益生菌D-1液体发酵工艺的研究.

发酵⼯程实验发酵⼯程实验 Prepared on 24 November 2020实验⼀酸奶的制作与乳酸菌的活菌计数（5学时）实验⽬的：1、学习并掌握酸奶制作的基本原理与⽅法。

2、了解市售酸奶的⽣产⼯艺。

3、掌握乳酸菌活菌计数⽅法与操作。

实验原理：乳酸菌在乳中⽣长繁殖，发酵分解乳糖产⽣乳酸等有机酸，导致乳的pH值下降，使乳酪蛋⽩在其等电点附近发⽣凝集。

乳酸菌属于兼性厌氧微⽣物，在⽆氧条件下⽣长繁殖较好，实验室条件下利⽤混菌培养的⽅法，尽可能让乳酸菌在⽆氧条件下⽣长，每个单菌落代表⼀个微⽣物细胞。

实验内容：（⼀）酸奶制作1、10%脱脂奶粉溶解于热⽔（80℃左右）中，充分搅拌均匀，配成调制乳；2、添加蔗糖：为了缓和酸奶的酸味，改善酸奶⼝味，在调制乳中加⼈4-8％的蔗糖。

3、灭菌：⽅法有两种：将乳加热⾄90℃，保温5min；4、接种：往冷却到43-45℃灭过菌的乳中加⼊乳酸菌，接种量为2%-5%。

5、分装：酸奶受到振动，乳凝状态易被破坏，因此，不能在发酵罐容器中先发酵然后再进⾏分装，须是将含有乳酸菌的⽜乳培养基先分装到⼩容器中，加盖后送⼊恒温室培养，在⼩容器中发酵制成酸奶。

6、发酵：发酵的温度保持在40-43 ℃，⼀般发酵时间为3-6h。

发酵终点的确定有两种⽅法：1）检测发酵奶的酸度，达到65-70 T°。

2）倾斜观察，瓶内酸奶流动性差，⽽且瓶中部有细微颗粒出现。

7、冷却：发酵结束，将酸奶从发酵室取出，⽤冷风迅速将其冷印到10℃以下，⼀般2 h，使酸奶中的乳酸菌停⽌⽣长，防⽌酸奶酸度过⾼⽽影响⼝感。

8、冷藏和后熟：经冷却处理的酸奶，贮藏在2-5℃的冷藏室中保存。

9、感官指标1）⾊泽：⾊泽均匀⼀致，呈乳⽩⾊，或稍带微黄⾊。

2）组织状态：凝块稠密结实均匀细腻，⽆⽓泡，允许少量乳清析出。

3）⽓味：具有清⾹纯净的乳酸味，⽆酒精发酵味，⽆霉味和其他外来不良⽓味。

（⼆）乳酸菌活菌检测①、检测培养基：蛋⽩胨15g，⽜⾁膏5g，葡萄糖20g，氯化钠5g，碳酸钙10g，琼脂粉20g，⽔1000ml，115～121℃灭菌20min，灭菌后放置⽔浴52℃保温备⽤。

细菌性阴道病益生菌治疗方案的研究进展摘要细菌性阴道病（BV）是常见的阴道感染性疾病之一。

BV的主要特征是阴道微生态失调，乳杆菌减少的同时厌氧菌大量增多。

传统的BV治疗方法是使用甲硝唑等抗菌药物，抗菌药物的过多使用不仅副作用多，且治愈后易复发，而大量研究表明，通过益生菌的干预有助于恢复正常阴道菌群，缓解BV症状，减少复发。

本文荟萃了近年来益生菌制剂在针对BV治疗上的不同方案，为以后应用于临床提供一定的依据。

经过对文献的综合分析，益生菌可单独治疗BV，同时使用益生菌制剂和抗菌药物对BV的治疗效果更好，抗菌药物与益生菌联用比单独使用抗菌药物可显著降低BV的复发率，益生菌与其他物质如雌激素、乳铁蛋白或噬菌体联合也可治疗BV。

细菌性阴道病（bacterial vaginitis，BV）是育龄期妇女常见的阴道炎症之一，其特征是阴道微生物群组成发生显著变化，从乳杆菌属占优势变为以厌氧菌为主的多种微生物群落（如阴道加德纳菌、阴道阿托波菌及其他BV相关病原体等）［1-5］。

传统的BV治疗方法是使用甲硝唑等抗菌药物，主要作用是抑制厌氧菌的过度生长，但无促进乳杆菌重新定植的作用，而且全身使用抗菌药物有很大的副作用；另外，甲硝唑治疗后BV的复发率很高，在治疗开始后的6~12个月内，复发率超过50%；再有，频繁、长期使用抗菌药物会增加对抗菌药物的耐药性，并降低使用者的依从性和有效剂量给药［2，6,7］。

而大量的研究表明，益生菌可以通过抗菌、抗生物膜、抗定植或抗黏附、共聚集和调节宿主免疫等机制抑制BV相关病原体的生长，从而营造不利于BV病原体生存的微环境［8］。

我国2021年的BV指南指出，微生态制剂如阴道局部乳杆菌制剂、中成药对于帮助BV患者恢复阴道微生态平衡、巩固疗效及预防复发具有一定的作用［9］。

BV 的动物研究显示，益生菌制剂可通过减少上皮细胞的破坏和降低髓过氧化物酶活性，从而减少阴道加德纳菌诱导的BV［10］。

益生菌已被用作BV治疗中传统抗菌药物的辅助物，可提高治愈率和减少复发［3，8］。

动物医学进展,２０１９,４０(１２):７４Ｇ７８P r o g r e s s i nV e t e r i n a r y M e d i c i n e文献综述益生菌发酵中药研究进展㊀收稿日期:２０１８Ｇ０４Ｇ０７㊀基金项目:甘肃省现代农业产业技术体系项目;中国农业科学院重大产出科研选题(C A A S ＧZ D X T ２０１８００８)㊀作者简介:陈柯源(１９９３－),男,河南洛阳人,硕士,主要从事基础兽医研究.∗通讯作者陈柯源,高㊀艳,郝宝成∗,梁剑平∗(中国农业科学院兰州畜牧与兽药研究所/农业部兽用药物创制重点实验室/甘肃省新兽药工程重点实验室,甘肃兰州７３００５０)㊀㊀摘㊀要:益生菌对于平衡动物胃肠道菌群有着重要影响,其在生长繁殖过程中会产生多种活性酶及其他代谢产物.中药经益生菌发酵后,其有效活性成分得到充分利用的同时还可促进动物生长㊁提高免疫力,具有无抗㊁低残留㊁绿色安全等优点,是替代抗生素的理想饲料添加剂,在畜牧业中的发展前景十分广阔.论文从益生菌发酵中药的作用机理㊁种类㊁特征㊁菌种选择及条件优化等方面分别进行了阐述,为研发新型饲料添加剂提供一定的参考.㊀㊀关键词:益生菌;发酵;中药;饲料添加剂中图分类号:S ８５９．３文献标识码:A文章编号:１００７Ｇ５０３８(２０１９)１２Ｇ００７４Ｇ０５㊀㊀我国每年都将大量抗生素作为饲料添加剂,投用于畜牧业,抗生素作为饲料添加剂可以提高动物生长及免疫机能,但长期大量使用则会造成致病菌耐药性增强,人类食用抗生素残留量超标的畜产品后,还会引起中毒㊁过敏等一系列危害[１].因此,研究和开发新型的绿色㊁无公害饲料添加剂来替代抗生素已成当前的必然发展趋势.中药发酵饲料添加剂具有毒副作用小㊁无抗药性㊁功能多样等优点,近年来受到越来越多研究人员的关注.中药中含有众多活性成分,如多糖㊁甙类㊁生物碱㊁有机酸等,对动物的生产性能和免疫力有着广泛的影响,同时对肠道微生物群和胃肠道系统也产生一定的影响[２Ｇ３],是抗生素的良好替代品;而益生菌也可以调节动物肠道的菌群平衡,为机体提供丰富的生物蛋白㊁维生素㊁小肽等营养物质,提高机体免疫力和抗氧化能力,进而提高动物的生产性能[４].中药发酵将两者有机地结合起来,通过益生菌的酶解作用,不仅增加了中药活性成分的释放量,同时益生菌的一些代谢产物也可改变中药活性成分,达到增强药效的目的[５].因此,益生菌发酵中药对增强药效㊁促进动物的生产性能㊁降低饲养成本等将产生重要影响,具有广阔的应用前景.１㊀中药发酵的发展史发酵是中药材传统炮制方法之一.早在数千年前,我国学者就意识到益生菌发酵的特性,从最初的酿酒㊁食品加工一直延伸到中药炮制.很多药物也都是益生菌发酵的产物,如三七㊁六神曲㊁半夏曲等,但传统意义上利用益生菌来发酵中药仍存在许多问题,如发酵菌种不纯㊁发酵的过程及产物质量难以控制等.近年来,益生菌因无毒并具有独特的生理功效受到了国内外研究人员的广泛关注,这也使益生菌发酵技术的应用得到不断地推广[６].同时,研究表明益生菌具有众多功能,如羟基化㊁氧化㊁酯化㊁甲基化等,同时,益生菌在调节肠道生态失衡㊁改善动物健康方面也发挥着重要作用[７].益生菌发酵中药后,能充分释放中药中的有效成分,从而改善和提高药物活性,同时发酵液中含有大量活性酶,经机体迅速吸收后,可调节免疫机能,增强抗病力,从而使中药的药效得到充分发挥.除此之外,中药中的某些成分经益生菌分解后可转化生成新的成分,这些新成分一方面可能使药效得到进一步增强,另一方面,还可能表现出新的药理作用.因此,可以利用益生菌进行发酵制药,从而降低用药成本,提高药效[８Ｇ９].同时,反应条件相对温和㊁污染小㊁设备简单也是中药益生菌发酵的特点,这为中药材的开发及研究奠定了基础.２㊀发酵种类中药发酵包括液体发酵和固体发酵.液体发酵又称液体深层发酵,是在含中药的液体培养基中接种益生菌,并在一定条件下进行发酵,发酵产物包括发酵液和菌丝体.冯路瑶等[１０]研究了６种中药材的水提物和醇提物对牛樟芝液态发酵过程中菌丝体生长和胞内三萜类成分产量的影响,结果表明,除了薏苡仁水提物添加浓度在０．６％时,对牛樟芝生长有抑制作用,其他中药水提物对牛樟芝生长均有促进作用.枸杞水提物对牛樟芝生长和胞内三萜的产生有显著的促进作用;陈皮和当归醇提物在高浓度时对牛樟芝菌丝体生长和胞内三萜的产生有明显的抑制作用;连翘醇提物对牛樟芝胞内三萜物质的产生有显著的促进作用,是对照组的４．５倍.再如,经益生菌发酵过的鹿茸提取物,与未发酵的提取物相比,可明显提高动物机体的造血活性和抗氧化活性[１１].固体发酵是将益生菌接种到以中药或中药药渣为营养基质的培养基中进行发酵,其发酵基质一般不灭菌,且多为自然开放过程,发酵成本也相对较低,且操作简便,尹珺伊等[１２]通过在日粮中添加发酵黄芪粉,使肉鸡的生产及免疫性能与黄芪粉相比得到了显著提高;史洪涛等[１３]将乳酸菌分别接种于扶正解毒散及单味中药中发酵,结果显示乳酸菌可以在扶正解毒散及组方各味中药中生长,最优发酵条件为温度３２ħ,含水量４０％,接种量１０％;最适营养物质添加量为每千克培养基中含红糖５g㊁酵母粉３g㊁蛋白胨３g.结果表明,乳酸菌能发酵扶正解毒散,与初始发酵条件及培养基相比,乳酸菌活菌数提高了１０．５９倍,为２．１１ˑ１０９C F U/g.因此,固体发酵具有广泛的应用前景.３㊀发酵机理传统的中药炮制,其加工条件复杂以及对中药的利用率极低等不足,大大消耗了中药资源,而益生菌发酵中药一般是在常温㊁常压的环境下发酵,反应条件相对温和,同时益生菌在生长代谢时所产生的一系列酶类代谢产物,如纤维素酶㊁半纤维素酶㊁果胶酶㊁淀粉酶㊁蛋白酶等可破坏植物的细胞壁,促进有效成分溶出,并能将中药中的糖类㊁蛋白质㊁纤维等成分进一步分解㊁转化为机体易吸收的小分子物质,从而使中药有效成分得到很大程度的保留的同时增强药效.同时这些酶类物质还能与中药中的某些特殊成分发生互作,并对其活性成分进行修饰[１４],促使新物质的形成并降低中药中有毒成分的含量[１５].４益生菌发酵中药的特点４．１㊀提高中药有效成分含量,增强药效中药的有效成分多位于植物的根㊁茎㊁叶细胞的胞浆中,植物细胞壁主要由纤维素和半纤维素构成,且结构紧密,使有效成分难以被释放出来,从而不能被机体充分吸收利用.通过益生菌与中药的共发酵作用,可使中药的有效成分含量得到大幅度提高.李瑜[１６]在研究中发现,复方中药经酵母菌和乳酸菌共同发酵后,发酵液中多酚㊁多糖㊁黄酮㊁蛋白质含量明显升高,且氨基酸含量增加显著,其中谷氨酸含量最高.韩春杨等[１７]研究发现,四君子汤发酵液对体外淋巴细胞具有明显的增殖作用,而四君子汤制剂则需要约２倍发酵液剂量才能使体外淋巴细胞显著增殖,这表明四君子汤经发酵后,药效可大大提升.４．２㊀合成新物质,提高中药利用率益生菌在中药发酵过程中会产生各种酶以及多种次生代谢产物,这些酶类物质使药物的结构发生羟化或脱氢反应,将药物以预定的方向转化形成新的化合物;次生代谢产物通过和中药有效成分发生反应以及把有效成分作为前体而形成新的化合物[１８].阮鸣等[１９]通过香菇㊁桑黄㊁灵芝等真菌发酵黄芪,结果发现这几种真菌都可以将黄芪甲苷转化成异黄芪甲苷,其中黄芪经桑黄菌发酵后,与黄芪甲苷结构相似的物质也可转化为异黄芪甲苷.此外,在发酵过程中,中药的某些成分可能会促进或抑制益生菌的生长和代谢,益生菌会通过改变自身的代谢通路来适应新的生长环境,从而产生新的代谢产物,与中药成分相协同,达到改变药性㊁提高药效和产生新的治疗效果等目的.采用罗杰斯无性穗霉(C l o n o s t a c h y sr o g e r s o n i a n a)发酵地不容(S t e p h a n i a e p i g e a e)㊁香青藤(I l l i g e r aa r o m a t i c a)和蒙自青藤(I l l i g e r a h e n r y i),能够使其中的阿朴菲生物碱(如荷包牡丹碱㊁放线瑞香宁㊁罗默碱㊁NＧ甲基六驳碱等)转化为对应的４RＧ羟基阿朴菲生物碱,使二聚单萜苯丙酸(d i m e r i c i l l i g e r a t e sAＧC)转化为活性更佳的二聚单萜[２０].４．３㊀降低中药引起的毒副作用部分中药材具有一定的毒性,如果将其直接应用于临床而不加以处理,对动物机体将构成很大威胁.中药经过益生菌发酵后,药材中的有毒成分会被大量分解或者修饰,从而达到消除或减轻其毒副作用的目的.研究发现,用白巴菌质和灵芝菌质发酵巴豆后,口服急性毒性都降低了４倍左右,安全性大大提高[２１].将草乌进行发酵后,发现乌头碱㊁次乌头碱和新乌头碱等 药性菌质 含量都明显下降,从而使草乌在增强镇痛作用的同时还大大降低了毒性[２２].５７陈柯源等:益生菌发酵中药研究进展４．４㊀改善中药口味中药材经过传统的炮制后,口感相对不太理想,而通过益生菌发酵可去除或减弱苦味,从而在改善口感的同时也不影响药效的发挥[２３],增加动物的采食量和吸收率.４．５㊀调节动物肠道菌群平衡中药益生菌发酵所用的都是益生菌种,动物经饲喂发酵产物的同时,益生菌也进入肠道内进行生长繁殖,维持肠道厌氧环境.此外,益生菌还能大量定植在胃肠道上皮黏膜上,从而竞争性地排斥致病菌.肠道中的某些致病微生物也可被益生菌产生的次生代谢产物杀死,从而更有利于平衡胃肠道菌群和中药有效成分的吸收[２４].研究发现,肉仔鸡经饲喂添加含适量丁酸梭菌双联制剂的饲料后,其盲肠内容物中乳酸菌数量显著上升,同时粪样中大肠埃希菌数量也明显降低,结果表明地衣芽胞杆菌能够促进益生菌在肠道内生长繁殖,使肉仔鸡的肠道菌群维持在正常水平[２５].研究发现,膳食中添加芽胞杆菌有助于消除金黄色葡萄球菌感染,并阻止其在健康个体的肠道中生长[４].４．６㊀增强动物免疫机能中药经发酵后,其有效成分含量提升的同时生物活性也得到增强,并且益生菌在生长过程中所产生的淀粉酶㊁蛋白酶㊁纤维素酶等一系列代谢产物,也有利于分解饲料中的蛋白质㊁脂肪和复杂碳水化合物等成分,其分解产物可被机体迅速吸收,从而提高饲料利用率,达到增强动物免疫机能的目的.研究发现,不同日龄的A A肉鸡经饲喂复方中药混菌发酵制剂后,与空白对照组㊁疫苗对照组和复方中药制剂组相比,红细胞免疫复合物花环率和红细胞C３b受体花环率均显著提高,表明复方中药经混合菌发酵后,红细胞的免疫功能得到显著提高[２６].按比例将六神曲㊁淀粉㊁水与中药复方粉剂混匀发酵后,对１日龄雄性A A肉仔鸡饲喂,结果表明,中药经混合益生菌发酵后,可显著提高３周龄仔鸡的胸腺指数㊁N D抗体水平以及６周龄仔鸡血浆谷胱甘肽过氧化物酶的活性,同时也使６周龄仔鸡腿肌M D A的含量明显降低,说明中药发酵产物可显著改善肉仔鸡的抗氧化机能和免疫机能[２７].４．７㊀中药废渣再利用中药废渣中含有残存的有效成分㊁粗蛋白㊁粗脂肪及矿物质等营养物质以及大量难以降解的物质(如粗纤维和木质素等),直接废弃会造成污染环境及浪费问题,通过益生菌对药渣的再次发酵利用,对环保和药材节约都有着积极的作用.通过给仔猪饲喂发酵中药渣,发现其料重比(F/G)显著低于对照组和抗生素组(P＜０．０５)[２８];发酵中药渣组血液总蛋白和白蛋白含量均显著高于抗生素组(P＜０．０５),发酵中药渣组的甘油三酯和总胆固醇含量均显著低于对照组(P＜０．０５);发酵中药渣组的谷胱甘肽含量及过氧化氢酶和超氧化物歧化酶活性均显著高于对照组(P＜０．０５);中药渣组和发酵中药渣组血液免疫球蛋白G(I g G)㊁I g A㊁I g M含量均显著高于对照组和抗生素组(P＜０．０５),结果表明发酵中药渣在调节断奶仔猪血脂浓度方面可发挥一定的作用,同时可提高断奶仔猪的生长性能㊁抗氧化能力和免疫力,效果优于抗生素,可作为饲料添加剂代替抗生素.５㊀发酵程序的焦点５．１㊀菌种及药材选择益生菌发酵所用菌种必须遵守安全原则(尤其是基因工程菌种),不能产生毒害性物质,同时不能破坏环境固有的生态平衡.菌体在生长代谢过程中可合成一系列小分子物质,如有机酸和小肽等,促进其在培养基中的繁殖生长,同时还能有效降解抗营养因子及大分子物质,这对于保护和维持动物机体内菌群平衡有着重要影响[２９].乳酸菌㊁酵母菌㊁芽胞杆菌㊁双歧杆菌㊁黑曲霉以及各种药用真菌等是目前用于中药发酵的主要益生菌种.菌种种类繁多,因此选择菌种应谨慎,对于各种中药材与发酵菌种的对应关系也应进行深入研究.刘湧涛[３０]通过形态学比较从商品枯草芽胞杆菌中纯化出部分优良菌种,采用C M C刚果红培养基,以透明圈直径和菌种直径筛选出菌种３０株,对３０株进行发酵培养,最终复筛出１０号作为发酵菌种,这表明对于特殊的中药材,选择合适的发酵菌种对发酵结果有着决定性影响.中药包括单味药和复方药,选用合适的中药进行发酵对于现代中药益生菌发酵研究也很关键.将枯草芽胞杆菌分别与５０种中药进行混合发酵,结果发现不同的中药经发酵则表现出不同的抗菌活性,有增加有降低,还有的保持不变,说明并不是所有的中药经发酵后疗效都会增强,可见菌种的选择对于发酵的效率至关重要.５．２㊀发酵工艺的优化利用现代生物技术对发酵过程中的工艺条件(包括培养基组分㊁发酵菌种㊁氧气㊁温度和p H等)进行优化,可显著提高中药有效成分的提取率,同时还可降低药物的毒副作用,产生新的活性物质,从而达到增强药效,节省药材资源,保护环境的目的[３１].用响应面法确定在发酵２４h,黄芪添加量为４g,灭６７动物医学进展㊀２０１９年㊀第４０卷㊀第１２期(总第３１８期)菌１５m i n的发酵条件下,芽胞菌株N G１４发酵黄芪产多糖含量增加了１．５７倍[３２].在研究枯草芽胞杆菌发酵复方中药的工艺优化时发现,在含水量为５１．５０％,接种量３．６０％,发酵时间２．７d的条件下,多糖得率提高了１．５６倍[３３].黑曲霉发酵黄芪提取液的最佳条件为p H５．０㊁发酵温度３０ħ㊁摇床转速１８０r/m i n,发酵时间为６d时,黄芪多糖含量最高为２．４７３g/Lʃ０．０６２g/L.运用植物乳杆菌植物亚种和副干酪乳杆菌K L１对黄芪㊁三七㊁甘草㊁鹰嘴豆复方中药进行发酵,结果最佳发酵工艺条件为p H５．４,接种量５％,发酵温度３４ħ,时间７２h[３４].在此优化条件下,发酵复方中药液的多糖得率为１．１３％,是优化前的１．６５倍,未发酵的２．５１倍.６㊀展望饲料安全问题随饲料产业的快速发展日益受到广泛关注,纯天然㊁无公害㊁无抗生素残留㊁功能全面的发酵中草药饲料添加剂成为国内外研究的热点.在发酵转化过程中,益生菌模拟体内转化过程,促使中药活性成分的充分释放及分解转化,从而使中药药效得到更好的发挥,同时益生菌在发酵过程中产生的一系列活性代谢产物可被机体迅速吸收,增强动物机体抗病力.因此,益生菌发酵中药与中药传统的炮制手段相比,能更大幅度地提升中药药效,缩小用药成本. 康复灵 是通过中药复方混合发酵制成的发酵制剂,试验表明对小鼠肉瘤生长可产生明显的抑制作用.通过发酵黄芪,其多糖得率提高了近５倍,黄芪的用量也只是传统工艺的１/２８,大大降低了药材消耗.近些年,研究人员发现在益生菌新陈代谢过程中,会产生与合成中药活性成分相关的关键酶,因此,利用基因工程技术,可以在中药表达载体中插入相关的酶基因,为中药活性成分的合成提供新的途径.益生菌发酵中药目前已经成为畜牧养殖行业的研究热点,但我国的中药发酵研究目前仍存在着诸多需要解决的问题.例如,研究者大多仍采用单一菌种对中药进行发酵,对混合菌种的应用研究较少,同时,中药发酵前后的成分变化及其药理活性研究同样值得探讨.因此,仍需在中药创新和中药现代化研究中持久不懈的努力,中药益生菌发酵研究才能取得长足的发展.参考文献:[１]㊀胡红伟,段明房,闫凌鹏,等．中药发酵技术及其在畜牧业中的应用[J]．生物化工,２０１７(６):７４Ｇ７７．[２]㊀D o n g W W,X u a nFL,Z h o n g FL,e t a l．C o m p a r a t i v e a n a l y s i s o f t h e r a t s＇g u tm i c r o b i o t ac o m p o s i t i o ni na n i m a l sw i t hd i f f e r e n tg i n s e n o s i d e sm e t a b o l i z i n g a c t i v i t y[J]．J A g r i F o o dC h e m,２０１７,６５(２):３２７．[３]㊀卢㊀伟．黄芩与鼠李糖乳杆菌发酵产物对仔猪大肠杆菌腹泻治疗效果研究[D]．吉林长春:吉林农业大学,２０１６．[４]㊀P i e w n g a mP,Z h e n g Y,N g u y e nT H,e t a l．P a t h o g e n e l i m i n a t i o nb yp r o b i o t ic B a c i l l u s v i as i g n a l l i n g i n t e r f e r e n c e[J]．N a t u r e,２０１８,d o 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n i s t r y o f A g r i c u l t u r e/E n g i n e e r i n g a n dT e c h n o l o g y R e s e a r c hC e n t e r o f T r a d i t i o n a lC h i n e s eV e t e r i n a r y M e d i c i n e o f G a n g s uP r o v i n c e,L a n z h o u,G a n g s u,７３００５０,C h i n a)A b s t r a c t:P r o b i o t i c s h a v e a n i m p o r t a n t i n f l u e n c e o nb a l a n c i n g t h e g a s t r o i n t e s t i n a l f l o r a o f a n i m a l s,a n d t h e y p r o d u c e a v a r i e t y o f a c t i v e e n z y m e s a n d o t h e rm e t a b o l i t e s d u r i n g g r o w t h a n d r e p r o d u c t i o n．T h e e f f e c t i v e a cＧt i v e i n g r e d i e n t s o f t r a d i t i o n a lC h i n e s em e d i c i n e s c a nb e f u l l y u t i l i z e da f t e rb e i n g f e r m e n t e db yp r o b i o t i c s, w h i c hc a na l s o p r o m o t ea n i m a l g r o w t ha n d i m p r o v e i mm u n i t y,h a v e t h ea d v a n t a g e so fn or e s i s t a n c e,l o w r e s i d u e,g r e e n,s a f e t y,e t c,a n db e a n i d e a l f e e d a d d i t i v e f o r r e p l a c i n g a n t i b i o t i c s,t h e d e v e l o p m e n t p r o s p e c t i n a n i m a l h u s b a n d r y i sv e r y b r o a d．T h i s a r t i c l e e x p o u n d e d p r o b i o t i c f e r m e n t i n g t r a d i t i o n a lC h i n e s em e d i c i n e s f r o mt h em e c h a n i s m s,t y p e s,c h a r a c t e r i s t i c s,s t r a i ns e l e c t i o no f p r o b i o t i c sa n dc o n d i t i o no p t i m i z a t i o n,e t c, w h i c h p r o v i d e s t h e t h e o r e t i c a l b a s i s f o r t h e d e v e l o p m e n t o f n e wf e e d a d d i t i v e s．K e y w o r d s:p r o b i o t i c;f e r m e n t a t i o n;t r a d i t i o n a l C h i n e s em e d i c i n e;f e e d a d d i t i v e８７动物医学进展㊀２０１９年㊀第４０卷㊀第１２期(总第３１８期)。

提高液体培养枯草芽孢杆菌芽孢产率的研究作者：王昭懿张鲲周丽媛来源：《农产品加工·上》2019年第10期摘要：以芽孢产率为指标，采用单因素试验和正交试验，考查不同无机盐、pH值、装液量、培养时间、接种量对枯草芽孢杆菌产芽孢影响，对其液体发酵培养基和培养条件进行筛选和优化。

结果表明，枯草芽孢杆菌最优产孢培养基配方为无水氯化钙0.15 g，七水硫酸镁0.40 g，四水氯化锰0.40 g，硫酸氢二钾0.30 g;最优产孢培养条件为初始pH值7，装液量125mL/250 mL，培养时间3 d，接种量4%，优化后枯草芽孢杆菌芽孢产率达72.1%。

关键词：枯草芽孢杆菌;芽孢产率;液体培养;优化培养中图分类号：TQ920.6 ; ; 文献标志码：A ; ; doi：10.16693/ki.1671-9646（X）.2019.10.004Abstract：Using the method of single factor and orthogonal experiment，the effects of different inorganic salts，pH value，loading amount，culture time，inoculation amount and external interference on the formation of Bacillus subtilis were investigated，and the liquid fermentation medium and culture conditions were screened and optimized. The experiment finally determined that the optimal sporulation medium of Bacillus subtilis was：anhydrous calcium chloride 0.15 g，magnesium sulfate heptahydrate 0.40 g，manganese chloride tetrahydrate 0.40 g，dipotassium hydrogen sulfate 0.30 g per 100 mL medium. The optimal sporulation culture conditions were：initial pH value 7，liquid volume 125 mL/250 mL，culture time 3 d，inoculum volume 4%. After optimization，the yield of Bacillus subtilis spores was 72.1%，which greatly increased the spore yield.Key words：Bacillus subtilis;spore yield;liquid culture;optimized culture枯草芽孢杆菌是一种典型的革兰氏阳性好氧菌，具有很强的酶活性，并且对人畜安全，是一种环境友好型菌种且能形成芽孢[1]。

微生态制剂生产工艺
1、生产工艺
目前，益生菌的生产工艺主要有两种：固体表面发酵法和大罐液体发酵法。

固体表面发酵法：是把固体表面培养的菌泥与载体按比例混合经干燥制成。

此法产量低，劳动强度大，易受杂菌污染，不适于工业化生产，但投资少。

大罐液体发酵法：其工艺流程为：菌种接种培养→种子罐培养→生产罐培养→排放培养液加入适量载体→干燥→粉碎→过筛→质检→益生素产品。

此法适于工业化生产，便于无菌操作，但成本高。

2、加工处理技术
芽孢杆菌、乳酸菌、酵母菌等不同菌种对环境因素的耐受力不同，但其作为益生菌产品中的活性成分，效能各有特色，难以取舍。

人们已研究一些保护方法，如包埋、微囊化等等，取得了令人满意的结果。

但成本增高，生产过程也复杂。

美国内布斯加大学的一项研究表明，日粮中添加油脂可在一定程度上保护酵母菌免遭制粒的破坏。

随基因工程的发展，将芽孢菌中的芽孢移植到无芽孢的乳酸菌属上，使之变成耐高温的菌种，或者从菌种的组合和筛选方面考虑以芽孢杆菌属替代乳酸菌属，便可以从根本上解决制粒过程中微生物受到破坏的问题。

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目前，市应用较多、效果较好的是以芽孢杆菌为主的复合型益生菌。

即使制粒过程中象乳酸菌、酵母菌等活菌大部分损失，但培养物
中的乳酸、维生素b族及优质蛋白仍可与芽孢杆菌一起发挥良好的功效。

所以，筛选耐受性更好，功能更强的菌株，一直是益生菌使用技术领域一重要课题。

一株植物乳酸杆菌的高密度发酵金双喜1 ,韩羿斌2( 1. 大连医科大学,辽宁大连116044; 2. 陕西科技大学生命科学与工程学院,陕西西安070000 )【摘要】目的研究一株植物乳酸杆菌的高密度发酵。

方法通过单因素实验来确定此植物乳酸杆菌的最适生长温度、pH、碳源、氮源、缓冲盐等。

结果最适生长温度是37 ℃、起始pH 6. 4、最适碳源为葡萄糖、最适氮源为牛肉膏,通过对缓冲盐的选择最终确定N a A c∶CaCO3 比为0. 5 ∶1. 5; 控制发酵条件,结合优化培养基,可使发酵后的培养液达到2. 75 ×1010 CFU /m l。

结论该缓冲盐能够有效的缓解发酵液pH 的下降,延长对数生长期,使活菌数提高1倍,适合高密度发酵培养。

【关键词】植物乳酸杆菌;缓冲盐;高密度发酵【中图分类号】R378. 992 【文献标识码】AH i gh2den s ity fer m en t a t i on of a L a c toba c ill u s p l a n ta rumJ IN Shuang2xi1 , HAN Yi2b i n2( 1. D a lian M ed ica l U n i versity, D a lian 116044, Ch ina; 2. Co llege of L ife S cience and Eng i neering, S hanx i S cience U n iver sit y, X i ’a n 070000, Ch ina)【A b s tra c t】O b j ec t i ve To re s ea r ch h i g h2den s ity fe r m e n t a t i o n of a L a ctobacillus p lan ta r u m. M e t hod s The op t i2 m u m gr ow th temp e ra tu re, pH va lue, ca rb on and n itr og en sou rce s, the buffe r sa lt of th is L act o bacillus p lan ta r u m we r e d e t e r2 m ined by the single fac to r exp e ri m en t.Re su l ts The op ti m u m gr ow th temp e ra t u re wa s 37 ℃, in itia l pH va lue wa s 6. 4 , the op ti m u m ca r b on s ou r ce wa s gluco se, the op ti m u m n i trog en s ou r ce wa s beef extrac t. D e t e r m ined the ra t io of N a A c∶CaC O3 wa s0. 5∶1. 5 th r oug h the cho i ce of buffe r sa l t exp e r i m e n t.C o n c l u s i o n Con t r o l fe r m e n t a t ion cond i ti o n s and com b i na t e the op t i2m ized m ed iu m can a l low the fe r m e n t a t ion m e d i u m to 2. 75 ×1010 CFU /m l.【Key word s】L a ctobacillus plan ta ru m ; Op t i m ized m e d i u m; H ig h2den s ity fe r m e n t a t i o n植物乳杆菌(L. p lan ta rum )属于乳杆菌科中的乳杆菌属[ 1 ] ,革兰阳性,最适生长温度为30 ～37 ℃,能在10 ℃生长, 45 ℃不生长,兼性厌氧,在pH 4. 5 ～9. 5生长,最适pH 6. 5 左右。

益生菌制剂生产益生菌是一类对宿主有益的活性微生物，是定植于人体肠道、生殖系统内，能产生确切健康功效从而改善宿主微生态平衡、发挥有益作用的活性有益微生物的总称。

由益生菌生产的产品叫益生菌制剂，包括活菌体、死菌体、菌体成分及代谢产物。

这种制品能改善机体微生物和酶的平衡，并刺激特异性或非特异性免疫机制，达到防治某些疾病、促进发育、增强体质、延缓衰老的目的。

一、益生菌制剂常用菌种用于益生菌制剂生产的菌种很多，主要包括以下三大类。

1．乳酸菌类如嗜酸乳杆菌、干酪乳杆菌、植物乳杆菌、双歧杆菌等为多种动物肠道菌群的主要成员，在微需氧或厌氧条件下生长，可分泌乳酸及短链脂肪酸，合成B 族维生素，有较强的耐酸性，可耐受胃内低pH，抑制大肠杆菌、沙门菌在肠道的定植、吸附和繁殖，中和毒性产物，抑制氨和胺的合成，增强免疫力。

2．芽孢杆菌类地衣芽孢杆菌、短小芽孢杆菌、枯草芽孢杆菌、蜡样芽孢杆菌等，具有蛋白酶、脂肪酶、淀粉酶活性，富含多种氨基酸，该类制剂多以芽孢状态存在，在肠道环境不增殖，只在肠道上部迅速发育转变成营养细胞。

3．酵母菌类酵母菌在胃肠道内大量繁殖可以有效改善胃肠内环境和菌种结构，促进乳酸菌等有益菌群繁殖及活力保持，提高胃肠对食物营养物质的分解和利用。

同时还能有效抑制病原微生物繁殖，增强机体免疫力和抗病力，对防止消化系统疾病发挥有益作用。

主要应用的有酿酒酵母和石油酵母等。

二、食品级益生菌制剂的类型食品级益生菌制剂是指含有对人体健康具有生理功能，起到保健或治疗作用的有益微生物或其代谢产物的生物制品。

目前人用益生菌制剂已有近百种之多，从成分上看有的是单纯活菌制剂，而有些除益生菌外还配合有双歧因子及其他成分，组成复合制剂；活菌制剂中有的是单菌，也有的是由多种菌组成；从剂型上看有片剂、胶囊、冲剂及液态制剂，包括乳品饮料、口服液等。

三、益生菌制剂生产工艺及要点益生菌制剂生产工艺依各自产品类型、益生菌种特性不同而不同，以下以乳酸菌益生菌制剂生产为例做一简单介绍。

一种巨大芽孢杆菌的液体发酵工艺其特征在于：包括下述步骤：（１）、配料：蛋白质及碳水化合物原辅料由质量比为１０－１２％的淀粉、４－６％的蔗糖、１－３％的蛋白胨、０．１－０．３的酵母膏、０．８－１．２％的硫酸铵、０．４－０．６％的硫酸镁和其余的水所组成，将蛋白质及碳水化合物原辅料、水和氢氧化钠送进物料混合罐，边送边混合，直至混合均匀，使原辅料的固体物浓度为３０－３５％，原辅料的ＰＨ值为６．２－７．０；（２）、种子罐空消和实消：先消毒空罐，后装入原辅料消毒实罐，以过热蒸汽消毒，消毒温度为１１５－１２６℃，罐压为０．１１－０．１３ＭＰａ，时间为３０－４０分钟；（３）、接种：实消后，以管道冷却水冷却物料，至２６－３０℃时，按原辅料质量比的１－２％的比例接种巨大芽孢杆菌的种子；（４）种子罐发酵：发酵温度控制在２８－３０℃，通入无菌空气的流量前十小时为原辅料体积Ｘ（０．４～０．６）／小时，以后为原辅料体积Ｘ（０．９－１．１）／小时，发酵时间为４０－４８小时；（５）发酵罐空消和实消：先消毒空罐，后装入原辅料消毒实罐，以过热蒸汽消毒，消毒温度为１１５－１２６℃，罐压为０．１１－０．１３ＭＰａ，时间为３０－４０分钟；（６）接种：实消后，以管道冷却水冷却物料，至２６－３０℃时，按原辅料质量比的８－１２％接种种子罐发酵所得的巨大芽孢杆菌的种子；（７）、发酵罐发酵：发酵温度控制在２８－３０℃，通入无菌空气的流量前十小时为原辅料体积Ｘ（０．４－０．６）／小时，以后为原辅料体积Ｘ（０．９－１．１）／小时，发酵时间为４０－４８小时；（８）打开出料阀出料进入储料罐以备用。

一种巨大芽孢杆菌的液体发酵工艺，它包括：（１）配料：原辅料固体物浓度３０－３５％，ｐＨ值６．２－７．０；（２）种子罐消毒：温度１１５－１２６℃，罐压０．１１－０．１３ＭＰａ，时间３０－４０分钟；（３）２６－３０℃时，按原辅料质量比的１－２％接种种子；（４）种子罐发酵：温度２８－３０℃，无菌空气的流量十小时前、后分别为（０．４－０．６）和（０．９－１．１）原辅料体积／小时，时间４０－４８小时；（５）发酵罐消毒，工艺同（２）；（６）按原辅料质量比的８－１２％接种种子罐种子，余同（３）；（７）发酵罐发酵，同（４）；（８）出料。

益生菌的工艺技术益生菌是指对人体有益的菌种，具有调节人体生理功能、增强免疫力、促进肠道健康等作用。

随着人们健康意识的增强，益生菌的市场需求不断提高。

因此，益生菌的工艺技术的研究和发展变得至关重要。

一、菌种筛选和培养技术益生菌的工艺技术的核心之一是菌种的筛选和培养技术。

通过采集和分离自然界中的益生菌，可以利用一系列育种技术对菌种进行筛选和培养。

在菌种筛选方面，要求益生菌具有耐高温、耐酸、胆盐以及抗生素等特性，以能在胃酸等逆境环境中存活和繁殖。

在菌种培养方面，可以采用液体发酵、固态发酵等方法，通过提供适宜的培养基、温度、pH值、氧气供应等条件，使菌种快速繁殖并维持良好的生长状态。

二、发酵工艺技术益生菌的发酵工艺技术是益生菌工艺的关键环节。

在发酵过程中，益生菌要始终保持活性，且产生足够的活性代谢物。

常用的发酵方式包括常规发酵、乳酸发酵、醋酸发酵、凝胶包埋发酵等。

常规发酵是最为传统的发酵方式，通过定义的发酵基质和菌种，利用发酵罐等设备将其置于适宜的温度、湿度和通气条件下进行发酵。

乳酸发酵是将益生菌与乳酸菌联合发酵，产生的乳酸有助于维持菌群平衡。

醋酸发酵则是通过添加适量的醋酸菌和发酵基质，利用醋酸发酵罐进行发酵，产生的醋酸和益生菌都具有调节肠道菌群的作用。

凝胶包埋发酵是将益生菌包埋在凝胶中，保护菌种的活性，并控制菌种的释放速度。

三、产品制备技术益生菌的产品制备技术是将发酵得到的益生菌进行分离、纯化和制剂化的过程。

首先，通过离心和过滤等方法将发酵液中的菌体和代谢物分离。

然后，通过冷冻干燥、喷雾干燥等方法将菌体冻干或者干燥成粉末，以提高产品的稳定性。

此外，还可以通过固态发酵得到的益生菌菌饼进行粉碎和包埋等处理，制成更为方便携带和使用的益生菌产品。

最后，将益生菌制剂按照一定的比例和标准制备成片剂、胶囊、粉剂等形式，以满足不同人群的需求。

综上所述，益生菌的工艺技术包括菌种筛选和培养技术、发酵工艺技术以及产品制备技术等内容。