聚合酶链反应及其应用

一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。

2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。

二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。

这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA 片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。

它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。

PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。

细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。

参与复制的有多种因素。

PCR 是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。

每完成一个循环需2～4分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

三、实验试剂与器材模板DNA、2.5mmol/L dNTPTaq DNA聚合酶（5U/μL）、SSR引物10 ×buffer、15mmol/L Mg2+、ddH2OPCR仪、移液枪、PCR板四、实验步骤1、配制20μL反应体系，在PCR板中依次加入下列溶液：模板DNA 2μL引物1 1μL引物2 1μLdNTP 1.5μLMgCl2 2μL10×buffer 2μLddH2O 10μLTaq酶0.5μL2、设置PCR反应程序。

聚合酶链式反应技术及应用作者：东锐来源：《绿色科技》2018年第08期摘要：指出了聚合酶链式反应是目前的一种最基本也是应用最广泛的技术。

由于PCR反应的快速、灵敏、操作简便等优点使其在短短的数年时间即被广泛应用于各大领域。

介绍了PCR反应的原理以及常用的PCR反应技术，探讨了该技术在医学、食品工业、环境监测、农业中的运用，以期提供参考。

关键词：聚合酶链式反应;技术;应用中图分类号：TS907文献标识码：A文章编号：16r 4-9944（2018）8-0230-021 引言20世纪80年代中期，Mullis发明了体外核酸扩增技术——聚合酶链式反应，又称PCR （ PolymeraseChain Reaction）反应。

PCR反应是一种在生物体外模拟生物体内复制进行特定的DNA片段的放大扩增的分子生物学技术。

PCR反应具有特异性强、灵敏度高、易重复、简便、快速等突出优点使其在短短的数年时间即被广泛应用于各大领域如医学诊断、环境监测、食品行业、农业、基因工程等。

笔者将从PCR反应的原理、技术及应用方面进行综述。

2 PCR反应的原理DNA的半保留复制，具有高度的保真性，保证亲代DNA和了代DNA具有相同的遗传信息，为维持物种的稳定性和连续性起着非常重要的作用。

PCR反应的基本原理就是模拟DNA 的体内复制过程进行DNA的体外扩增，通过设计特异性引物快速扩增所需的目的DNA序列。

该技术是在模板DNA、dNTP mix、特异性引物、耐热的DNA聚合酶（Taq酶）和含Mg2+的缓冲液存在下的酶促反应，反应需在PCR仪中完成。

PCR反应通常由变性、退火、延伸3个阶段构成：①变性。

酶促反应体系的温度加热至90～95℃，模板DNA双链变性解离成单链DNA;②退火。

温度降至50～55℃，引物与单链DNA结合，形成局部双链;③延伸。

反应体系的温度升高至72℃，以dNTP为原料，经热稳定的Taq酶的催化，合成一条与模板链互补的新DNA链。

PCR应用于遗传病的原理1. 什么是PCR？PCR（聚合酶链式反应，Polymerase Chain Reaction）是一种常用的分子生物学技术，用于扩增DNA片段，从而能快速、高效地产生大量目标DNA序列。

2. PCR在遗传病研究中的应用PCR在遗传病研究中的应用相当广泛。

它可以用于诊断遗传病的检测、疾病的遗传风险评估、基因突变的筛查、克隆特定基因等。

3. PCR的原理PCR主要由以下三个步骤组成：变性、退火和延伸。

3.1 变性（Denaturation）PCR反应开始时，将待扩增的DNA样品加热至94-96°C的高温。

高温会使DNA的双链解开，变为两条单链。

3.2 退火（Annealing）在变性步骤之后，PCR反应体系会降温至50-65°C，使引物（primer）能够与待扩增DNA的两个末端部分互相结合。

引物是短的DNA片段，它们的序列与待扩增DNA的两端互补。

引物的结合会导致新的DNA链合成起点的形成。

3.3 延伸（Extension）在退火步骤之后，PCR反应体系会加入DNA聚合酶、四个脱氧核苷酸（dNTPs）和盐溶液。

此时，DNA聚合酶会沿着引物延伸，合成与待扩增DNA互补的新DNA链。

这一步骤的温度约为72°C。

经过这三个步骤的循环反复进行，就可以扩增出大量的目标DNA序列。

3.4 PCR扩增的关键因素PCR扩增的关键因素包括模板DNA浓度、引物浓度、延伸时间、退火温度等。

合理选择这些因素可以保证PCR反应的准确性和高效性。

4. PCR扩增与遗传病诊断PCR扩增技术在遗传病的诊断中起着重要作用。

以下是PCR在遗传病诊断中的应用：•突变筛查：PCR可以检测特定突变位点的存在与否，从而判断个体是否携带突变基因。

•基因拷贝数变异：PCR可以检测基因拷贝数变异，判断某些基因的拷贝数量是否正常。

例如，在某些遗传性疾病（如遗传性失聪）中，可以通过PCR检测特定基因的拷贝数变异。

amos聚合酶链式反应
Amos聚合酶链式反应（Amplification of Multiple Targets for Nucleic Acid Sequencing）是一种基于聚合酶链式反应（PCR）的方法，用于同时扩增多个靶标的核酸序列。

它可以在单个反应体系中同时扩增数十至数百个靶标序列，具有高度的多重并行性和高效性。

Amos聚合酶链式反应的原理与传统PCR类似，但是在反应过程中引入了多个引物对，每个引物对应一个靶标序列。

通过在PCR反应体系中添加多个引物对，可以同时扩增多个靶标序列。

Amos聚合酶链式反应的应用非常广泛，特别适用于高通量测序、基因组学研究、疾病诊断等领域。

它可以快速、准确地扩增多个靶标序列，可以有效地提高测序效率和准确性，同时节省时间和成本。

Amos聚合酶链式反应是一种高效的核酸扩增技术，可以同时扩增多个靶标序列，广泛应用于生物学研究和临床诊断中。

聚合酶链式反应原理和应用
聚合酶链式反应原理是双链DNA在多种酶的作用下可以变性解旋成单链，在DNA聚合酶的参与下，根据碱基互补配对原则复制成同样的两分子拷贝。

聚合酶链式反应技术应用广泛，在很多领域都有应用，如：
1.分子生物学和基因组学：用于扩增特定的DNA片段，对目的基因进行体外
扩增和克隆。

2.临床和诊断：用于检测和鉴定DNA序列，进行基因突变分析、基因分型
等。

3.生物技术和基因工程：用于构建转基因动物和植物，进行基因敲除、基因
沉默等。

4.分子进化：用于研究DNA序列的进化关系，分析物种之间的亲缘关系。

5.医学和临床：用于检测和鉴定遗传性疾病的基因序列，进行产前诊断和基
因治疗等。

PCR技术原理及其应用【摘要】聚合酶链反应（PCR）技术，是八十年代中期发展起来的新技术，它的诞生改变了分子生物学研究的指导方法。

由高温变性、低温退火（复性）及适温延伸等几步反应组成一个周期，循环进行，使目的DNA得以迅速扩增，具有特异性强、灵敏度高、操作简便、省时等特点。

因此，PCR技术在建立的短短几十年中，便迅速进入生命科学、医学研究、遗传工程、法医学、考古学、人类学等领域，并取得丰硕成果。

【关键词】PCR原理，PCR技术的应用一、PCR技术原理PCR技术是一种特异性DNA序列的体外酶促合成方法。

其基本点是重复利用扩增引物，以扩增的目标序列为模板，在DNA聚合酶作用下进行体外目标序列的合成。

一个循环周期包括三个步骤，即模板DNA变性，一定温度一定时间使靶序列双链解离成单链；引物与靶序列退火，一定温度一定时间使两个引物分别结合到靶序列DNA两条链的3’末端；引物延伸，引物沿靶DNA3’末端向5’末端延伸。

这样三步形成一个循环，并且，前一循环的产物作为后一循环的模板，使靶序列呈指数倍数进行扩增。

1、PCR技术操作的反应体系（1）扩增缓冲液标准的缓冲液含10mM Tris·HCl ，pH 为8.3-9.0（室温），而在延伸温度（72 ℃）下，pH 值接近 7.2 。

缓冲液中含有一种二价阳离子，用于激活 DNA 聚合酶的活性中心，一般使用Mg2+ ，有时使用 Mn2+ 。

一般以 MgCl2 的形式提供，标准浓度为 1.5mM 。

Mg2+ 浓度的高低会影响扩增的特异性和产率。

缓冲液中还含有 50mM 的钾离子。

有些缓冲液中还加入一些添加剂和共溶剂可降低错配率，提高富含 G+C 模板的扩增效（2）脱氧核苷三磷酸（dNTP）脱氧核苷三磷酸是 DNA 合成的底物，标准的 PCR 反应体系中含有等摩尔浓度的 4 种 dNTP ，即 dATP、dTTP、dCTP 和 dGTP ，终浓度一般为 200mM（即饱和浓度）。

聚合酶链式反应简介聚合酶链式反应（PCR）是一种重要的分子生物学技术，被广泛应用于基因分析、基因工程、医学诊断等领域。

PCR 能够快速、高效地扩增特定DNA片段，使得原本数量有限的DNA样本得以增加，从而便于进行后续实验。

PCR的核心原理是利用DNA聚合酶酶活性，通过不断重复三个步骤（变性、退火、延伸），在适宜的反应条件下，将目标DNA序列扩增至数百万份的数量。

依靠PCR技术，无需使用传统的细菌培养方法，仅需少量DNA样本和简单的实验设备，即可实现高效扩增目标DNA。

PCR反应步骤反应体系构建PCR反应所需的关键成分包括目标DNA模板、DNA聚合酶、引物（primer）、核苷酸和反应缓冲液。

引物是一对短的DNA片段，其序列与目标DNA序列上的起始和终止部分的互补序列匹配。

反应缓冲液是维持PCR反应过程中所需酶活性的化学平衡和适宜pH的缓冲物质。

变性PCR反应开始时，反应体系中的DNA样本被放置在高温环境中（通常为94-98摄氏度），使其双链DNA解离为两条单链DNA。

这个步骤可以通过加热反应体系来实现，高温会断裂氢键，使DNA的双链解开。

退火在反应体系降温至适宜的温度范围时（通常为50-65摄氏度），引物与目标DNA序列上的互补区域结合形成稳定的双链结构。

引物的选择非常重要，其应与目标DNA序列完全匹配，以确保选择性扩增。

延伸DNA聚合酶将新的核苷酸从反应缓冲液中获得，并在目标DNA的3’末端上依次加入。

这个过程被称为延伸，其速率与延伸温度和所用聚合酶的酶活性相关。

通常延伸温度为60-72摄氏度。

经过以上三个步骤的循环反复进行，每一轮都会使目标DNA序列数量翻倍。

因此，PCR可以在短时间内扩增出大量的目标DNA片段。

PCR应用PCR技术在生物学研究、医学诊断、疾病预防和基因工程等领域有着广泛的应用。

基因分析PCR被广泛用于分析基因的结构和功能。

通过PCR，可以快速扩增出感兴趣的DNA片段，然后进行测序分析、限制性酶切或其他分子生物学实验，以研究目标基因的结构和功能。

聚合酶链反应技术原理及应用作者：冯帅博来源：《中国新技术新产品》2019年第14期摘; 要：该文主要围绕聚合酶链式反应技术的原理和应用进行叙述，其中对聚合酶链式反应的内涵、原理、特点等进行了详细分析，然后对该技术的主要应用内容展开了详细剖析。

该文旨在提升聚合酶链式反应技术的应用水平，不断加深相关人员对其的理解和认知，在这个过程中不断激励相关人员展开研究，推动其被广泛应用于人们生产和生活的各个方面。

关键词：聚合酶链式反应;技术原理;DNA中图分类号：Q555; ; ; ; 文献标志码：A0 前言聚合酶链式反应是近几年被研究员发现的一种新型的实验室技术，它主要属于分子生物学领域，但是随着相关技术和经济的不断发展，人们对生产和生活有了更高的要求，不断推动新技术的发展和应用，目前，聚合酶链式反应技术已经逐渐被应用在医学、生物学等众多领域的研究工作中，对于其进步和发展有重要意义。

1 关于聚合酶链式反应1.1 聚合酶链式反应的内涵聚合酶链式反应作为一种分子生物学技术，可以完成DNA片段的扩增工作，它最突出优势就是可以脱离生物，在生物体外开展DNA的复制工作，并且可以将少数、微量的DNA进行很大程度地扩增，对于很多鉴定和研究工作都有着重要意义，只要相关人员从古生物体中提取出一点DNA，应用聚合酶链式反应技术就可以实现鉴定工作。

1.2 聚合酶链式反应的技术原理DNA的半保留复制工作有利于传代和生物进化，而在反应过程中双链性质的DNA可以在一定条件下完成向单链的转变，通常情况下，其在高温的情况下也可以发生变化，但是高温同样会使DNA聚合酶丧失活性，而为了避免成本不断上升，相关人员在之后的反应中一直采用的是耐高温性质的DNA聚合酶。

1.3 聚合酶链式反应的循环参数聚合酶链式反应过程中的循环参数有很多，其中为了控制预变性，相关人员需要对加热的时间进行严格控制，保证DNA模板完全发生变形和DNA聚合酶完全被激活;变性步骤以及引物退火等工作都是需要相关人员不断提高注意力，并且相关人员还应当注意引物延伸、循环数和最后延伸方面的反应。

PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国PE Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。

这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。

它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DNA重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。

详细实验方法•PCR技术原理、实验步骤和应用实验材料•模板DNA试剂、试剂盒•dNTP•Taq DNA聚合酶•ddH2O•PCR缓冲液•随机引物•MgCl2仪器、耗材•PCR仪•移液枪•PCR板•薄壁管•EP管一、实验目的1.掌握聚合酶链式反应的原理。

2. 掌握移液枪和PCR仪的基本操作技术。

二、实验原理PCR技术，即聚合酶链反应（polymerase chain reaction，PCR）是由美国P E Cetus公司的Kary Mullis在1983年（1993年获诺贝尔化学奖）建立的。

这项技术可在试管内的经数小时反应就将特定的DNA片段扩增数百万倍，这种迅速获取大量单一核酸片段的技术在分子生物学研究中具有举足轻重的意义，极大地推动了生命科学的研究进展。

它不仅是DNA分析最常用的技术，而且在DN A重组与表达、基因结构分析和功能检测中具有重要的应用价值。

PCR可以被认为是与发生在细胞内的DNA复制过程相似的技术，其结果都是以原来的DNA为模板产生新的互补DNA片段。

细胞中DNA的复制是一个非常复杂的过程。

参与复制的有多种因素。

PCR是在试管中进行的DNA复制反应，基本原理与细胞内DNA复制相似，但反应体系相对较简单。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：①模板DNA的变性：模板D NA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；②模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至5 5℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；③引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。