扫描电镜样品制备课件
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实验十一扫描电镜样品制备
注入液体二氧化碳 依次打 开二氧化碳钢瓶排气阀和 仪器的进气阀在0～10℃ 下，向样品杯注入液体二 氧化碳。
1
2
装样： 将样品从醋酸异戊酯中 挑入(或倒入)样品笼中，用滤纸 吸去样品笼外围的醋酸异戊酯， 然后连笼移入仪器的样品杯(高 压容器)内，盖上盖并拧紧以防 漏气。(注：在装样前，应先打 开仪器电源，将温度调节设定在 0℃处预冷10～15min，以保证 液态二氧化碳有足够量进入样品 杯中)。
3
4
当液体二氧化碳充至样品杯容积的 50％(通过刻度尺观察，以液面超过 样品笼为度)时，关闭仪器进气阀， 静置15～20min，让醋酸异戊酯向 液态二氧化碳中充分扩散，然后， 打开仪器排气流量计阀门和进气阀 门，让其边排气边充液10min左右， (让含有醋酸异戊酯的二氧化碳排出 和充入新鲜的液态二氧化碳)再关闭 排气阀；继续充入液体二氧化碳至 样品杯的80％左右，关闭进液阀， 停止充液。
置换乙醇
吸出乙醇，加入醋酸 异戊酯与乙醇Байду номын сангаас：1的 混合液，浸泡10-20分 钟并适当摇动，再吸 弃混合液，加入纯醋 酸异戊酯浸泡10-20分 钟并适当摇动。
样品的干燥
常规临界点干燥法。
临界点干燥法
临界点干燥法是一种消除 了物相界面(液相／气相)， 也就是消除了表面张力来 源的干燥方法。这种方法 由于没有表面张力的影响， 所以样品不易收缩和损伤。 具体处理步骤如下：
三、扫描电镜样品的制备
1
取样：
2
样品的清洁：
将取下的动植物组织放入预
把载玻片上切好的样品快，
冷的含有2％戊二醛溶液的
用牙签轻轻地逐个拨入盛有
载玻片上，用刀片将组织块
0.1mol/L PH7.2磷酸缓冲
扫描电镜样品制备显微镜课件
电子显微镜
电子显微镜可以用于对制备好的样品进行高倍率观察和分析 。通过电子显微镜可以更加清晰地看到样品表面的微观结构 ，并且可以对不同区域进行成分分析和晶体结构分析等。
02
扫描电镜原理与操作
工作原理简述
电子光学系统
利用电子枪发射的电子束，经过 电磁透镜聚焦后，扫描样品表面 并接收散射电子，形成放大的图
指导学生记录实验数据，包括样品的形貌、结构等信息，并进行分析 和讨论。
实验结果讨论与分享
实验结果展示
要求学生将实验结果进 行展示，包括样品的形 貌、结构等信息，以便 其他同学互相学习和交 流。
问题讨论与解答
针对学生在实验过程中 遇到的问题进行讨论和 解答，加深学生对实验 原理和方法的理解和掌 握。
电化学抛光
通过电解抛光液去除金属 表面的微观不平整和氧化 物，获得镜面效果。
非金属样品处理方法
清洗
使用去离子水、乙醇或其他溶剂 清洗非金属样品表面，去除污渍
和油脂。
干燥
采用自然干燥、热风干燥或冷冻 干燥等方法，确保非金属样品表
面干燥无水分。
镀导电层
对非导电性非金属样品表面镀导 电层，提高扫描电镜成像质量。
元素分析
通过电子显微镜配备的能谱仪，对样品进行元素成分分析。
晶体结构鉴定
利用电子衍射技术，鉴定样品的晶体结构和相组成。
原子力显微镜辅助操作技术
纳米级操作
利用原子力显微镜的纳米级操作能力，对样品进行精确制备。
力学性能测试
通过原子力显微镜的力学测试功能，研究样品的力学性能。
表面形貌表征
利用原子力显微镜观察样品的表面形貌和粗糙度。
开机校准
启动扫描电镜系统，进行光路 校准和像散校正，确保图像质 量。
电子显微镜可以用于对制备好的样品进行高倍率观察和分析 。通过电子显微镜可以更加清晰地看到样品表面的微观结构 ，并且可以对不同区域进行成分分析和晶体结构分析等。
02
扫描电镜原理与操作
工作原理简述
电子光学系统
利用电子枪发射的电子束，经过 电磁透镜聚焦后，扫描样品表面 并接收散射电子，形成放大的图
指导学生记录实验数据，包括样品的形貌、结构等信息，并进行分析 和讨论。
实验结果讨论与分享
实验结果展示
要求学生将实验结果进 行展示，包括样品的形 貌、结构等信息，以便 其他同学互相学习和交 流。
问题讨论与解答
针对学生在实验过程中 遇到的问题进行讨论和 解答，加深学生对实验 原理和方法的理解和掌 握。
电化学抛光
通过电解抛光液去除金属 表面的微观不平整和氧化 物，获得镜面效果。
非金属样品处理方法
清洗
使用去离子水、乙醇或其他溶剂 清洗非金属样品表面，去除污渍
和油脂。
干燥
采用自然干燥、热风干燥或冷冻 干燥等方法，确保非金属样品表
面干燥无水分。
镀导电层
对非导电性非金属样品表面镀导 电层，提高扫描电镜成像质量。
元素分析
通过电子显微镜配备的能谱仪，对样品进行元素成分分析。
晶体结构鉴定
利用电子衍射技术，鉴定样品的晶体结构和相组成。
原子力显微镜辅助操作技术
纳米级操作
利用原子力显微镜的纳米级操作能力，对样品进行精确制备。
力学性能测试
通过原子力显微镜的力学测试功能，研究样品的力学性能。
表面形貌表征
利用原子力显微镜观察样品的表面形貌和粗糙度。
开机校准
启动扫描电镜系统，进行光路 校准和像散校正，确保图像质 量。
扫描电镜生物样品制备技术PPT课件
材 料 学 土 聚 水 泥
制备扫描电镜样品的总要求
在不损伤样品原始结构状态 的情况下，保证样品的体积和表 面积不发生改变，充分暴露样品 表面的微细结构 。
生物样品的特性
含水量高 质地柔软 导电性差 二次电子产率低 对热、电子束等敏感
扫描电镜生物样品要求：
不含水份 具有较高的二次电子发射率 良好的导电性 耐热性 最大限度的保持样品的形貌
成功的基础在于好的学习习惯
The foundation of success lies in good habits
58
谢谢大家
荣幸这一路，与你同行
It'S An Honor To Walk With You All The Way
讲师：XXXXXX XX年XX月XX日
C
SEM觀察泡桐根瘤線蟲微細構造
SEM觀察A. scrobiculata 孢子之外觀形態 (橫線=60mm)
SEM觀察G. mosseae
丛枝菌根真菌
孢子之外觀形態 (橫線=100mm)
未接種菌根菌草海桐苗木之根部微細構造 (A：橫線=300mm；B：橫線=12mm)
接種菌根菌及2%鹽分處理草海桐苗木之根部微細構造 (A：橫線=30mm；B：橫線=12mm)
T R
R T
T. harzianum (T)寄生在立枯絲核菌(R)菌株上的情形
松材線蟲(雄)
松材線蟲(雌)
松材線蟲頭部口針
白粉病分生孢子 麻竹墊銹菌孢子
第二节 扫描电镜特殊样品制备技术
特殊生物样品制备主要有： （1）管道铸型样品 （2）冷冻断裂样品 （3）游离细胞样品 （4）组织消化样品
1. 管道铸型样品
心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的semsem心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的featuressemfeaturessem心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的featuressemfeaturessem心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的featuressemfeaturessem心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的featuressemfeaturessem生物医学动物材料化学物理地质冶金矿物污泥杆菌机械电机及导电性样品如半导体电子材料等心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的1010心脑血管病是世界卫生组织总干事讲过只要采取预防措施就能减少一半的死亡也就是说一半的死亡完全是可以预防的目的
电镜样品的制备最新课件
电镜样品的制备最新
取材 2.清洗液的类型与选择：蒸馏水、生理盐水、加酶清洗液等
清洗 ➢ 选择原则：清洗液的pH值、渗透压、温度应该尽量接 近样品材料的生理值，以免样品因环境突变而产生形变。
固定 ➢ 选择方法：
脱水 ✓植物材料：蒸馏水洗净尘埃；
✓动物材料：等渗生理盐水、5%碳酸钠或缓冲液洗去黏液等；
第一节 扫描电镜样品的常规制备技术
菌类和组培细胞
粘样或滴样
熏蒸固定
干燥
取清 材洗
冷冻
断裂
固 清洗 脱 定水
干 粘镀镜 燥 样膜检
管道铸型
花粉、种子及孢子类样品
电镜样品的制备最新
腔形器 官
取材 一、取材 即：获取观察材料。
遵循五字原则：准、轻、小、净、浓
清洗
1.迅速准确：取材动作要快，部位要准确。
固定
取材 三、固定方法
清洗 1.单固定：只用一种固定剂（通常戊二醛）固定的方法。
固定
2.熏蒸固定：固体培养基培养的菌丝类样品。用锇酸蒸汽 熏蒸固定0.5~1小时。
脱水 3.双固定： 戊二醛(1~3h)—锇酸(0.5~1h)
干燥 4.冷冻固定：液氮超低温快速冷冻可保存样品的生活状态。
粘样 5.不固定：干种子、花粉、孢子类样品。
霉菌 切割菌落
戊二醛固定
常规固定 脱水干燥 粘样镀膜
常规脱水干燥
杆菌10μm
球菌电10镜μ样m品的制备最酵新母菌5 μm
曲霉20 μm
电镜样品的制备最新
第二节 特殊要求的扫描制样技术
——组织细胞的内部结构观察法
内部结构剖出法
切断法：多孔组织 简易剖出法 掰开法：实质性组织
拉断法：纤维组织
取材 2.清洗液的类型与选择：蒸馏水、生理盐水、加酶清洗液等
清洗 ➢ 选择原则：清洗液的pH值、渗透压、温度应该尽量接 近样品材料的生理值，以免样品因环境突变而产生形变。
固定 ➢ 选择方法：
脱水 ✓植物材料：蒸馏水洗净尘埃；
✓动物材料：等渗生理盐水、5%碳酸钠或缓冲液洗去黏液等；
第一节 扫描电镜样品的常规制备技术
菌类和组培细胞
粘样或滴样
熏蒸固定
干燥
取清 材洗
冷冻
断裂
固 清洗 脱 定水
干 粘镀镜 燥 样膜检
管道铸型
花粉、种子及孢子类样品
电镜样品的制备最新
腔形器 官
取材 一、取材 即：获取观察材料。
遵循五字原则：准、轻、小、净、浓
清洗
1.迅速准确：取材动作要快，部位要准确。
固定
取材 三、固定方法
清洗 1.单固定：只用一种固定剂（通常戊二醛）固定的方法。
固定
2.熏蒸固定：固体培养基培养的菌丝类样品。用锇酸蒸汽 熏蒸固定0.5~1小时。
脱水 3.双固定： 戊二醛(1~3h)—锇酸(0.5~1h)
干燥 4.冷冻固定：液氮超低温快速冷冻可保存样品的生活状态。
粘样 5.不固定：干种子、花粉、孢子类样品。
霉菌 切割菌落
戊二醛固定
常规固定 脱水干燥 粘样镀膜
常规脱水干燥
杆菌10μm
球菌电10镜μ样m品的制备最酵新母菌5 μm
曲霉20 μm
电镜样品的制备最新
第二节 特殊要求的扫描制样技术
——组织细胞的内部结构观察法
内部结构剖出法
切断法：多孔组织 简易剖出法 掰开法：实质性组织
拉断法：纤维组织
扫描电子显微镜的样品制备技术PPT课件
26.5
氟利昂13 28.9
临界压力（kg/cm2） 71.2
38.2
标准大气压下
氟利昂23 25.9 47.7
液态二氧化 碳、
31.1
72.8
第12页/共60页
临界点干燥法原理
• 在干燥过程中，表面张力会使样品变形。因此，为了保持 样品的完好形态，必须消除表面张力造成的影响。我们知 道，液体表面张力随其温度的升高而急骤变小。对于每一 种液体，都有一个表面张力为零的温度，这个温度叫临界 温度。与临界温度对应的压力叫临界压力，在临界温度和 临界压力下使样品干燥的方法叫临界点干燥法。现在，国 内外都有商品临界点干燥仪。
• 脱水处理：对保证金属镀膜装置和电镜的镜筒真空度和
防止样品在高真空状态下的龟裂和变形等有重要的作用。
采用不同浓度的乙醇或丙酮梯度脱水逐步的除去样品中
的水分。
第8页/共60页
6.2.2 样品的干 燥：
• 1. 自然干燥法：把样品暴露在空气中直接干燥，只适用于 表面比较坚硬或含水分较少的生物样品。如：昆虫、骨骼、 牙齿、毛发、种子、果壳、花粉、植物标本，以及微小材 料如细菌等。具体做法是：先将样品固定，并系列脱水到 100％，在大气中让脱水剂自然挥发即可，但注意环境要 干燥。因为脱水剂的表面张力系数比水小所以样品在脱水 剂中不会过多变形而影响其结构。
第3页/共60页
6.1.3粉体试样的制 备
• 粉体可以直接撒在样品座的双面碳导电胶上， 用平的表面物体，例如玻璃板压紧，然后用 洗耳球吹去粘结不牢固的颗粒。
• 对细颗粒的粉体分析时，特别是形貌观察时， 将粉体用酒精或水在超声波清洗机内分散， 再用滴管把均匀混合的粉体滴在样品座上， 待液体烘干或自然干燥后，粉体靠表面吸附 力即可粘附在样品座上。
氟利昂13 28.9
临界压力（kg/cm2） 71.2
38.2
标准大气压下
氟利昂23 25.9 47.7
液态二氧化 碳、
31.1
72.8
第12页/共60页
临界点干燥法原理
• 在干燥过程中，表面张力会使样品变形。因此，为了保持 样品的完好形态，必须消除表面张力造成的影响。我们知 道，液体表面张力随其温度的升高而急骤变小。对于每一 种液体，都有一个表面张力为零的温度，这个温度叫临界 温度。与临界温度对应的压力叫临界压力，在临界温度和 临界压力下使样品干燥的方法叫临界点干燥法。现在，国 内外都有商品临界点干燥仪。
• 脱水处理：对保证金属镀膜装置和电镜的镜筒真空度和
防止样品在高真空状态下的龟裂和变形等有重要的作用。
采用不同浓度的乙醇或丙酮梯度脱水逐步的除去样品中
的水分。
第8页/共60页
6.2.2 样品的干 燥：
• 1. 自然干燥法：把样品暴露在空气中直接干燥，只适用于 表面比较坚硬或含水分较少的生物样品。如：昆虫、骨骼、 牙齿、毛发、种子、果壳、花粉、植物标本，以及微小材 料如细菌等。具体做法是：先将样品固定，并系列脱水到 100％，在大气中让脱水剂自然挥发即可，但注意环境要 干燥。因为脱水剂的表面张力系数比水小所以样品在脱水 剂中不会过多变形而影响其结构。
第3页/共60页
6.1.3粉体试样的制 备
• 粉体可以直接撒在样品座的双面碳导电胶上， 用平的表面物体，例如玻璃板压紧，然后用 洗耳球吹去粘结不牢固的颗粒。
• 对细颗粒的粉体分析时，特别是形貌观察时， 将粉体用酒精或水在超声波清洗机内分散， 再用滴管把均匀混合的粉体滴在样品座上， 待液体烘干或自然干燥后，粉体靠表面吸附 力即可粘附在样品座上。
sem扫描电镜ppt课件
II. 背散射电子成像：入射电子与样品接触时，其中一部分几乎 不损失能量地在样品表面被弹性散射回来，这部分电子被称 为背散射电子。背散射电子的产额随样品的原子序数的增大 而增加，因此成像可以反映样品 的元素分布，及不同相成分 区域的轮廓。
ppt课件
18
二次电子像的信号是二次电子，用于表面形貌分析；背散射电子 像的信号是背散射电子，用于成分分析。因此二次电子像对形貌 敏感，背散射电子像对成分敏感。
ppt课件
5
图2 JSM-6301F场发射扫描电镜的结构
ppt课件
6
电子光学系统
组成：电子枪、电磁透镜、扫描线圈和样品室等部 件。
作用：获得扫描电子束、作为产生物理信号的激发 源。
为了获得较高的信号强度和图像分辨率，扫描电子 束应具有较高的亮度和尽可能小的束斑直径。
ppt课件
7
电子枪
✓ 利用阴极与阳极灯丝间的高压产生高能量的电子束。目前大 多数扫描电镜采用热阴极电子枪。优点：灯丝价格便宜，真 空要求不高；缺点：发射效率低，发射源直径大，分辨率低。
ppt课件
1
主要内容
SEM的工作原理 SEM的主要结构 SEM的组成部分 SEM的主要性能参数 SEM的优点 应用举例
ppt课件
2
SEM的工作原理
电子枪发射电子束（直径50μm）。电压加速、磁透镜系统汇 聚，形成直径约5nm的电子束。
电子束在偏转线圈的作用下，在样品表面作光栅状扫描，激发 多种电子信号。
ppt课件
15
SEM的主要性能参数
分辨率 放大倍数 景深
ppt课件
16
分辨率
对微区成分分析而言，分辨率是指能分析的最小区域；对成像 而言，它是指能分辨两点间的最小距离。
ppt课件
18
二次电子像的信号是二次电子，用于表面形貌分析；背散射电子 像的信号是背散射电子，用于成分分析。因此二次电子像对形貌 敏感，背散射电子像对成分敏感。
ppt课件
5
图2 JSM-6301F场发射扫描电镜的结构
ppt课件
6
电子光学系统
组成：电子枪、电磁透镜、扫描线圈和样品室等部 件。
作用：获得扫描电子束、作为产生物理信号的激发 源。
为了获得较高的信号强度和图像分辨率，扫描电子 束应具有较高的亮度和尽可能小的束斑直径。
ppt课件
7
电子枪
✓ 利用阴极与阳极灯丝间的高压产生高能量的电子束。目前大 多数扫描电镜采用热阴极电子枪。优点：灯丝价格便宜，真 空要求不高；缺点：发射效率低，发射源直径大，分辨率低。
ppt课件
1
主要内容
SEM的工作原理 SEM的主要结构 SEM的组成部分 SEM的主要性能参数 SEM的优点 应用举例
ppt课件
2
SEM的工作原理
电子枪发射电子束（直径50μm）。电压加速、磁透镜系统汇 聚，形成直径约5nm的电子束。
电子束在偏转线圈的作用下，在样品表面作光栅状扫描，激发 多种电子信号。
ppt课件
15
SEM的主要性能参数
分辨率 放大倍数 景深
ppt课件
16
分辨率
对微区成分分析而言，分辨率是指能分析的最小区域；对成像 而言，它是指能分辨两点间的最小距离。
负染技术、扫描电镜样品制备技术 ppt课件
二甲基亚砜(DMSO)割断法 环氧树脂割断法
2.冷冻割断的操作
TF-1冷冻割断仪
简易割断器
注入液氮
固化包埋
割断
溶化冲洗
PPT课件
7
PPT课件
8
3.标本制作法
取 材 (1×1×5mm) 、 前 固 定 (1%OsO4 ， 4oC 1h) 浸 洗 (0.1M PBS ， 10min×3次 )
DMSO浸泡(12.5%、25%、50%各30min)
4.乙腈干燥法
标本预处理
50%、70%、80%、90%、100%乙腈溶液各20min (用乙醇配制)
立即置入真空，乙腈及样品冻结、升华
PPT课件
11
5.临界点干燥法 干燥效果最好，应用最广泛 ⑴原理
物质三相(固、液、气)相互转化，可单相存在，也 可复相存在。
临界状态：物质在特定温度(临界温度)时，表面 张力系数为零，物质不以液态存在，变成气体。
3.导电染色法/组织导电技术(TOT)
利用金属盐(碘化甲、单宁酸)对生物体蛋白质、脂肪
的结合作用
PPT课件
17
扫描电镜生物样品制备的基本程序
PPT课件
18
1.金属喷镀法 在真空喷镀仪内将金属加热、蒸发、喷镀到样品表面(100-
200Å) 金属的选择：颗粒大小不超过SEM分辨率(≤100Å)； 熔点低、易蒸发； 机械稳定性能好； 是好的二次电子发射体 金 铂 金/铂合金
PPT课件
15
PPT课件
16
2.离子溅射法/离子镀膜法
优点：①热辐射小 ②颗粒细、喷溅均匀 ③金属消耗少
无法避免表面张力的影响，仅用于含水较少的样品 2.冷冻干燥法
样品以液氮快速冷冻 移至真空 冰升华为汽 费时 低温损伤
扫描电镜课件
FEI公司 Quanta 200 Quanta 200FEG Quanta 400 Quanta 400FEG Quanta 400HV Quanta 600 Quanta 600FEG Quanta 200HV Sirion 200 Sirion 400 Sirion NC
HITACHI公司 X-450 X-570 X-650 S-2380
扫描电镜的构造
扫描电镜由六个系统组成
(1) 电子光学系统（镜筒） (2) 扫描系统 (3) 信号收集系统 (4) 图像显示和记录系统 (5) 真空系统 (6) 电源系统
(1)电子光学系统（镜筒）
由电子枪、聚光镜、物镜和样品室等部件组成。 它的作用是将来自电子枪的电子束聚焦成亮度高、直 径小的入射束(直径一般为10nm或更小)来轰击样品， 使样品产生各种物理信号。
扫描电镜 SEM
SEM的特点
扫描电子显微镜利用细聚焦电子束在样品表面逐点扫描， 与样品相互作用产行各种物理信号，这些信号经检测器接收、 放大并转换成调制信号，最后在荧光屏上显示反映样品表面 各种特征的图像。
扫描电镜具有景深大、图像立体感强、放大倍数范围大、 连续可调、分辨率高、样品室空间大且样品制备简单等特点， 是进行样品表面研究的有效分析工具。 扫描电镜所需的加速电压比透射电镜要低得多，一般约 在 1～50kV，实验时可根据被分析样品的性质适当地选择， 最常用的加速电压约在 20kV 左右。
扫描电镜
SEM主要生产厂家及性能
目前扫描电镜已在各方面得到广泛应用，包括材 料科学、地质、化工、生物和医学等。世界各国有 不少工厂能生产电镜，例如英国剑桥科学仪器公司 （CamScan 系列）、美国(FEI) Philips公司、日本 的HITACHI和JEOL公司等都不断推出各种型号的扫描 电镜。联邦德国Opton公司率先在国际市场上提供了 第一台完全数字式的扫描电镜——DSM 950。此外， 美国、捷克等国也都生产扫描电镜。我国也已有生 产扫描电镜的多年历史。
SEM样品制备(共17张PPT)
• 对导电性差的样品镀膜
对使用加速电压的控制。
胶面贴实； 大小与厚度要适于样品台的安装
可以观察喷金和喷碳样品，喷碳样品更适合于能谱分析。 （1）真空镀膜：将金属丝或碳棒在高真空下通过大电流加热蒸发，沉积在样品表面。 喷镀与否主要根据样品观察区域和观察目地而有所区别。
• * 用吸耳球从不同方向吹拂粉料，使粉
1. 块样
• 对于金属、岩矿或无机物，切割成要求的尺寸，粘在 样品台上。如果样品数量多，注意样品尺寸最好一致。
• 微区成分分析样品表面应该平坦或经研磨抛光， 可以保证检测时几何条件不变。对于样品的断口 面，要选择起伏不大的部位，最好是分析点附近 有小的平坦区。样品表面和底面应该平行。
样品
树脂 塑料管
● 安装不导电样品可用普通双面胶，并在表 面粘一条胶带与金属样品台连通，以备镀 膜时形成导电通路。
● 样品即使导电，也必须与样品台粘牢，若 没接触好，会产生样品充电现象，图像不 稳定，而且收集能谱也受影响。
4. 对导电性差的样品镀膜
● 若样品不导电，则应决定是否要对样品进行喷镀。喷镀与 否主要根据样品观察区域和观察目地而有所区别。因为不 导电的样品在扫描电镜下观察时，会产生电荷积累而影响 观察稳定性。
镀膜技术 （1）真空镀膜：将金属丝或碳棒在高真空下通
过大电流加热蒸发，沉积在样品表面。
（2）离子溅射：气体电离，离子撞击金属靶， 使金属原子沉积在样品表面。
（3）离子束镀膜：高能离子束轰击金属或碳靶， 使靶材沉积在样品表面。
Eo 样品
螺栓 夹板
金属或陶瓷样品制 备抛光截面
a) 树脂镶嵌
b) 金属夹板
2. 粉样
（1）微米级粉料 • 大小与厚度要适于样品台的安装
对使用加速电压的控制。
胶面贴实； 大小与厚度要适于样品台的安装
可以观察喷金和喷碳样品，喷碳样品更适合于能谱分析。 （1）真空镀膜：将金属丝或碳棒在高真空下通过大电流加热蒸发，沉积在样品表面。 喷镀与否主要根据样品观察区域和观察目地而有所区别。
• * 用吸耳球从不同方向吹拂粉料，使粉
1. 块样
• 对于金属、岩矿或无机物，切割成要求的尺寸，粘在 样品台上。如果样品数量多，注意样品尺寸最好一致。
• 微区成分分析样品表面应该平坦或经研磨抛光， 可以保证检测时几何条件不变。对于样品的断口 面，要选择起伏不大的部位，最好是分析点附近 有小的平坦区。样品表面和底面应该平行。
样品
树脂 塑料管
● 安装不导电样品可用普通双面胶，并在表 面粘一条胶带与金属样品台连通，以备镀 膜时形成导电通路。
● 样品即使导电，也必须与样品台粘牢，若 没接触好，会产生样品充电现象，图像不 稳定，而且收集能谱也受影响。
4. 对导电性差的样品镀膜
● 若样品不导电，则应决定是否要对样品进行喷镀。喷镀与 否主要根据样品观察区域和观察目地而有所区别。因为不 导电的样品在扫描电镜下观察时，会产生电荷积累而影响 观察稳定性。
镀膜技术 （1）真空镀膜：将金属丝或碳棒在高真空下通
过大电流加热蒸发，沉积在样品表面。
（2）离子溅射：气体电离，离子撞击金属靶， 使金属原子沉积在样品表面。
（3）离子束镀膜：高能离子束轰击金属或碳靶， 使靶材沉积在样品表面。
Eo 样品
螺栓 夹板
金属或陶瓷样品制 备抛光截面
a) 树脂镶嵌
b) 金属夹板
2. 粉样
（1）微米级粉料 • 大小与厚度要适于样品台的安装
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（5）脱水方法：
①酒精脱水：将固定好的样品用0.1mol/l磷酸缓冲溶液或蒸馏水清洗三
次，每次5~10min。将样品依次置于系列浓度30%、50%、70%、80%、 90%、95%、100%的酒精中脱水置换，时间一般为每级10~15min。
②叔丁醇脱水:将固定好的样品用0.1mol/l磷酸缓冲溶液或蒸馏水清洗
•粗样清洗
清洗时针对研究目的和样品性质以及污染物的性质选用不同的 清洗液和清洗方法。
清洗液： 常用的有蒸馏水、生理盐水、各种缓冲液等。 特殊的有蛋白分解酶、氯仿、二甲苯、加酶缓冲液等。
•样品固定
（1）固定的目的及要求 采用化学或物理方法 ，快速而准确地（不失真）把研究样品的结 构（包括内部结构）或表面形貌依原样（如生活时的状态)保存下 来，这就是固定。
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（2）固定剂
①醛类：戊二醛、甲醛
②四氧化锇
（3）固定方法
戊二醛单固定（绞股蓝上下表皮）
①单固定：戊二醛单固定
、锇酸熏蒸固定
②戊二醛锇酸双固定
Hale Waihona Puke ③戊二醛锇酸微波固定④甲醛固定
1%锇酸熏蒸固定（真菌菌丝）
注意：①固定温度0~4℃，若样品较大可为5~10 ℃。
②固定时间不尽相同，一般戊二醛固定时间稍长些，锇 酸固定时间不宜过长。
2
一、对样品处理的要求
附着物
1. 研究样品表面要处理干净
2.
扫描电镜主要是观察样品表
3. 面形貌和结构，而研究材料表面附
4. 有附着物，它们将掩盖表面微细结 蜜蜂触角 5. 构，最终会影响扫描电镜图像的质
6. 量和分析、解释并且影响图像美观。
蚜小蜂并胸腹节
2.研究样品必须彻底干燥
扫描电镜需在真空条件下正常工作，含水量高的样品会在
真空的镜筒中造成影响。因此样品必须经过干燥处理，而且 要彻底干燥。在干燥处理的操作中要尽量减少样品表面形貌 的变形，但虽然干燥方法从原始的自然干燥、烘干干燥、冷 冻干燥、真空干燥到今天的临界点干燥不断进化。但仍存在 变形。临界点干燥被视为最理想的干燥方法，但仍存在约5% 的变形。
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3.非导体样品的导电处理
（2）导电染色法
离子溅射喷镀仪
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参考文献：
1.郭素枝.扫描电镜技术及其应用.厦门大学出版 社,2006（2）：74~96
2.付洪兰.实用电子显微镜技术.高等教育社出版， 2004（7）：176~187
三次，每次5~10min。用系列浓度50%、70%、80%、90%、95%、 100%的叔丁醇中脱水，再一次100%置换，每级大约10~15min。
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3、干燥
（1）干燥要求：首先无变形干燥，以保证样品干燥后体积和结 构都不变形，其次是必须干燥彻底。 （2）干燥方法：临界点干燥法、自然干燥法、冷冻干燥法、叔 丁醇干燥法、六甲基二硅胺烷干燥法、乙腈干燥法、烘干干燥法、 氮气干燥法、微波干燥法。
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5、样品的导电处理
（1）金属镀膜法：真空蒸汽喷镀、
离子溅射喷镀：
原理：产生离子束的独立装置被称 为离子枪，它提供一定的束流强度、 一定能量的Ar离子流。离子束以一定 的入射角度轰击靶材并溅射出其表层 的原子，后者沉积到衬底表面即形成 薄膜。在靶材不导电的情况下，需要 在离子枪外或是在靶材的表面附近， 用直接对离子束提供电子的方法，中 和离子束所携带的电荷。
线
线
线
路
路
路
切片
冰醋酸浸泡
取样
线
清洗
路 线路5
前固定
冷冻 清洗
线 路
导电处理
漂白
水浴
熏蒸固定
线 后固定
路
割断 清洗
脱水
乙醇离心清洗
干燥 粘样
线 路
线 路
线 路
包埋
晾干或烘干
切片
粘台
脱蜡
镀膜
扫描PP电T学镜习观交流察
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1.取样、清洗、固定 •取样
因研究目的不同，对取样很难做一般的叙述和统一的要求，但 应注意：注意研究目的对样品具有针对性，避免盲目取样；注意 研究目的的典型性，即所取样品应该要有研究的具体对象。
③固定液浸没样品。
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2、脱水
（1）目的：用脱水剂取代样品中的游离水，以便进行干燥处理。
（2）脱水剂：乙醇、丙酮、叔丁醇、乙腈、六甲基二硅烷胺、 正丁醇等。
（3）脱水原理：用一种低表面张力的有机溶剂代换组织细胞中 的游离水，使样品在干燥时表面张力减少。
（4）对脱水的要求：不能引起结构变形；脱水要彻底。
由于电子束在样品表面作光栅状扫描，如果样品导电性能不
好，会在样品上聚集电荷放电，有时会损伤样品，直至烧毁。一 般生物样品不导电，因此必须对样品做导电处理，即喷镀一层金 属膜，一般膜厚为10~20nm。并根据样品表面凹凸粗糙状况及 样品性质而变化。有的样品需先喷碳再喷金。
4.保护样品研究面
扫描电镜的主要功能是做表面形貌观察或断面结构观察，所
（2）粘贴样品的材料：
粘贴动植物组织块样品最好使用导电胶，常用的有银河粉、石墨 粉等导电胶，对于要镀金观察的样品，通常用双面胶粘样；果壳、 种子等较大的样品可采用普通胶水粘样，注意等胶水自然干燥后 装样。
（3）注意事项：
粘贴样品需注意观察面朝上，并尽可能在水平面的同一高度上， 操作时要注意防尘、防潮和防止易飞散样品的相互混杂。
扫描显微镜（SEM）样品的制备
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一、对样品处理的要求
1.研究样品表面要处理干净 2.研究样品必须彻底干燥 3.非导体样品的导电处理 4.保护样品研究面 5.要求标记物要有形态
二、样品制备关键步骤
1. 取样、清洗、固定 2. 脱水 3. 干燥 4. 粘样 5. 样品导电处理
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烘干干燥法（淀粉粒）
不同干燥法扫描电镜图像（蚜虫前胸背板）分别为临界点干燥法、自然干 燥法、微波干燥法、氮气干燥法叔丁醇干燥法、乙腈干燥法
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4、粘样
（1）目的：
①保证样品在样品台上不移动，不掉落，尤其是作倾斜、旋转观 察使不掉落。
②用导电胶粘样，能增加样品和样品台之间的导电性，使样品上 聚集的二次电子能通过导电胶传输到样品台上，而不发生电荷积 累。
以保护样品表面或断面的细微结构是一个十分重要的问题。在清 洗、固定、脱水、干燥、粘台等各个处理环节都不能触及或挤压 乃至损伤其观察面。
5.要求标记物要有形态
用扫描电镜进行细胞化学研 究时，要求标记物应具有一定 的形态，以便让扫描电镜可以 识别。
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二、样品制备程序图
①酒精脱水：将固定好的样品用0.1mol/l磷酸缓冲溶液或蒸馏水清洗三
次，每次5~10min。将样品依次置于系列浓度30%、50%、70%、80%、 90%、95%、100%的酒精中脱水置换，时间一般为每级10~15min。
②叔丁醇脱水:将固定好的样品用0.1mol/l磷酸缓冲溶液或蒸馏水清洗
•粗样清洗
清洗时针对研究目的和样品性质以及污染物的性质选用不同的 清洗液和清洗方法。
清洗液： 常用的有蒸馏水、生理盐水、各种缓冲液等。 特殊的有蛋白分解酶、氯仿、二甲苯、加酶缓冲液等。
•样品固定
（1）固定的目的及要求 采用化学或物理方法 ，快速而准确地（不失真）把研究样品的结 构（包括内部结构）或表面形貌依原样（如生活时的状态)保存下 来，这就是固定。
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（2）固定剂
①醛类：戊二醛、甲醛
②四氧化锇
（3）固定方法
戊二醛单固定（绞股蓝上下表皮）
①单固定：戊二醛单固定
、锇酸熏蒸固定
②戊二醛锇酸双固定
Hale Waihona Puke ③戊二醛锇酸微波固定④甲醛固定
1%锇酸熏蒸固定（真菌菌丝）
注意：①固定温度0~4℃，若样品较大可为5~10 ℃。
②固定时间不尽相同，一般戊二醛固定时间稍长些，锇 酸固定时间不宜过长。
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一、对样品处理的要求
附着物
1. 研究样品表面要处理干净
2.
扫描电镜主要是观察样品表
3. 面形貌和结构，而研究材料表面附
4. 有附着物，它们将掩盖表面微细结 蜜蜂触角 5. 构，最终会影响扫描电镜图像的质
6. 量和分析、解释并且影响图像美观。
蚜小蜂并胸腹节
2.研究样品必须彻底干燥
扫描电镜需在真空条件下正常工作，含水量高的样品会在
真空的镜筒中造成影响。因此样品必须经过干燥处理，而且 要彻底干燥。在干燥处理的操作中要尽量减少样品表面形貌 的变形，但虽然干燥方法从原始的自然干燥、烘干干燥、冷 冻干燥、真空干燥到今天的临界点干燥不断进化。但仍存在 变形。临界点干燥被视为最理想的干燥方法，但仍存在约5% 的变形。
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3.非导体样品的导电处理
（2）导电染色法
离子溅射喷镀仪
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参考文献：
1.郭素枝.扫描电镜技术及其应用.厦门大学出版 社,2006（2）：74~96
2.付洪兰.实用电子显微镜技术.高等教育社出版， 2004（7）：176~187
三次，每次5~10min。用系列浓度50%、70%、80%、90%、95%、 100%的叔丁醇中脱水，再一次100%置换，每级大约10~15min。
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3、干燥
（1）干燥要求：首先无变形干燥，以保证样品干燥后体积和结 构都不变形，其次是必须干燥彻底。 （2）干燥方法：临界点干燥法、自然干燥法、冷冻干燥法、叔 丁醇干燥法、六甲基二硅胺烷干燥法、乙腈干燥法、烘干干燥法、 氮气干燥法、微波干燥法。
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5、样品的导电处理
（1）金属镀膜法：真空蒸汽喷镀、
离子溅射喷镀：
原理：产生离子束的独立装置被称 为离子枪，它提供一定的束流强度、 一定能量的Ar离子流。离子束以一定 的入射角度轰击靶材并溅射出其表层 的原子，后者沉积到衬底表面即形成 薄膜。在靶材不导电的情况下，需要 在离子枪外或是在靶材的表面附近， 用直接对离子束提供电子的方法，中 和离子束所携带的电荷。
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冰醋酸浸泡
取样
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清洗
路 线路5
前固定
冷冻 清洗
线 路
导电处理
漂白
水浴
熏蒸固定
线 后固定
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割断 清洗
脱水
乙醇离心清洗
干燥 粘样
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包埋
晾干或烘干
切片
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脱蜡
镀膜
扫描PP电T学镜习观交流察
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1.取样、清洗、固定 •取样
因研究目的不同，对取样很难做一般的叙述和统一的要求，但 应注意：注意研究目的对样品具有针对性，避免盲目取样；注意 研究目的的典型性，即所取样品应该要有研究的具体对象。
③固定液浸没样品。
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2、脱水
（1）目的：用脱水剂取代样品中的游离水，以便进行干燥处理。
（2）脱水剂：乙醇、丙酮、叔丁醇、乙腈、六甲基二硅烷胺、 正丁醇等。
（3）脱水原理：用一种低表面张力的有机溶剂代换组织细胞中 的游离水，使样品在干燥时表面张力减少。
（4）对脱水的要求：不能引起结构变形；脱水要彻底。
由于电子束在样品表面作光栅状扫描，如果样品导电性能不
好，会在样品上聚集电荷放电，有时会损伤样品，直至烧毁。一 般生物样品不导电，因此必须对样品做导电处理，即喷镀一层金 属膜，一般膜厚为10~20nm。并根据样品表面凹凸粗糙状况及 样品性质而变化。有的样品需先喷碳再喷金。
4.保护样品研究面
扫描电镜的主要功能是做表面形貌观察或断面结构观察，所
（2）粘贴样品的材料：
粘贴动植物组织块样品最好使用导电胶，常用的有银河粉、石墨 粉等导电胶，对于要镀金观察的样品，通常用双面胶粘样；果壳、 种子等较大的样品可采用普通胶水粘样，注意等胶水自然干燥后 装样。
（3）注意事项：
粘贴样品需注意观察面朝上，并尽可能在水平面的同一高度上， 操作时要注意防尘、防潮和防止易飞散样品的相互混杂。
扫描显微镜（SEM）样品的制备
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一、对样品处理的要求
1.研究样品表面要处理干净 2.研究样品必须彻底干燥 3.非导体样品的导电处理 4.保护样品研究面 5.要求标记物要有形态
二、样品制备关键步骤
1. 取样、清洗、固定 2. 脱水 3. 干燥 4. 粘样 5. 样品导电处理
PPT学习交流
烘干干燥法（淀粉粒）
不同干燥法扫描电镜图像（蚜虫前胸背板）分别为临界点干燥法、自然干 燥法、微波干燥法、氮气干燥法叔丁醇干燥法、乙腈干燥法
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4、粘样
（1）目的：
①保证样品在样品台上不移动，不掉落，尤其是作倾斜、旋转观 察使不掉落。
②用导电胶粘样，能增加样品和样品台之间的导电性，使样品上 聚集的二次电子能通过导电胶传输到样品台上，而不发生电荷积 累。
以保护样品表面或断面的细微结构是一个十分重要的问题。在清 洗、固定、脱水、干燥、粘台等各个处理环节都不能触及或挤压 乃至损伤其观察面。
5.要求标记物要有形态
用扫描电镜进行细胞化学研 究时，要求标记物应具有一定 的形态，以便让扫描电镜可以 识别。
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二、样品制备程序图