Chapter 3 New Biological Technology and their applicationSection 1: Laser Particle Size AnalyzerPart 1: Basic concept and theory1.两个参数粒径Particle Size: 粒径就是颗粒的直径､大小或尺寸｡当被测颗粒的某种物理特性或物理行为与某一直径的同质球体(或其组合)最相近时, 就把该球体的直径(或其组合)作为被测颗粒的等效粒径(或粒径分布)｡粒度分布Particle distribution: 粒度分布指各种大小的颗粒占颗粒总数的比例, 可用粒度分布表或曲线表示｡2.两个理论Light Scattering: 颗粒尺寸越小, 散射角越大; 颗粒尺寸越大, 散射角越小｡14° → 1μm米氏散射理论Mie Scattering Theory动态光散射原理Dynamic Light Scattering Principle: 波动的散射光可以在频域中产生一个分布, 这个带宽就包含着颗粒运动的信息｡实际上, 该线宽Γ可以求出扩散系数Dr, 从而由扩散系数与粒径之间的关系, 得出颗粒的大小｡Part 2: What is LSA?1.LSA定义激光粒度分析仪以激光为光源, 利用颗粒对光的散射作用, 即大颗粒产生的散射角小, 小颗粒产生的散射角大的原理测量粉体样品的粒度分布｡该仪器使用激光作为光源, 用基于米氏散射理论的软件分析测试数据, 适用于测量固体粉末､液雾和气纳米粒的粒径及其分布｡2.Detection Principle of Laser Particle Size Analyzer光信号→(光电探测阵列器)→电信号→(信号放大, A/D转换)→数据采集PMT: 光电倍增管, 将微弱的光信号转换成电信号, 用于信号的采集和放大｡A/D Converter: 模数转换器, 用于将模拟信号转换为数字信号｡3.自身优势: 价格便宜, 测量速度快, 动态范围大, 操作简便, 重复性好｡Part 3: Medical Application of Laser Particle Size Analyzer粒径测定Measurement of Particle Size粒径及其分布Particle Size and Distribution: 载药微粒的靶向性与其粒径及其分布有关｡Section 2: Laser Confocal Scanning Fluorescence MicroscopePart 1: What is LSFM?1.LSFM定义: 光源, 技术, 结果激光共聚焦显微镜LSFM是以激光为光源, 运用光源针孔和检测针孔的共轭聚焦技术成像, 从而得到高分辨率的光学切片荧光图像的仪器, 应用于观测细胞或组织等生物样本｡2.Principle difference between LSFM and traditional MicroscopeIllumination Difference: 传统显微镜一次性照明整个视野中的样品, 因此可以用眼睛或CCD获取图像, 没有时间延迟; 而共聚焦显微镜是逐点成像, 无法用眼睛或CCD获取图像, 只能用探测器收集每个象素点的信号, 再通过软件重构图像, 有一定的时间延迟｡Part 2: Imaging Principle of LSFM1.Imaging Principle激光器发出的激光束经过扩束透镜和光束整形镜, 变成一束较大的平行光束, 长通分色放射镜使光束偏转90°, 经过物镜会聚在物镜的焦点上, 样品中的荧光物质在激光的激发下发射沿各个方向的荧光, 一部分荧光经过物镜, 长通分色放射镜､聚焦透镜, 会聚在聚焦透镜的焦点处的针孔, 由检测器接受, 通过光电倍增管(PMT)采集和放大信号, 再经过信号处理, 计算机以像点的方式将成像点显示在屏幕上, 由光路中的扫描系统在整样品上扫描, 在显示器上产生一幅完整图像, 这幅图像即为焦平面的共焦图像｡沿Z轴上下移动, 新样品层移到共焦面在显示器上成像, 从而得到三维重组模拟的连续光学切片图像｡优点: 高空间分辨率, 非介入无损伤连续光学切片, 三维图像, 实时动态对细胞结构和功能分析检测｡ser Light:①405nm laser②Ar ion laser (458nm, 488nm, 514nm)③He-Ne green laser (543nm)④He-Ne red laser (633nm)3.Basic Configuration of LSFM①共聚焦扫描及检测装置Confocal scan and detector unit; ②荧光显微镜Microscope; ③激光光源及控制装置Laser and electronic Control Unit; ④计算机Computer; ⑤防震台Anti-vibration table｡4.Different imaging mode明场观察, 暗场观察, 微分干涉差DIC, 浮雕相衬RC, 相衬(相差), 荧光观察, 偏光观察①荧光观察:Light enlarge, high contrast, specific, multi-label, in vivo②微分干涉差DIC: 常与荧光观察连用, 不是共聚焦技术, 但焦点深度很小｡定义: 通过特制的(沃拉斯顿/诺马斯基)棱镜将偏振光分解为相互垂直､强度相等的光束, 光束分别在距离很近的两点上通过标本, 在相位上略有差别｡由于两光束的裂距极小, 而不出现重影现象, 使图像呈现出立体的三维感觉｡Features: 可以使被检物体产生三维立体感觉; 无须特殊物镜, 与荧光观察配合更好; 可以调节背景和物体的颜色变化而达到理想的效果｡Application: 无色透明活体标本的细微结构, 无色荧光标本, 染色标本, 显微操作等｡Part 3: Application of LSFM in Medical Field1.11个领域:细胞生物学; 发育生物学; 生物化学; 药理学; 生理学; 遗传学与胚胎学; 神经生物学; 微生物学与寄生虫学; 病理学; 肿瘤学; 生物学､免疫学与营养学｡2.细胞凋亡Cell apoptosis检测: AnnexinV-FITC和PI染色①早期凋亡—绿色; ②晚期凋亡—绿色和红色; ③坏死—红色3.Ca2+检测Basic Principle:①乙酰羟甲基酯AM形式是Fluo-3AM, 无荧光, 为不带电荷的亲脂性化合物, 易于渗透脂膜进入活细胞内;②在胞内被非特异酯酶水解, 释放出游离酸形式的荧光探针分子, 此游离态也无荧光, 不易漏出胞外;③一旦与Ca2+结合后便形成复合物, 并有较强的荧光产生, 从而发挥其钙探针的作用｡Inflow detection of KCl induced Ca2+Cultured Cell → 20 M Fluo-3AM solution 30-60min → Cleaning, medium changing → ScanningFast Detection: ①改变扫描比例; ②需要二路扫描; ③减少取样点(牺牲空间分辨率); ④需要线扫描｡4.Real time detection of pH changing within a cell荧光探针: BCECF 和6-COFDABCECF的发射光谱取决于pHRatio method: 490nm和440nm的激光均可激发BCECF, 得到的荧光其比值与pH呈线性关系｡最大分辨率: 0.4 pH unit5.Fluorescence Resonance Energy TransferⅠ荧光能量共振转移FRET: 当供体荧光素的荧光光谱与受体荧光素的激发光谱相重叠时, 供体荧光素将其能量向受体荧光素传递, 诱发后者发出荧光, 同时供体荧光素自身的荧光强度衰减, 这一过程称荧光能量共振转移｡ⅡFRET的条件: ①供体与受体间的距离: <7nm; ②供体的发射光谱与受体的吸收光谱有实质性的重叠｡Ⅲ荧光配对FRET probe pairs: ①FITC/TRITC; ②Cy3/Cy5; ③BFP/GFP.检测: 以供体的激发波长的光照射样品, 没有共振转移时, 只检测到供体的荧光, 发生共振转移时, 供体的荧光减弱, 受体被激发出现荧光｡应用: ①受体与配体的相互作用: 亚基的结合与分离; ②大分子构象的改变｡6.Fluorescence Recover after Photobleaching荧光漂白恢复FRAP: 是将待测细胞用荧光物质标记, 借助高强度脉冲式激光照射细胞的某一区域, 从而造成该区域荧光分子的光淬灭; 通过低强度激光扫描成像, 可以探测到该区域周围的非淬灭荧光分子向受照射区域扩散的速率, 可用于测定细胞连接间的信息传递｡从理论上讲, 凡是能够标记待测分子, 并且能够发生荧光淬灭的荧光物质都可以使用｡Part 4: Development trend of LSFMMultiphoton Laser Scanning Microscopy—多光子激光扫描显微镜ComparisonSection 3: Flow CytometryPart 1: Basic concept1.定义流式细胞术FCM是用流式细胞仪测量液相中悬浮细胞或微粒的一种现代分析技术｡μm级, 定量｡结果信息: ①细胞相对大小; ②细胞密度与内部相对复杂性; ③染色细胞的相对荧光强度｡2.三大信号散射光信号Scatter light signal:Scatter Light: 散射光能被用来区分不同细胞群体的基本形态上的差异｡通常使用“散点图”来看散射光信号, 散点图上的一个点就代表一个细胞颗粒的数据｡①前向角散射Forward Scatter (FSC): 入射激光的同向散射光信号→ 细胞相对大小及其表面积前向角散射光: Laser, FALS Sensor②侧向角散射Side Scatter(SSC): 入射激光90 角的散射光信号→ 细胞密度及细胞内相对复杂性侧向角散射光: Laser, 90LS Sensor, FALS SensorReview QuestionDead cells are known to be smaller and to exhibit more internal complexity than live cells. Which of the populations on this plot would you expect to be dead? (Left)③荧光信号Fluorescence signal: → 染色细胞的相对荧光强度(定量)荧光蛋白吸收激发能;使波长更长的光子被释放产生荧光;荧光蛋白与特定抗体结合;荧光抗体结合的细胞抗原越多, 发出的荧光信号越强;得到细胞参数并定量分析｡Fluorescence detector: PMT3, PMT4 etc.Two-Color Cell AnalysisWhich of the three populations has the most Ab-A binding sites? (Lower Right)Part 2: FCM System1.三大系统液流系统Liquid flow system: 聚焦细胞以供检测;光学系统Optical system: 激发和收集光信号;电子系统Electronic system: 将光信号转化为电信号, 并使其数字化以供计算机分析｡2.液流系统Liquid Flow System: 样品流和鞘液流Injector Tip, Sheath fluid, Focused laser beam, Fluorescence signals.3.光学系统Optical System激发光源: 激光; 使激光照向液流的透镜等—633nm氦氖激光/488nm氩离子激光集光系统: 使信号指向合适的光检测器的滤光片荧光探针: ①488nm: PI; PE; FITC; PerCP; PE-CY5, etc. ②633nm: APC; APC-Cy4.滤光片Optical Filters:长通滤片Long Pass Filter, LP: 使波长大于等于设定值的光通过滤光片;短通滤片Short Pass Filter, SP: 使波长小于等于设定值的光通过滤光片;带通滤片Band Pass Filter, BP: 使设定波段的光通过, 500/50 → 500±25｡5.电子系统Electronic System使模拟信号按比例转换为数字信号;计算脉冲幅度;计算脉冲宽度与面积;与计算机接口进行数据传递｡6.结果形式①直方图Distribution Histogram横坐标代表荧光信号或散射光信号相对强度, 单位是道数, 可以是线性或对数坐标; 纵坐标一般是细胞数｡②散点图Dot PlotX坐标为该细胞一参数相对含量, Y坐标为该细胞另一参数的含量, 可以将细胞亚群分开｡③等高线图和密度图Contour and density map④三维图Three dimensional graphPart 3: Application of FCM细胞结构: 细胞大小; 细胞粒度; 细胞表面面积; 核浆比例; DNA含量与细胞周期; RNA含量; 蛋白质含量｡细胞功能: 细胞表面/胞浆/核的特异性抗原; 细胞活性; 胞内细胞因子; 酶活性; 激素结合位点; 细胞受体｡1.细胞凋亡研究①鉴别凋亡与坏死: Annexin V/PI②测定凋亡率: Annexin V､Apo 2·7､TUNEL③研究凋亡触发机制: Caspase､Fas and FasL, bcl-2/bax3.1 Cell Period Analysis (DNA含量)①大鼠生精细胞分析—PI单染;②正常人骨髓细胞DNA分析(ModiFIT);③多发性骨髓瘤｡3.2 淋巴细胞双色分析LeucoGATE: Back-Gating, 准确圈定淋巴细胞门, 并评估门的有效性｡①肿瘤细胞分选; ②特异性T淋巴细胞分选; ③白血病细胞分选｡Chapter 4 Green Fluorescent ProteinPart 1: GPF的发现下村脩等人在1962年发现, 在蓝色波长范围的光线激发下, 会发出绿色荧光｡绿色荧光蛋白Green Fluorescence Protein, GFP: 从水母体内发现的发光蛋白, 分子质量为26kDa, 由238个氨基酸构成, 第65~67位氨基酸(Ser-Tyr-Gly)形成发光团, 是主要发光的位置｡其发光团的形成不具物种专一性, 发出荧光稳定, 且不需依赖任何辅因子或其他基质而发光｡GFP的形状呈圆柱形, 就像一个桶, 负责发光的基团位于桶中央, 装在“桶”中的发光基团对蓝色光照特别敏感, 当它受到蓝光照射时, 会吸收蓝光的部分能量, 然后发射出绿色的荧光｡Part 2: GPF的性质1.荧光性质稳定①GFP荧光极其稳定, 在激发光照射下, GFP抗光漂白(Photobleaching)能力强, 特别在450~490nm蓝光波长下更稳定｡②GFP需要在氧化状态下产生荧光, 强还原剂会使GFP转变为非荧光形式, 但一旦重新暴露在空气或氧气中, GFP荧光便立即得到恢复, 弱还原剂和中度氧化剂并不影响GFP荧光｡2.灵敏度高GFP融合蛋白的荧光灵敏度远比荧光素标记的荧光抗体高, 抗光漂白能力强, 更适用于定量测定与分析, 但GFP不是酶, 荧光信号没有酶学放大效果, 因此灵敏度可能低于某些酶类报告蛋白｡3.分子量小, 对细胞无毒性相对分子质量仅为27000; 无毒, 而传统的荧光分子具有“光毒性”; 可连续传代培养｡4.突变蛋白可显著改善荧光特性用PCR和羟胺突变的方法, 可以得到发不同荧光的突变型GFP , 可方便地对不同的蛋白进行双标记, 75%的突变都发生在中心α-螺旋以及β-折叠7､8､10处｡Part 3: GPF的应用荧光蛋白的应用:①细胞分裂和骨架; ②细胞器动力学和泡囊运输; ③发育生物学; ④分子标记; ⑤药物筛选; ⑥光伏发电｡蛋白质标签Protein Tagging: 即利用DNA重组技术, 转染合适的细胞进行表达, 然后借助荧光显微镜便可对标记的蛋白质进行观察｡Chapter 5 NanobiotechnologyPart 1 Nano-Bio-medical Materials and its Progress1.What Is A Nanometer: Nanoscale = 10-9Size Scale Comparison: Nanosphere Diameter = 400 nm; Aggregated Colloids Diameter = 100 nm;Single Gold Colloid Diameter = 13 nm; Gold Atom Diameter = 0.32 nmStructural differences: Bulk Carbon: Graphite, Diamond; Nanoscale Carbon: C60 (Buckeyball), Carbon Nanotubes.2.Development History of Nanomaterials: 久保理论The Lycurgus Cup: When illuminated from outside, it appears green. However, when illuminated from within the cup, it glows red. The red color is due to tiny gold particles embedded in the glass, which have an absorption peak at around 520 nmDevelopment of Tools: 应用: 表面探测; 观测原子; 仪器/影像扫描隧道显微镜STM (Scanning Tunneling Microscopy);原子力显微AFM (Atomic Force Microscopy);透射电子显微镜TEM (Transmission Electron Microscopy);3.Classification of NanomaterialsBased on Structure①零维纳米材料: 量子点纳米粒子;②一维纳米材料: 如纳米线(量子线)､纳米管;③二维纳米材料: 纳米薄层板;④纳米孔材料: 介孔分子筛(应用于分离材料)｡Based on Composition①金属纳米材料､半导体纳米材料､有机和高分子纳米材料､复合纳米材料;②复合纳米材料(两种或两种以上材料复合): 无机纳米粒子与有机高分子复合材料; 无机半导体的核壳结构; 量子阱(超晶格)材料｡4.Properties of NanomaterialsA.小尺寸效应当粒子尺寸与光的波长､单磁筹临界尺寸､超导态的相干长度等物理特征尺寸相当或更小时, 使光学､电学､力学等特性呈现新的特殊物理性质, 称为小尺寸效应｡①光吸收显著增加, 并产生吸收峰的等离子共振频移; ②磁有序态向磁无序态过渡; ③超导相向正常相转变; ④纳米粒子熔点的改变: 金熔点1337K, 2nm粒子为600K｡B.表面效应随着颗粒直径的变小, 比表面积将会显著地增加, 颗粒表面原子数相对增多, 从而使这些表面原子具有很高的活性且极不稳定, 致使颗粒表现出不一样的特性, 这就是表面效应｡C.库仑阻塞和量子隧道效应: 一种纳米材料上的单个电子发生隧穿, 跨越到另一个材料上去｡条件: ①低温; ②尺寸足够小｡D.介电限域效应: ①纳米微粒分散在异质介质中由于界面引起的体系介电增强的现象; ②介电限域对光吸收､光化学､光学非线性等性质都有影响｡5.Preparation of NanomaterialsA.CVD—Vapor Deposition根据过程的性质分为PVD 和CVD:CVD: 利用气态或蒸汽态的物质在气相或气固界面上反应生成固态沉积物的技术, 被广泛应用于半导体和集成电路技术｡①CVD是目前超纯多晶硅的唯一生产方法; ②化合物半导体的制备, 比如III-V族半导体; ③各种搀杂半导体薄膜的生长, 以及绝缘薄膜的生长B.Hydrothermal Solvothermal Synthesis: 较高温度和较高压力下溶液中的化学合成｡水相, Green synthesis, 高温高压, 不用于生产, 主要用于实验室水热合成量子点水热法最初是为了模拟地矿生成条件, 广泛用于分子筛合成, 晶体生长等, 近年被用于纳米材料的制备｡特征: 体系一般处于非理想､非平衡状态; 溶剂处于接近临界､临界或超临界状态Advantages:①反应物活性改变和提高, 有可能代替固相反应, 并可制备出固相反应难以制备出的材料;②中间态､介稳态以及特殊相易于生成, 能合成介稳态或者其他特殊凝聚态的化合物､新化合物和熔点低､蒸气压高､高温分解的物质;④低温､等压､溶液条件, 有利于生长缺陷少､取向好､完美的晶体, 并且产物晶体的粒度可控;⑤由于环境气氛可调, 因而可合成低价态､中间价态与特殊价态化合物的生成, 并能进行均匀搀杂｡C.Sol-gel Method—经过两相: 溶胶相, 凝胶相; 最重要反应: 水解｡采用无机盐或金属有机化合物, 如醇盐为前驱物, 前驱物在水中水解(或者在其他溶剂中溶剂解), 反应生成物聚集形成溶胶, 然后经蒸发干燥从溶胶转变为凝胶｡典型的软化学合成｡D.Micro-reactor: 表面活性剂-油-水三相通过三元溶剂相, 得到一个反应腔, 胶团囊泡: 单室, 多室, 得到的产物形状如同囊室的形状｡E.Template-directed Synthesis of nanomaterialsAAO模板, 六方液晶模板,6.Applications: 遮光剂; 诊断学; 汽车尾气转换器; 自净窗户｡Application 1: 纳米球刻蚀技术Application 2: 记忆金属—镍钛合金: 眼镜框, 牙套, 血管内支架, 艺术｡Application 3: Chemistry Issues: 结构, 动力学, 合成; 构效关系; 自组装系统Applications: Materials, Biological, Environmental.化学键合—Forces used to assemble structure:离子键/静电效应—药物控释; 金属键; 共价键– Carbon; 氢键; π-π重叠—液晶Application3.1 Quantum Dots: 带隙取决于颗粒大小(颗粒所含原子数)表面上修饰各种多功能的分子Preparation Targeting ResonanceToxicity: 活性氧促效应; 重金属; 硅Future: All-in-one—造影, 诊断, 治疗Part 2: Nano-gold1.What Are Gold Nanoparticles?①金纳米粒以直径为100 nm的金原子簇的形式出现｡②金纳米粒子小到足以散射可见光, 使其有特殊的可视性质｡③金纳米粒在溶液中显深红色至黑色—颜色取决于颗粒大小｡④颗粒间距同样影响颜色—表面等离子体共振SPR→散射1.1.Synthesis of gold nanorods:晶核生长法Seed-mediated methodTwo steps: 产生晶核→ 晶核生长成棒状｡Factors: ①晶种尺寸; ②溴化十六烷基三甲铵CTAB的长度→ 在表面, 用于稳定金纳米材料｡Synthesis of gold nanorods Growth mechanism of gold nanorods带正电的溴化十六烷基三甲胺双分子层用于稳定纳米棒1.2.Synthesis of gold nanoparticles of different shapes①总体思路与金纳米棒的生成相同—晶核生长法;②对晶核生长条件进行微调—改变反应物浓度;③立方体, 六边形, 三角形, 四角形, 分支状｡Summary of experimental procedure:①各反应物浓度是相互作用的, 改变任何一个浓度都会影响晶核生长; ②生长机制与金纳米棒相同｡Advantage of water seed-mediated method①高产率; ②单分散性; ③简单便宜｡Optical Property of Au Nanoparticle:吸光系数, 金纳米粒在水溶液中稀液悬浮金纳米粒子可用吸收光谱表征, 特征吸收: 520nm; 修饰使吸收明显改变: 红移至700~900nm｡2.Biomedical Application2.1.分子信标—表面功能化:Making Gold Nanoparticles: AuCl4- salts are reduced using NaBH4 in the presence of thiol capping ligands将一端修饰有巯基另一端修饰有荧光基团的分子信标通过Au-S键连接到金纳米粒子核心上, 利用金纳米粒子具有较高的荧光猝灭效率, 使分子信标不能发出荧光｡分子信标的金纳米粒子核心<1~8nm通过选择不同结构的末端巯基有机分子来控制表面功能; 荧光基团或药物在细胞内选择性的解离｡2.2.纳米子弹Also called thermal scalpels: 尤其适用于嵌在大脑等重要组织器官中的小型肿瘤①可以识别病灶的靶头: 硅纳米壳上包裹的金纳米粒子可以使之与肿瘤细胞结合;②可以通过吸收对健康组织无害的近红外激光, 将光能转化为热量从而升温, 当温度超过病灶承受程度时, 可以破坏与之结合的肿瘤细胞杀灭病灶｡2.3.Drug Smugglers使表面结合了抗肿瘤药物紫杉醇的金纳米粒子进入肿瘤细胞内并与其内部结构相结合｡尺寸: 太大→被RES清除; 太小→携带的药物不够｡。
