹄疫O型灭活疫苗（I）┃┃兰州生物药厂│┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│猪口蹄疫O型灭活疫苗（II）┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│牛口蹄疫O型灭活疫苗（OS 99型）┃┠──────────┼──────────────────────┨┃美国威兰公司│鸡传染性鼻炎铝胶灭活疫苗┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│鸡新城疫、传染性支气管炎、传染性法氏囊病、病┃┃│毒性关节炎四联灭活疫苗┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│鸡新城疫、传染性法氏囊病、传染性支气管炎三联┃┃│灭活疫苗┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│鸡传染性法氏囊病活疫苗┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│鸡传染性喉气管炎活疫苗┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│鸡马立克氏病活疫苗（CVI-988株）┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│禽多杀性巴氏杆菌病活疫苗┃┠──────────┼──────────────────────┨┃意大利IZO公司│鸡新城疫、减蛋综合征二联灭活疫苗┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│鸡新城疫、减蛋综合征、传染性支气管炎三联灭活┃┃│疫苗┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│鸡新城疫灭活疫苗┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│鸡马立克氏病活疫苗┃┠──────────┼──────────────────────┨┃│鸡新城疫、大肠埃希氏菌二联灭活疫苗┃┠──────────┼──────────────────────┨┃澳大利亚生物资源公司│鸡毒支原体病活疫苗（TSII株）┃┗━━━━━━━━━━┷━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━━┛。
兽医生物制品（黄淑坚）绪论一、生物制品与兽医生物制品1、生物制品：利用微生物及其代谢产物、寄生虫及其代谢产物、动物毒素→抗毒素、人或动物的组织、血液等经过加工处理制成用于人或动物相关疾病的诊断、预防、治疗的制剂。
2、兽医生物制品：专用于动物相关疾病的诊断、预防、治疗的制剂。
二、生物制品的发展史三、生物制品在生产中的应用1、诊断；2、预防；3治疗第一章常用兽医生物制品的种类（一）预防用兽医生物制品1、灭活苗（灭能苗）：利用物理或化学方法将病原微生物灭活使其丧失致病性和毒性加入佐剂制成；2、弱毒苗：利用物理、化学或微生物方法处理或传代微生物，使其失去致病性或仅造成隐性感染，大量繁殖后加入冻干保护剂制成；3、类毒素：细菌的外毒素经甲醛处理脱毒后免疫原性基本保持不变，加入佐剂制成（例：破伤风明矾沉降类毒素）；4、亚单位疫苗：通过物理、化学方法提取病原微生物表面保护性抗原，加入佐剂制成；5、合成肽疫苗：根据病原性微生物表面保护性Ag的氨基酸排列顺序，体外合成后加入佐剂制成；6、抗独特型抗体疫苗：根据免疫网络学说原理，利用第一抗体分子中的独特抗原决定簇（抗原表位）所制备的具有抗原的“内影像”结构的第二抗体。
该抗体具有模拟抗原的特性，故称之为抗独特型疫苗；7、基因工程苗：包括基因缺失苗（伪狂犬基因缺失苗）、基因表达疫苗；8、多联苗：利用多种微生物制成疫苗；9、多价苗：利用一种微生物多种血清型（或者血清亚型）制成疫苗；10、同源疫苗：一种微生物制成疫苗免疫动物后，用于预防该微生物强毒的感染与攻击，这种疫苗称为同源疫苗；11、异源疫苗：①用不同种微生物的菌（毒）株制备的疫苗，接种动物后能使其获得对疫苗中并未含有的病原体产生抵抗力；②用同一种中一种型（生物型或动物源型）微生物的菌（毒）株制备的疫苗，接种动物后能使其获得对异型病原体的抵抗力。
例：NDIV→PEG流行性腹泻;HTV→MDV鸡马立克病毒；猪瘟兔化弱毒苗→牛病毒性腹泻；表1-1 灭活疫苗与弱毒疫苗的比较种类优点缺点灭活疫苗比较安全，一般不发生全身性副作用，无返祖现象；有利于制备多价、多联等混合疫苗；制品稳定，受外界条件影响小，有利于运输、保存接种次数多、剂量大，免疫途径必须注射，不产生局部免疫；需要高浓度抗原物质，生产成本高。
我国研制出猪用抗多病免疫球蛋白
孙耀华
【期刊名称】《畜牧兽医科技信息》
【年(卷),期】1998(000)021
【摘要】第四军医大学动物保健品研制中心采用多种高纯抗原人工接种特定健康供浆动物,在适当时机采取多种相应抗体,即抗病免疫球蛋白达到综合指数时采集其血浆,经水解酶切除IgG结构上易使猪体发生过敏的FG片段后,再用盐析法收集特异性免疫球蛋白通过特殊试剂清除热源质并透析,去
【总页数】1页(P7-7)
【作者】孙耀华
【作者单位】高级兽医师
【正文语种】中文
【中图分类】S852.5
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1.我国科学家研制出静脉注射用人SARS("非典")免疫球蛋白 [J],
2.我国研制出国际首例棉铃虫病毒我国农产品将贴"身份"号码新疆成为最大胚胎移植基地生物杀螟农药研制成功纯天然绿色谷子品种育成抗条锈病春小麦育种获成功 [J], 余平凡;梁莉;尚纳新;董峻;杨东;汪金生;唐绂宸;王天玉
3.我国研制出抗甲型流感病毒口罩 [J], 无
4.应用抗多病免疫球蛋白控制猪群无名高热 [J], 张宏建
5.应用抗多病免疫球蛋白控制猪群无名高热 [J], 张宏建
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几种防治禽病的生物制剂
吴信达
【期刊名称】《广西畜牧兽医》
【年(卷),期】1993(000)001
【摘要】广西农业大学牧医系禽病室运用现代先进技术和工艺,先后研制成功了鸡减蛋综合症、传染性支气管炎、传染性法氏囊病、新城疫等的灭活油乳剂苗,既可制成单价苗、也可按需要配成二价或多价苗。
可用于后备种鸡和蛋鸡,也可用于雏鸡。
产品注射后产生
【总页数】1页(P64-64)
【作者】吴信达
【作者单位】
【正文语种】中文
【中图分类】S8
【相关文献】
1.几种防治烟草病毒病生物制剂的研究进展 [J], 徐宸;陈德鑫
2.几种生物制剂防治花生田蛴螬 [J], 刘瑶;杨士玲;马丽;李新民;叶保华;周萍
3.当前禽病发生的形势和特点以及主要禽病的防治 [J], 李增光
4.当前禽病发生的形势和特点以及主要禽病的防治 [J], 李增光
5.当前禽病发生的形势和特点及主要禽病的防治 [J], 李增光
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美国兽医生物制品管理条例简介
靳彦华;施振声
【期刊名称】《中国兽药杂志》
【年(卷),期】1999(033)002
【摘要】@@ 1兽医生物制品管制法及有关豁免事项rn美国兽医生物制品统归农业部(USDA),依据1913年颁布的兽医病毒、血清及毒素法(VST)来进行管理.1913年到1985年期间,VST法给予农业部的权力仅限于管理进入美国的兽医生物制品及美国兽医生物制品在州际间的销售.1985年美国食品安全法对VST法进行了补充,增加了农业部对兽医生物制品在州内的销售以及出口的兽医生物制品的管制权.【总页数】3页(P46-48)
【作者】靳彦华;施振声
【作者单位】中国兽药监察所,北京,10081;中国旅美学者
【正文语种】中文
【中图分类】F3
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1.中国畜牧兽医学会兽医生物制品学分会2012年度学术大会优秀论文奖作者简介[J],
2.美国兽医生物制品现状和发展趋势 [J], 王力;赵卓
3.美国与欧共体兽医生物制品的审批及管理 [J], 雷万里
4.我国兽医生物制品行业的学术盛会——中国畜牧兽医学会生物制品学分会会员代
表大会暨学术研讨会掠影 [J], 叶志刚;张宁（摄影）
5.美国兽医生物制品管理条例简介 [J], 靳彦华[1];施振声[2]
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农业部批准兽用生物制品
无
【期刊名称】《河北畜牧兽医》
【年(卷),期】2005(021)003
【摘要】根据《兽药管理条例》和《兽药注册办法》的规定．农业部经审查．批准中国农业科学院生物制品工程技术中心申报的鸡马立克氏病病毒Ⅰ型(CVl988／Rispens／B5株)、Ⅱ型(HCV2／B5株)、Ⅲ型(FCl26／B5株)三价活疫苗和农业部动物检疫所申报的鸡新城疫、病毒性关节炎二联灭活疫苗为兽用新生物制品，核发《新兽药证书》。
【总页数】1页(P55)
【作者】无
【作者单位】无
【正文语种】中文
【中图分类】S
【相关文献】
1.农业部批准3种新兽用生物制品 [J],
2.兽用生物制品批准文号申报流程 [J], 孙博;李继昌;胡婉君
3.农业部批准三种新兽用生物制品 [J], 无
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5.农业部公布81个兽用生物制品标准废止目录(中华人民共和国农业部公告第2294号) [J],
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绪论一、生物制品与兽医生物制品1、生物制品：利用微生物及其代谢产物、寄生虫及其代谢产物、动物毒素→抗毒素、人或动物的组织、血液等经过加工处理制成用于人或动物相关疾病的诊断、预防、治疗的制剂。
2、兽医生物制品：专用于动物相关疾病的诊断、预防、治疗的制剂。
二、生物制品的发展史三、生物制品在生产中的应用1、诊断；2、预防；3治疗第一章常用兽医生物制品的种类（一）预防用兽医生物制品1、灭活苗（灭能苗）：利用物理或化学方法将病原微生物灭活使其丧失致病性和毒性加入佐剂制成；2、弱毒苗：利用物理、化学或微生物方法处理或传代微生物，使其失去致病性或仅造成隐性感染，大量繁殖后加入冻干保护剂制成；3、类毒素：细菌的外毒素经甲醛处理脱毒后免疫原性基本保持不变，加入佐剂制成（例：破伤风明矾沉降类毒素）；4、亚单位疫苗：通过物理、化学方法提取病原微生物表面保护性抗原，加入佐剂制成；5、合成肽疫苗：根据病原性微生物表面保护性Ag的氨基酸排列顺序，体外合成后加入佐剂制成；6、抗独特型抗体疫苗：根据免疫网络学说原理，利用第一抗体分子中的独特抗原决定簇（抗原表位）所制备的具有抗原的“内影像”结构的第二抗体。
该抗体具有模拟抗原的特性，故称之为抗独特型疫苗；7、基因工程苗：包括基因缺失苗（伪狂犬基因缺失苗）、基因表达疫苗；8、多联苗：利用多种微生物制成疫苗；9、多价苗：利用一种微生物多种血清型（或者血清亚型）制成疫苗；10、同源疫苗：一种微生物制成疫苗免疫动物后，用于预防该微生物强毒的感染与攻击，这种疫苗称为同源疫苗；11、异源疫苗：①用不同种微生物的菌（毒）株制备的疫苗，接种动物后能使其获得对疫苗中并未含有的病原体产生抵抗力；②用同一种中一种型（生物型或动物源型）微生物的菌（毒）株制备的疫苗，接种动物后能使其获得对异型病原体的抵抗力。
例：NDIV→PEG流行性腹泻;HTV→MDV鸡马立克病毒；猪瘟兔化弱毒苗→牛病毒性腹泻；备注：FMDV口蹄疫、SFV猪瘟用乙烯亚胺类衍生物（结晶紫）制灭活苗其它细菌大都用0.3％甲醛灭活病毒0.5％甲醛灭活毒素0.4～0.7％甲醛灭活大多数细菌置于37℃培养灭活佐剂的运用：1、油乳佐剂（病毒疫苗）；2、Al(OH)3胶（细菌疫苗）；3、蜂胶（细菌）灭活剂：1、甲醛；2、结晶紫（猪瘟）；3、乙烯亚胺类衍生物（二）治疗用兽医生物制品1、抗病血清：Ag3~5次→动物→产生Ab，Ab主要存在于血液的血清中→提取血清→加入抗菌药物、防霉剂2、抗毒素：类毒素3~5次→动物→产生Ab→提取血清→加入抗菌药物、防霉剂3、高免卵黄液：Ag3~5次→母禽→产生Ab→移行至母禽产下蛋的蛋黄中→提取蛋黄→加入1～2倍生理盐水（含有抗菌药物、防霉剂）（三）诊断用兽医生物制品1、标准Ag2、标准Ab第二章兽医生物制品的发展趋势1、GMP（生产与管理）2、从第一代疫苗（灭、弱、亚、类）→第二代疫苗（基因工程）→第三代疫苗（合成肽苗、抗独特型抗体疫苗）3、更加注重诊断用兽医生物制品4、向更浓缩、纯度更高方向发展5、更加注重免疫佐剂、灭活剂的研究6、更加注重产品的质量与冷链过程第三章免疫佐剂一、免疫佐剂的概念本身没有免疫原性，但与Ag联合使用，能大大提高Ag的免疫原性或改变免疫应答类型，这种物质为免疫佐剂二、免疫佐剂的要求1、安全、无毒副作用2、化学纯以上的试剂3、吸附能力强4、容易吸收5、稳定性强、能保存1~2年三、常用免疫佐剂的制备（一）不溶性铝盐胶体的佐剂1、Al（OH）3AlCl3（无水）+NaOH→Al（OH）3胶↓（滴定法）明矾+NH3▪H2O→Al（OH）3胶使用注意事项：①灭活菌液：Al（OH）3胶=4：1②Al（OH）3经126℃高压，30min灭菌后使用③Al（OH）3能诱导老年痴呆症④配制好的疫苗应摇匀后使用2、明矾佐剂（例：破伤风明矾沉降类毒素）制备：明矾10g+dH2O→10％明矾溶液（明矾佐剂）使用：500ml灭活菌液加10ml10％明矾佐剂（溶液）（二）油乳佐剂1、弗氏不完全佐剂（FIA）制备：液体石蜡油3份+无水羊毛脂1份+PH7.2PBS 4份→混合，116℃30min使用：FIA：Ag=1：12、弗式完全佐剂（FCA）制备：FIA加入牛结核分支杆菌（冻干粉）10mg／ml混匀使用：FCA：Ag=1：1 △FIA和FCA为免疫佐剂（实验用）3、白矿油佐剂（用于病毒疫苗）油相：①320ml 10号白矿油（杭州杭联化工有限公司）②7g硬脂酸铝③22~24ml 司本-80（span-80）④6ml 吐温-80（Tween-80）把②加入①煮溶，冷却后，再加③、④水相：灭活病毒液150ml+6ml吐温-80制备油相：水相=7：3或6：4（高速搅拌，3min）（三）蜂胶佐剂30g蜂胶（研磨成粉）+500ml95％酒精→浸泡一周→4层纱布过滤→过滤液（佐剂）使用：500ml灭活菌液加15ml蜂胶佐剂特点：①没有什么毒副作用②吸收快③产生Ab快（7天产生保护性抗体）④抗体维持时间不长，不超过两个月第四章真快冷冻干燥技术（冻干）一、真空冷冻干燥技术将含有大量水分的生物活性物质冻结成固体，在真快条件下，利用减压升华原理，达到水分去除的目的。
二、共熔点及其测定方法1、共熔点：使溶液或悬浊液完全凝固的瞬间温度2、测定方法：不同的生物制品有不同的共熔点，是依制品中组成成分而异。
我们在进行冷冻干燥前，必须对其熔点进行测定，其熔点测定是根据导电溶液的电阻与温度相关关系的原理来测定，当温度降低时，电阻增大，当降到共熔点时电阻即出现突然增大的现象，此时的温度为该物质的共熔点。
下面是一些保护剂的共熔点。
1、冻干前准备①将冻干物品分装，用广口瓶②盛装量1／5~1／4，厚度不超10mm③冻干物品含干物质量达4~25％2、预冻①将冻干物品置于-40℃②预冻时间3~4小时3、干燥①升华干燥阶段A在冷结条件下，利用减压升华原理将水分去除B可除去85%以上的水分C升华干燥时间与物质品种有关，凡共熔点高的物质升华时间短而易于干燥，共熔点低的物质升华时间要长且不易干燥②解吸干燥阶段A利用加热方式，将剩余水分去除B加热至25~30℃C压强维持25~30Pa4、加塞压盖四、冻干物品的特点1、多孔、疏松的结构物质，加水后能迅速溶解2、在真空冷冻下干燥，对热敏生物活性物质影响很小3、冻干后体积基本保持不变4、因水分去除，微生物处于休眠状态，便于保存和运输第五章灭活剂一、灭活的概念利用某些理化方法来杀死微生物和破坏毒素的生物学活性，使其失去致病性、繁殖力或脱去毒性，但其免疫原性基本保持不变二、灭活的方法1、物理方法：紫外线、射线、温度、超声波等（基本不用）2、化学方法；化学灭活剂（甲醛、结晶紫、乙烯亚胺类衍生物）三、常用化学灭活剂1、甲醛①最古典、应用范围最广的灭活剂②40％甲醛为福尔马林③甲醛遇光后发生聚合，灭活效能会降低④不能用于猪瘟和口蹄疫病毒灭活⑤细菌大都用0.3％甲醛灭活病毒0.05％~0.2％甲醛灭活毒素0.4～0.7％甲醛灭活⑥可用焦亚硫酸钠中和过量甲醛2、结晶紫：猪瘟病毒专用灭活剂3、乙烯亚胺类衍生物①口蹄疫病毒专用灭活剂②常用乙烯亚胺类衍生物：二乙烯亚胺（BEI）、2-乙基乙烯亚胺（EEI）③用量：0.05％（终浓度）④加入硫代硫酸钠中和过量的乙烯亚胺类衍生物4、缩水甘油醛（用于ND灭活优于甲醛）四、影响灭活效果的因素1、被灭活物品的种类与特性（细菌、病毒、外毒素等）2、灭活剂的种类与特性3、灭活剂的含量与浓度，在一定范围内，浓度和含量越高，灭活效果越好4、灭活的温度与时间，在一定范围内，灭活温度越高，时间越长，灭活效果越好，一般情况下，37℃灭活24小时5、有机物存在影响灭活效果：有机物（组织、血清等）存在下，灭活剂需加大用量，延长灭活时间第六章兽医生物制品生产基本技术一、菌毒种的选育与保存（一）菌毒种的分类1、按菌（毒）种的毒力分类：强毒、弱毒菌毒种2、按用途可分为：①生产用菌毒种②检验用菌毒种③工具用菌毒种（二）菌（毒）种的基本要求①具有良好的免疫原性和反应原性②具有可靠的安全性（针对弱毒（菌）种而言）③具有典型的生物学特性④具有遗传稳定性和一致性⑤历史及有关资料清楚完整（三）菌毒种选育1、强毒（菌）毒种：分离、纯化2、弱毒（菌）毒种：①人工致弱：细菌（物理、化学）、病毒（生物方法）②自然筛选（四）菌（毒）种保存①菌（毒）种冻干保存②菌种置于4~8℃保存，毒种置于-15~-20℃保存③标准菌（毒）种由中国兽药监察所保管、分发二、兽医生物制品的生产基本程序和原则（一）细菌性疫苗生产的基本程序与原则1、生产原则：①安全②高效③方便2、细菌性疫苗生产的基本程序 ①菌种②培养基a 、牛肉汤：牛肉（去除脂肪、筋膜），绞碎、加入dH 2O （按1：2（水）比例），煮沸30min ，过滤（4层纱布、滤纸）、补足失水，加入1~2％蛋白胨，0.5％NaCl ，煮溶，用1N NaCl 调PH 值至7.2~7.4，再加入0.1％的磷酸氢二钠，121.3℃（15磅）30min 灭菌 b 、营养牛肉汤：牛肉汤+2％G+2％小牛血清+适量V B 族c 、鲜血琼脂：普通营养琼脂+3~5％脱纤血（兔血）（高温后，温度至45℃）d 、普通营养琼脂：牛肉汤+1％琼脂粉 121.3℃ 30mine 、巧克力琼脂+3~5脱纤血（70~80℃） ③菌种传代第一代：复苏 37℃ 18~24小时第二代：整齐划一 青壮年快速生长期 37℃ 10~12h ④细菌的大量增殖a 、逐级培养：菌种−−→−接种5ml （37℃ 18~24h ）−−→−％5~35ml （37℃ 10~12h ）−−→−％5~3500ml (37℃ 24~30h 灭活苗 10~16h 弱毒苗)b 、培养温度：37℃ 特例：破伤风梭菌34℃ 钩端螺旋体29~30℃c 、气体环境需氧 厌氧 兼性需氧（有氧＞无氧） 兼性厌氧 5、弱毒苗生产37℃培养10~16h 收获，加入冻干保护剂、分装、冻干、加塞压盖、贴标签 6、灭活苗生产37℃ 培养24~30h 收获，加入0.3％甲醛溶液 37℃灭活24h 按4：1比例加入铝胶、摇匀、加塞压盖、贴标签 7、质量检查①安全检查：正常用量的几倍甚至十几倍进行免疫观察②活菌检验：针对灭活菌，将灭活菌接种入牛肉汤或鲜血琼脂检验灭活菌苗有无活菌 ③活菌总数检验（针对弱毒苗）：a 、比浊法b 、平板稀释计数法 ④效力检验：定量免疫、定量攻击 弱毒苗免疫后7天可以攻毒灭活菌免疫后15~20天可以攻毒（二）病毒性疫苗生产的基本原则与程序1、病毒的增殖方法a 、易感动物b 、敏感细胞（例如：猪睾丸细胞、猪肾细胞、犊牛睾丸细胞）c 、敏感禽胚2、以禽胚为例①毒种：a 、毒力与免疫原性成正相关b 、传代（复壮）1~2代 ②病毒的大量增殖a 、接种方法ⓐ绒毛尿囊腔 9~11d ⓑ绒毛尿囊膜 9~11d ⓒ卵黄囊 5~18d ⓓ羊膜腔 9~12d弱毒苗→SPF （种蛋）：没有特定性抗原 灭活苗→非免疫种蛋b 、接种量：鸡胚0.1ml ／枚 鸭胚0.2ml ／枚 鹅胚0.3ml ／枚c 、复壮种毒稀释：1:100~10000NS 稀释（青链，含双抗）d 、弃24h 内死亡胚：①细菌感染②机械损伤e 、收获24~72h 死亡胚的胚液（也可以收获胚体）③培苗：a 弱毒苗：收获病毒液（胚液）加入冻干保护剂、分装、冻干、加塞压盖、贴标签 B 灭活苗：ⓐ收获病毒液加0.05~0.2％甲醛37℃灭活24h ⓑ水相：灭活病毒液150ml+6ml 吐温-80ⓒ油相：320ml10号白矿油+7克硬脂双铝+22~24ml span-80+6ml tween-80 ⓓ油水相配比（油相：水相=7：3或6：4）高速搅拌3min④质量检查：a 安全检查：正常用量几倍甚至十几倍免疫、攻毒 B 效力检查：定量免疫、定量攻击（三）高免蛋黄液、高免血清的生产基本程序1、生产原理：①高免蛋黄液生产原理：Ag 3~5次→产蛋母禽→产生Ab →移行至母禽产下蛋的蛋黄中→提取蛋黄→加入1～2倍生理盐水（含有抗菌药物、防霉剂）②高免血清生产原理：Ag3~5次→动物→产生Ab ，Ab 主要存在于血液的血清中→提取血清→加入抗菌药物、防霉剂2、Ag 的选择：灭活菌和弱毒苗联合使用3、免疫程序的制定：原则：①量由少至多②毒力由弱至强③灭活苗和弱毒苗联合使用④弱−→−天7弱；弱−→−天7灭；灭−−−→−天20~15弱；灭−−−→−天20~15灭；灭+弱−−→−天10灭+弱 4、动物的选择①高免蛋黄液的生产：a 最好SPF ；b 高产蛋禽;c 本体动物;d 青壮年母禽②高免血清生产动物的选择：a 健康动物（观察14天），最好SPF 动物；b 本体动物；c 青壮年动物5、蛋黄的提取6、蛋黄液的制备：提取蛋黄加1~2倍生理盐水（含双抗、防腐剂）防腐剂：0.01％硫柳汞、0.01％叠氮钠 青、链霉素各1000~2000iv ／1ml 7、血清的提取①采取：早上采血、采血前部喂精饲料，喂青饲料，提供充足饮水 ②静脉采血和心脏采血（按一次或多次采血进行选择） 最后一次免疫后，出现抗体比较多时采血 如：弱7~10天；强15~20天；弱+强10天③分离血清：a 自然凝固析出法：置于37℃→4℃（热胀冷缩原理） b 自然凝固离心法3000~5000rpm ，3~5minc 柠檬酸钠血浆血清分离法：提取血浆+30％CaCl 2溶液1.3ml →3000~5000rpm （5min ）→提取上清液（血清)8、高免血清的制备：提取血清加入双抗、防腐剂 9、高免血清、蛋黄液的应用①发病早期应用②免疫一次一般保护7~10天，两次可保护14~20天 ③为了更好吸收，最好多点免疫④置于-15~-20℃保存 ⑤免疫量：0.5~1ml ／kgw （家禽特别） ⑥免疫后一周需要大剂量疫苗进行补免保存：细菌：ⓐ灭活4~8℃、室温ⓑ弱毒4~8℃ 病毒：ⓐ灭活4~8℃、室温ⓑ弱-15~-20℃10、质量检查：①安全检查：几倍甚至十几倍免疫、观察 ②活菌检验：需氧菌：鲜血琼脂、马丁肉汤 厌氧菌：厌氧肉肝汤真菌：沙堡苏化+培养基（沙氏培养基）③效力检查：早期a 发病动物进行治疗；b 免疫后进行攻毒第七章 集中常用兽医生物制品制备与应用实例一、 破伤风明矾沉降类毒素1、菌种：由中国兽药监察所鉴定、保存和供应2、菌种复苏（存代）1~2代，厌气肉肝汤3、毒素的大量生产①培养基：ⓐ牛肉胴水消化液ⓑ黄豆胃蛋白酶水解液ⓒ8％甘油冰醋酸肉汤 ②培养的温度：34~35℃ ③培养时间：4~5天 ④培养环境：厌氧⑤毒素的收获：ⓐ菌液高速离心（3000~5000rpm 30min ）ⓑ取上清液，用滤膜过滤（0.25um ），细菌≥0.45um ，支原体0.25~0.45um ⓒ取过滤液为毒素4、类毒素的制备−−−−−−→−天甲醛溶液37℃7℃％4.0类毒素−−−−−−−−−−→−10ml％10500明矾佐剂类毒素加入按ml 破伤风明矾沉降类毒素5、质量检查：①安全检查：正常用量的几倍甚至几十倍进行免疫，一般用实验动物（300~400g 豚鼠）②效力检验：用300-400克体重豚鼠3只，皮下注射2%破伤风明矾沉降类毒素0.2毫升/只，15-30天皮下注射破伤风标准毒素，每只为300个豚鼠MLD ，另外用未经免疫的豚鼠2只对照，皮下注射1个豚鼠MLD ，对照组4-5天为发病死亡，免疫组10天内全部健活。
