第14章基因重组和基因工程

mApoCⅡ
2. 克隆载体的修饰
⑴. 限制性核酸内切酶的选择与酶切 ⑵. 配伍末端的形成
限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：
钝性末端(blunt end) 粘性末端(sticky end)
H indIII
B am HI
GTCGAC GGATCC CAGCTGCCTAGG
GT+G CAC CAC GTG
G +GATCC CCTAGG
1. 碱性磷酸酶 2. 多核苷酸激酶 3. 末端转移酶
5. 宿主细胞
1. 宿主细胞分为原核细胞与真核细胞， 由于原核细胞操作简单，遗传背景清 楚，故常用的为大肠杆菌等原核细胞。
2. 宿主细胞特别是宿主菌要安全，不会 造成疾病的传播。
3. 具有限制酶和重组酶缺陷。 4. 操作简便。 5. 5. 常用的大肠工程菌: E. coli DH5α
PCR的反应体系：模板DNA、特异 性引物、DNA聚合酶、dNTP及含有Mg2＋ 的缓冲液。
外显子拼接法扩增人ApoCⅡ成熟肽编码基因
Exon3 Pa
intron3 Pc
Exon4
PCR Pb Pa
Pd PCR
上游片段AB 下游片段CD Pd
PCR
全编码序列
限制性核酸内切酶作用后产生两种末端：
用前景。
重组DNA技术
第一节 概述 第二节 重组DNA基本原理 第三节 重组DNA技术在医学中
的应用
第一节 概述
一. 基因工程建立和发展的 基础
二. 面临新挑战，解决新问 题
三. 相关的基本概念
一. 基因工程建立和发展的基础
1. 分子生物学的理论发展
DNA结构和功能的深入认识 遗传信息中心法则的确立

第十四章基因重组和基因工程一、自然界的基因转移和重组：基因重组(gene recombination)是指DNA片段在细胞内、细胞间，甚至在不同物种之间进行交换，交换后的片段仍然具有复制和表达的功能。

1．接合作用：当细胞与细胞相互接触时，DNA分子即从一个细胞向另一个细胞转移，这种遗传物质的转移方式称为接合作用（conjugation）。

2．转化和转染：由外来DNA引起生物体遗传性状改变的过程称为转化(transformation)。

噬菌体常常可感染细菌并将其DNA注入细菌体内，也可引起细菌遗传性状的改变。

通过感染方式将外来DNA引入宿主细胞，并导致宿主细胞遗传性状改变的过程称为转染(transfection)。

转染是转化的一种特殊形式。

3．整合和转导:外来DNA侵入宿主细胞，并与宿主细胞DNA进行重组，成为宿主细胞DNA的一部分，这一过程称为整合。

整合在宿主细胞染色体DNA中的外来DNA，可以被切离出来，同时也可带走一部分的宿主DNA，这一过程称为转导(transduction)。

来源于宿主DNA的基因称为转导基因。

4．转座：转座又称为转位（transposition），是指DNA的片段或基因从基因组的一个位置转移到另一个位置的现象。

这些能够在基因组中自由游动的DNA片段包括插入序列和转座子两种类型。

⑴插入序列：典型的插入序列（insertion sequence，IS）是长750-1500bp的DNA片段，由两个分离的反向重复序列和一个转座酶基因。

当转座酶基因表达时，即可引起该序列的转座。

其转座方式主要有保守性转座和复制性转座。

⑵转座子：转座子(transposons)是可从一个染色体位点转移到另一个位点的分散的重复序列，含两个反向重复序列、一个转座酶基因和其他基因（如抗生素抗性基因）。

免疫球蛋白重链基因由一组可变区基因（VH）和一组恒定区基因（CH）构成，通过这些基因的选择性转座和重组，就可以转录表达出各种各样的免疫球蛋白重链，以对付不同的抗原。

第14章基因重组和基因工程2
•一、同源重组是最基本的DNA重组方式
➢ 发生在同源序列间的重组称为同源重组 (homologous recombination)，又称基本重 组（general recombination）。是最基本的 DNA重组方式，通过链的断裂和再连接， 在两个DNA分子同源序列间进行单链或双 链片段的交换。
第14章基因重组和基因工程2
•DNA重组 •同源重组 (homologous recombination) • 接合作用 (conjugation) • 转化作用 (transformation) • 转导作用 (transduction) •位点特异重组(site-specific recombination) •转 座重组 (transposition recombination)
第14章基因重组和基因工程2
•（二）细菌的特异位点重组
•沙门菌H片段倒位决定鞭毛相转变。
第14章基因重组和基因工程2
➢ hix为反向重复序列，它们之间的H片段 可在Hin控制下进行特异位点重组(倒位)。 H片段上有两个启动子P，其一驱动hin基 因 表 达 ， 另 一 正 向 时 驱 动 H2 和 rH1 基 因 表 达 ， 反 向 ( 倒 位 ) 时 H2 和 rH1 不 表 达 。 rH1为H1的阻遏蛋白基因。
➢ 以E.coli的同源重组为例，了解同源重组机 制的Holliday模型。
第14章基因重组和基因工程2
Holliday模型的4个关键步骤：
➢ 两个同源染色体DNA排列整齐； ➢ 一个DNA的一条链断裂、并与另一个DNA
对应的链连接，形成Holliday中间体； ➢ 通过分支移动产生异源双链DNA； ➢ Holliday中间体切开并修复，形成两个双链

• 细菌的基因转移包括接合、转化、转导
作用等，在这些过程中不同DNA分子间发
生的共价连接即为重组。
• 重组DNA（基因克隆）技术是应用酶学 的 方法, 在体外将目的基因与载体DNA接
合成复制子，再导入宿主细胞，筛选出
含有目的基因的转化子，经扩增提取获
得大量同一DNA分子。
• 重组DNA技术的基本过程可概括为“分、 切、接、转、筛”。
• 限制性核酸内切酶
• DNA聚合酶I
• 逆转录酶
• T4DNA 连接酶
• 碱性磷酸酶
• 末端转移酶
• Taq DNA聚合酶
限制性核酸内切酶(restriction endonuclease)：识别DNA的特异序列, 并在识别位点或其周围切割双链DNA 的一类内切酶。
BamHⅠ GGATCC CCTAGG G GATCC CCTAG + G
原 位 杂 交
2、非直接选择法：
免疫学方法：如免疫化学方法
酶免检测法
• 重组DNA技术简单概括为：
“分、切、接、转、筛”
第三节 重组DNA技术与医学的关系
（一）疾病基因的发现与克隆 （二）生物制药 （三）基因诊断 （四）基因治疗
（五）遗传病的预防
小
结
• 自然界基因转移伴发重组的形式有多种。
的受体分子（转化子）
（一）目的基因的获取 1、化学合成法
要求：已知目的基因的核苷酸序列或其
产)
组织或细胞染色体DNA
限制性内切酶 基因片断 克隆载体 重组DNA分子 受体菌基因组DNA：在真核生物体，基因组是
指一套完整单倍体DNA（染色体DNA）和 线粒体DNA的全部序列。
（四）基因载体（克隆载体）：为携带目 的基因，实现其无性繁殖或表达有意义 的蛋白质所采用的一些DNA分子。