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荧光定量技术讲座

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内容概要
荧光定量PCR原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR的解析方法 SYBR法实验流程及注意事项 TIANGEN公司荧光定量产品选择指南
绝对定量解析方法
绝对定量的定义
Log（起始浓度）与循环数呈线性关系，通过已知起始拷贝数的标准品 可作出标准曲线,即得到该扩增反应存在的线性关系
根据样品Ct值，就可以计算出样品中所含的模板量
֠ 无模板特异性 ֠ 对引物特异性要求较高 ֠ 不能进行多重定量 ֠ 灵敏度相对较低
Taqman探针法——原理
5′端标记有报告基团(Reporter, R) ，如FAM、VIC等 3′端标记有荧光淬灭基团 (Quencher, Q) 探针完整，R发射的荧光能量被Q基团吸收 ，无荧光， R与Q分开，发荧光 Taq酶有 5′→3′外切核酸酶活性，可水解探针
荧光定量PCR反应性的确认
线性关系、扩增效率确认
相关系数（R2）：大于0.98 标准曲线斜率: -3 － -3.5 PCR扩增效率（E）:0.9-1.2
检测灵敏度确认
35Cycles内可得到好的定量结果 如果采用SYBR检测方法，30Cycles内 无非特异性产物扩增
No template control确认
常用荧光标记方法
非特异性荧光标记 SYBR Green I
特异性荧光标记 TaqMan Probe
SYBR Green I染料法——原理
SYBR Green I是一种结合于所有dsDNA双螺旋小沟 区域的具有绿色激发波长的染料。
SYBR Green I
SYBR Green I 染料法——作用机理
Taqman探针法——工作机理
探针
热变性
引物
报告基团 R
淬灭基团
引物和探针与模板退火 DNA聚合酶 R
探针
延伸反应
R
R
Taqman探针法——PCR体系的建立
1、引物、探针的设计：
探针Tm为68-70℃ ，<30 bp, 5’不能有G，G可能会淬灭荧光素， 引物尽量靠近探针，扩增片段<400 bp，引物Tm为59-60℃
实验数据
Sample copies/ml
标准品
5×103
标准品 标准品 标准品
5×104 5×105 5×106
未知样品
?
空白对照
Ct1 28.18
25.25 22.11 18.63 20.56 None
Ct2 28.64
25.14 22.46 18.92 20.45 None
Mean Ct 28.41
3’淬灭基团 淬灭基团性质 建议使用的5’报告基团
TAMRA
荧光物质
FAM, HEX, TET, JOE等
Eclipse 非荧光物质
FAM, HEX, TET, JOE, TAMRA, ROX等
Taqman探针法——优缺点
优点
֠ 高度特异性 ֠ 重复性好 ֠ 灵敏度高 ֠ 可 Nhomakorabea行多重定量
缺点
֠ 只适合一个特定的目标 ֠ 委托公司标记，价格较高 ֠ 不易找到本底低的探针
35 Cycles内无引物二聚体产生
荧光定量PCR技术的应用
定性分析研究：杂合或纯合子鉴定，（SNPs）分析等 绝对定量研究：病毒和病原菌定量分析，基因拷贝数定量，
GMO定量检测等 相对定量研究：mRNA表达量分析，siRNA效果确认，基因芯
片结果验证，差异显示结果验证等
内容概要
荧光定量PCR的原理 荧光定量PCR的标记方法 荧光定量PCR的解析方法 SYBR法实验流程及注意事项 TIANGEN公司荧光定量产品选择指南
拷贝数的计算：
待测样本浓度（ng/ul）＝OD260×40×稀释倍数 样本分子量=碱基数×324 待测样本拷贝数（copies/ul）=待测样本浓度/样本分子量×6×1014
绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量
方 法：从血液中提取病毒DNA，以TaqMan探针法进行荧光定量检测 试 剂：TIANGEN公司探针法试剂RealMasterMix（Probe）（目录号：
相对定量分析——管家基因筛选
管家基因
维持细胞基本代谢活动所必须的基因, 如：GAPDH、Actin、18S rRNA等
筛选方法
根据文献提供 通过具体实验筛选
实验值
6 5 4 3 2 1 0 Sample1
Sample2 Sample3
实验组
Sample4
β-Actin GAPDH β-2-microglobulin HPRT
实时定量PCR技术： 利用荧光信号的变化实时检测PCR扩增反应中每一个循环扩 增产物量的变化，通过Ct值和标准曲线的关系对起始模板进 行定量分析
与常规 PCR技术比较： 对PCR扩增反应的终点产物进行定量和定性分析，无法对起始模 板准确定量，无法对扩增反应实时检测
荧光定量PCR原理－－常用名词概念
2、反应参数的确定：
一般为：94 ℃，10-20S 60℃，30-60S（Taq酶5′→3′外切核酸酶活性在60℃ 最高），也可通
过温度梯度优化退火温度
3、优化引物和探针浓度：获得最小Ct值，最大信号/背景比值 引物浓度：100-900nM 探针浓度：50-300nM
4、其他与常规PCR相同
Taqman探针法——荧光标记物的选择
= 10-1/-3.29 －1 = 2.01－1 = 1.01
相关系数（R2）：大于0.98，越接近1，结果可信度越高。 扩增效率（E）：0.9-1.2, 越接近1，越理想。
绝对定量实验例——乙肝病人血液中HBV的绝对定量
未知样品拷贝数的计算
将Ct值带入线性方程：
20.5= -3.29 X + 40.33
原始图谱
对数图谱
将温度与荧光强度的变化求导 (-dI/dT)
SYBR Green I染料法——融解曲线
融解曲线分析，单一峰 无非特异性荧光 定量准确
融解曲线分析，出现杂峰 其他产物出现非特异性荧 光，因此定量不准确
SYBR Green I染料法——优缺点
优点
缺点
֠ 使用方便，不必设计复杂 探针
֠ 具有价格优势
Ct value
Cycle（循环 数）
荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
理想的PCR反应 Xn＝X0 * 2n
n：扩增循环数
X0 ：起始模板数量 Xn：第n次循环后扩增产物数量
荧光定量PCR原理－－Ct值定量的数学原理
非理想的PCR反应 Xn＝X0 *（1＋En）n
n：扩增循环数
X0 ：起始模板数量
相对定量分析——2 －△△Ct法
公式：
待测组目的基因 待测组管家基因
F = 2－ 平均Ct值 － 平均Ct值
－
对照组目的基因 对照组管家基因 平均Ct值 － 平均Ct值
优点：无需作标准曲线 缺点：假定扩增效率为 100 %；
假定标准曲线及每次扩增之间的效率都保持一致； 实验条件优化较为复杂。 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一
实验数据
管家基因H
目的基因X
检测样品
定量结果 定量结果 校正值 相对量
对照样品 6391.5 343.4 0.0537 1.000
待测样品1 8589.7 17.3 0.0020 0.037
待测样品2 7432.9 1946.1 0.2618 4.874
优点：分析简单，实验优化相对简单 缺点：对每一个基因，每一轮实验都必需做标准曲线 应用：基因表达调控研究中最常用与公认的两种相对定量方法之一
（2）
整理方程式（2）：
LogX0 ＝Log M －Ct Log（1＋En）
荧光定量PCR原理－－Ct值与模板起始量的关系
模板DNA量越多，荧光达 到域值的循环数越少，即Ct值 越小。
Log模板起始浓度与Ct值 呈线性关系。
Sample
Ck 104
Ck 102
Cycle number
Log of DNA concentration
扩增曲线 荧光阈值 Ct值
荧光定量PCR原理－－扩增曲线
荧光基团
Rn（荧光强 度）
Log－liner phase
平台期
荧光检测元件
Baseline
Cycle（循环数）
荧光定量PCR原理－－荧光域值
前15个循环信号作为荧光 本底信号（baseline）
荧光域值的缺省设置是 3～15个循环的荧光信号的标 准偏差的10倍
相对定量分析——2 -△△Ct法
实验数据：
Sample
处理前 处理后
Jun(MeanCt) GAPDH(MeanCt) E
18
17
1.95
16
17.4
1.95
2 - △△Ct法：假设目的基因和参照基因扩增效率都接近100%
△Ct（处理前）＝18－17＝1 △Ct（处理后）＝16－17.4=－1.4 △△Ct=△Ct（处理后）－△Ct（处理前）＝－1.4－1＝－2.4
热变性 引物退火
延伸反应
SYBR Green I染料法——问题点与关键点
问题点： SYBR Green I与双链DNA进行结合后散发荧光，因此如 果反应体系中有非特异性扩增或引物二聚体的产生，也将 同时被检测，从而可能导致检测结果不准确。
关键点： 设计合适引物，防止非特异性扩增！
SYBR Green I染料法——融解曲线
Sample
25
质粒标准品的制备
目的基因
PCR
目的基因
目的基因克隆
目目的的基基因因
基因组DNA 质粒
质粒提取，OD值定量，将质粒梯度稀释作为标准品使用

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荧光定量PCR工作原理及应用PPT课件

荧光定量PCR工作原理及应用PPT课件


灵敏度高
由于采用了荧光信号，荧 光定量PCR具有较高的灵 敏度，能够检测低拷贝数 的基因表达。
重复性好
通过标准化和内参基因的 校正，荧光定量PCR具有 较好的重复性，结果可靠。
突变检测
检测范围广
荧光定量PCR可以检测各 种类型的基因突变，包括 点突变、插入和缺失等。
高通量
通过多重PCR和阵列技术， 可以对多个基因位点进行 高通量突变筛查。
准确性高
由于采用了实时监测和荧 光信号，荧光定量PCR能 够提高突变检测的准确性。
病原体检测与鉴定
快速准确
荧光定量PCR能够快速准确地检 测和鉴定病原体，为临床诊断和
治疗提供依据。
高灵敏度
对病原体进行特异性扩增后，荧 光定量PCR能够检测出极低浓度
的病原体。
鉴别分型
通过荧光标记的特异性探针，可 以对病原体进行分型和鉴别，有 助于了解疾病传播和流行病学调
特点
高灵敏度、高特异性、可定量分 析、可自动化等。
发展历程
01
02
03
04
1996年
美国PE-Cetus公司推出第一 台商业化荧光定量PCR仪。
1997年
ABI公司推出TaqMan荧光探 针技术。
2000年
实时荧光定量PCR技术开始广 泛应用于临床诊断和科研领域
。
2004年
数字PCR技术问世，实现了单 分子水平的检测。
荧光定量pcr工作原理及应 用ppt课件
目录
• 荧光定量PCR技术概述 • 荧光定量PCR工作原理 • 荧光定量PCR的应用 • 荧光定量PCR的优缺点 • 荧光定量PCR的未来发展
01
荧光定量PCR技术概述定义与特点 Nhomakorabea定义
荧光定量PCR技术培训班讲座

荧光定量PCR技术培训班讲座


选择内参基因
29
相对定量方法
2-ΔΔ Ct法
成立条件：假设扩增效率为100% 满足条件：1）内参基因和目标基因的扩增效率接近 2）内参基因和目标基因的扩增效率均为90%-110%
1、通过内参基因的CT值归一目标基因的CT值 2、通过对照样本的ΔCT值归一待测样本的ΔCT值 3、计算表达水平比率： 2 –ΔΔCT=表达量的比值
荧光阈值（threshold）
基线（baseline）：一般以PCR反应前15个循环的荧光信号作为本底信 号 荧光阀值（threshold）：扩增曲线上人为设定的一个值 -- 缺省设置是PCR反应前3-15个循环荧光本底信号标准偏差的10倍 -- 手动设置时，要大于样本的荧光背景值和阴性对照的荧光最高值 -- 指数期的最初阶段
Company name
PCR：基本原理
Denaturation: 94 – 96°C
基本要素： • Template • Primers • DNA polymerase • dNTP, N=A,G,C or T
Annealing: 50 – 65°C Extension: 70 – 75°C
PCR：基本原理
实时荧光定量PCR技术 原理、应用及实践 Real time Quantitative PCR (Real time Quantitative PCR)
北京康为世纪生物科技有限公司
公司简介
成立于2007年10月31日 集研发、生产、销售、客户服务为一体的 生物技术产业公司 立志打造高品质生物试剂产品链和技术服 务链，成为生命科学研究领域的问题解决 专家。
Ct值的特点： 相同模板进行96次扩增，平台期DNA拷贝数波动 很大，但Ct值相对固定； Ct值则极具重现性
荧光定量PCRPPT课件

荧光定量PCRPPT课件


仪器设备
确保PCR仪、荧光检测器 等设备正常运行，并按照 实验要求进行参数设置。
实验设计
根据研究目的和样本特性， 设计合理的荧光定量PCR 实验方案。
样本处理
样本收集
采集具有代表性的样本， 并妥善保存以备后续实验。
样本处理
将样本进行适当的处理， 如细胞分离、DNA/RNA 提取等，以获得足够的核 酸模板。
荧光信号检测
在PCR循环过程中，实时监测荧光 信号的变化，收集数据以供后续分 析。
结果分析
数据处理
结果应用
对荧光定量PCR实验数据进行处理， 如阈值设定、循环阈值（Ct值）计算 等。
将荧光定量PCR实验结果应用于后续 的研究或实际应用中，如基因表达分 析、病原体检测等。
结果解读
根据实验目的和预期结果，对荧光定 量PCR实验结果进行解读，并评估其 可靠性。
02
该技术利用荧光染料或荧光探针 标记特异性检测目标，通过荧光 信号的累积和检测，实现对目标 序列的实时定量分析。
荧光定量PCR技术的原理
在PCR反应过程中，随着DNA 的合成，荧光染料或荧光探针与
DNA结合，产生荧光信号。
随着DNA的扩增，荧光信号也 相应增强，通过实时监测荧光信 号的变化，可以计算出目标序列
基因突变检测
总结词
荧光定量PCR技术可用于检测基因突变，通过对基因序列的变异进行分析，有助于遗传性疾病的诊断、药物疗效 评估和个性化治疗。
详细描述
荧光定量PCR能够高特异性地检测基因序列的变异，包括点突变、插入和缺失等。通过比较正常组织和病变组织 的基因突变差异，有助于了解疾病的发生和发展机制，为遗传性疾病的诊断和治疗提供依据。同时，基因突变检 测还可用于药物疗效评估和个性化治疗方案的制定。
Vazyme-荧光定量PCR(qPCR)技术讲座资料

Vazyme-荧光定量PCR(qPCR)技术讲座资料

qPCR•PCR定量宏基因组单个基因（表达）qPCR •PCR定量qPCR•PCR定量N = N0 x 2nqPCR•PCR定量N = N0 x 2n （2，扩增效率）•PCR 定量qPCRN = N 0 x 2n非指数扩增期指数扩增期N = N 0 x 1.9n N = N 0 x 1.8nN = N 0 x 1.7n。

•PCR 定量qPCRN = N 0 x 2n非指数扩增期指数扩增期N = N 0 x 1.9n N = N 0 x 1.8nN = N 0 x 1.7n。

检测灵敏度平台期指数期线性期平台期qPCR指数期N = N0 x 2n比较不同样品间某基因的‘量’Choice 1（半定量PCR）:N = N0 x 2n 等循环数（n）， N0 = N / 2nChoice 2（qPCR）:N = N0 x 2n 等产物量（N）， LgN0 = – n x Lg2 + LgNqPCR指数期N = N0 x 2nChoice 1（半定量PCR）Choice 2（qPCR）qPCR•半定量PCR VS qPCRChoice 1半定量PCR显著差异 差异微弱qPCR•半定量PCR VS qPCRChoice 2qPCR显著差异•半定量PCR VS qPCR差异显著！qPCR没有差异 显著差异Choice 2qPCRChoice 1半定量PCRqPCR•等N测定方式 (Real-time，实时)qPCR•PCR阶段划分线性图谱对数图谱qPCR•基线、阈值、C T值线性图谱对数图谱qPCR•基线、阈值、C T值基线SD X10， 10-5•基线、阈值、C T值线性图谱对数图谱基线期与指数期接合部扩增曲线与阈值的交点qPCRqPCR 化学原理荧光 (染料、荧光基团)SYBR TaqManqPCR 化学原理•SYBR一种DNA小沟非饱和性结合染料与DNA结合时发光/不结合(游离)时不发光每形成一条DNA双链，就会有一定数量的染料结合上去染料一结合，就会产生荧光信号信号强度与DNA分子总数目成正比qPCR 化学原理•TaqMan Probe一种水解探针(5’ Reporter, 3’ Quencher)完整时不发光/水解后发光每形成一条DNA链，就会水解一条探针每水解一条探针，就会产生一个单位信号信号强度与结合过探针的DNA分子总数目成正比qPCR 数学原理N = N0 x 2nqPCR 数学原理•定量数学原理， DNA量 VS C TqPCR 数学原理•定量数学原理， DNA量 VS C TqPCR 数学原理•定量数学原理， DNA量 VS C TqPCR 应用-绝对定量•根据标准品，测定样品中基因表达量的绝对值 xxx 个拷贝qPCR 应用-绝对定量•根据标准品，测定样品中基因表达量的绝对值 xxx 个拷贝qPCR 应用-绝对定量•根据标准品，测定样品中基因表达量的绝对值 xxx 个拷贝qPCR 应用-相对定量•测定不同样品中基因表达量的相对值 xxx 倍Sample 1 Sample 2 Ct: 25Ct: 26基因表达量Sample 1 /Sample 2 = 2△Ct: -1qPCR 应用-相对定量•测定不同样品中基因表达量的相对值 xxx 倍样本量差异-RNA 差异-逆转录差异-cDNA 差异Calibrator (内参，Normalizer)Sample 1 Sample 2 Ct: 25 Ct: 26基因表达量Sample 1 /Sample 2 = 2△ Ct: -1qPCR 应用-相对定量•测定不同样品中基因表达量的相对值 xxx 倍Sample 1 Sample 2Ct: 25Ct: 26内参Ct: 20内参Ct: 22△ Ct: 5△ Ct: 4△△Ct： 1基因表达量Sample 1 / Sample 2 = 1/2SYBR相对定量-实验流程及注意事项•样品制备•RNA提取•RT-PCR•内参基因选择•引物设计•引物有效性检测•qPCR•数据处理如前所述注意事项RNA完整性、纯度逆转录模板用量尽可能一致 cDNA质量（普通PCR测定） 基因组污染情况（NRT对照）SYBR相对定量-实验流程及注意事项•样品制备•RNA提取•RT-PCR•内参基因选择•引物设计•引物有效性检测•qPCR•数据处理成功关键！引物长度（17 bp-25 bp）产物长度100 ～ 200 bp3’端应尽量避免高GC或高AT含量区域。