蛋白质盐析和变性的比较课件

Pr+ 醋酸铅或硫酸铜 沉淀
4、生物碱试剂：
Pr+ 鞣酸或苦味酸 沉淀
观察加水
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实验注意事项
(1).在操作过程中试管不能冲向他人以防止烫伤。 (2).操作强酸时要注意，吸管使用要规范。 (3).双缩脲反应铜离子不能多加，否则与氢氧化
钠形成蓝色的氢氧化铜，干扰试验结果。 (4).实验报告各部分内容都要包括，实验结果如
实验一 蛋白质的性质实验
王伟 中国海洋大学医药学院
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1
实验目的
1. 加深理解所学有关的蛋白质性质的理论 知识
2. 掌握氨基酸和蛋白质常用的定性、定量 分析的方法及原理
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实验原理
一、蛋白质呈色反应 二、蛋白质沉淀反应
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一、蛋白质呈色反应
❖ 蛋白质的呈色反应是指蛋白质所含的某些氨基酸及 其特殊结构，在一定条件下可与某些试剂发生了生 成有色物质的反应。不同蛋白质分子所含的氨基酸 残基不完全相同，因此所发生的成色反应也不完全 一样。
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6
（二）双缩脲反应
❖ 当尿素经加热至180℃左右时，两分子尿素脱去一分 子氨，进而缩合成一分子双缩脲。其在碱性条件下 双缩脲与铜离子结合成红紫色络合物，此反应称为 双缩脲反应。
❖ 蛋白质在碱性溶液中与硫酸铜作用呈现紫红色，此 类似反应也称蛋白质的双缩脲反应。凡分子中含有 两个以上肽键的化合物都呈此反应，故所有蛋白质 都能与双缩脲试剂发生反应。
OH + HNO3
HO
HO
NO2 + NaOH
O
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NO2 + H2O

珠内部反复穿行，缓慢流出。
流 动 相
固 定 相
实验简述
1. 通过盐析法使鸡蛋卵清蛋白和卵球蛋白分离；通过盐溶法 使沉淀析出的卵球蛋白再次溶解 2. 制备葡聚糖凝胶SephadexG-25凝胶排阻层析柱 3. 通过凝胶排阻层析分离卵球蛋白和盐离子 4. 检测层析后收集的各管样品中的盐离子（醋酸钡法） 5. 检测各管样品中的蛋白质含量（UV法）
用移液枪去除上清（含卵清蛋白） 加50%硫酸铵溶液1.5ml 洗涤 3000rpm，离心3分钟 用移液枪去除上清
实验二 凝胶柱的制备和蛋白脱盐
1. 垂直固定层析柱，并安装乳胶管、止水夹
2. 向层析柱中加入1/3体积的水，以平衡、排出基质和乳胶管中的 气泡；若层析柱流水不畅，应反复正反冲洗柱基质！！
实验三 脱盐后离子测定及蛋白浓度测定
1. 硫酸根离子浓度测定
（决定是否停止洗脱）
醋酸钡与溶液中的硫酸根离子可以形成白色的沉淀，同时不能同蛋 白质形成沉淀。 从每管洗脱液中取1滴加在黑瓷板上，加入1滴醋酸钡溶液，观察沉淀
实验中设阴性对照(双蒸水)和阳性对照(醋酸钡检测溶液) 用++/+/-记录每管硫酸钡沉淀情况
6. 分析结果：盐析分离蛋白及凝胶排阻层析脱盐是否成功？
实验一 卵球蛋白的盐析分离
0.7ml 卵清 + 0.7ml 饱和硫酸铵溶液 （每组2个EP管） 混合均匀 （避免产生气泡） 静置3-5分钟，蛋白质析出
将两管上清合并， 即为样品 3000rpm, 离心3分钟
1ml水充分溶解 卵球蛋白沉淀
3000rpm，离心3分钟
凝胶排阻层析
(分子筛层析、分子排阻层析、凝胶过滤层析)
固定相：常用交联葡聚糖凝胶，如Sephadex系列，有不同凝胶

④ 蛋 白 质 的 变 性 是 一 个 __不__可__逆____ 过 程 ， 变 性 后 的 蛋 白 质 在 水 中 __不__溶__解____，同时也会失去__原__有__的__生__理__活__性____。利用蛋白质的变性， 可用于杀菌消毒，而疫苗等生物制剂的保存则要防止变性。
(3)蛋白质的特征反应 ①颜色反应：向盛有鸡蛋清溶液的试管中滴加3～5滴浓硝酸，在酒 精 灯 上 微 热 ， 观 察 到 的 现 象 是 __溶__液__遇__浓__硝__酸__变__黄__色____ 。 实 验 结 论 ： ___浓__硝__酸__可__使__某__些__蛋__白__质__显__黄__色___，常用此反应来鉴别蛋白质。 ②蘸取少量鸡蛋清或取一根头发，放在酒精灯火焰上灼烧，可闻到 __烧__焦__羽__毛__的__特__殊__气__味____。常用此反应区分毛料纤维与合成纤维。
物理因素：__加__热____、加压、搅拌、振荡、__紫__外__线__照__射____、超声 波等；
化 学 因 素 ： __强__酸____ 、 __强__碱____ 、 __重__金__属__盐____ 、 三 氯 乙 酸 、 乙 醇、丙酮、甲醛等有机物。
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第七章 机化合物
化学（必修·第二册 ）
化学（必修·第二册 ）
解析：在一定温度范围内，温度越高，酶的催化活性越强，但超过 一定温度，温度越高，酶的催化活性越低，甚至完全丧失活性，B项是 错误的。A项中实际是在蛋白质和水的混合体系中加入无机盐．使蛋白 质的溶解度降低，形成凝胶，而蛋白质的生理活性没有发生变化；C项 中毛织物的主要成分是天然蛋白质，灼烧有烧焦羽毛的气味，棉织物的 主要成分是纤维素，灼烧时，无明显的气味；D项叙述是正确的。
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在多肽链中带有氨基的一端称作N端，而带有羧基的一 端称作C端。
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胰岛素的一级结构
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3. 三级结构：是指多肽链借助各种作用力在二级结 构基础上，进一步折叠卷曲形成紧密的复杂球形分 子的结构。
稳定蛋白质三级结构的作用力有氢键、离子键、 二硫键和范德华力。
肌球素的三级结构
肌球素的三级结构
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（4）费林反应: 含有酪氨酸的Pr因酪氨酸的酚基能育费林试剂
中的磷钼酸和磷钨酸反应，还原成蓝色化合物。利 用这一反应定量测定Pr。
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蛋白质的二、三、四级结构的构象不稳定，在 某些物理或化学因素作用下，发生不同程度的改变称 为变性。变性是指蛋白质高级结构发生改变，而肽键 不断裂。变性后的蛋白质某些性质发生变化，主要包 括：
些碳水化合物是氨基葡萄糖、氨基半乳糖、半乳糖、 甘露糖、海藻糖等中的一种或多种，与蛋白质间的共 价键或羟基生成配糖体。糖蛋白可溶于碱性溶液。哺 乳动物的物的粘性分泌物、血浆蛋白、卵粘蛋白及大 豆某些部位中之蛋白质都属于糖蛋白。
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3．核蛋白： 由核酸与蛋白质结合而成的复合物。存在细胞
核及核糖体中。
11
4.非极性氨基酸：具有一个疏水性侧链，在水中的溶 解度比极性氨基酸低。共有： 甘氨酸，丙氨酸、缬氨酸，亮氨酸、甲硫氨酸和异 亮氨酸(蛋氨酸)．
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1. 旋光性：除甘氨酸外， 氨基酸的碳原子均是手性 碳原子，所以具有旋光性。 旋光方向和大小取决于其 侧链R基性质，也与水溶液 的pH有关。
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2. 紫外吸收：20种AA在可见区内无吸收，但在紫外光 区酪氨酸、色氨酸和苯丙氨酸有吸收，其最大吸收波 λman分别为278nm、279nm和259nm，故此利用此性质 对这三种氨基酸进行测定。酪氨酸、色氨酸残基同样 在280nm处有最大的吸收，可用紫外分光光度法定量 分析蛋白质。

可逆变性、不可逆变性。
蛋白质变性后其பைடு நூலகம்理化学性质变化表现为：
①疏水性基团暴露，水中溶解性降低； ②某些蛋白质的生物活性丧失，如失去酶活或免疫活性； ③肽键暴露出，易被酶催化水解； ④蛋白质结合水的能力发生了变化； ⑤溶液粘度发生了变化； ⑥蛋白质结晶能力丧失。
引起蛋白质变性的因素
❖ 物理因素： 温度（热，冷）、机械处理、电磁
蚕豆 11S 蛋白
94
72
3.72
向日葵 11S 蛋白 95
76
4.16
燕麦球蛋白
108
2.冷冻
❖ 低温处理也会导致蛋白质变性。
❖ 有利：利用这一点，我们可以通过冷冻及 冻结贮藏抑制微生物和酶的活性，延长烹 饪原料的保鲜期。
❖ 不利：长期的低温处理也会导致烹饪原料 蛋白质冻结变性而被破坏，如冷冻的鱼类、 肉类长时间放置，蛋白质持水力下降、肉 质硬化等现象。
的影响，蛋白质在等电点时最稳定，溶解度最低， 在中性pH 环境中，除少数几个蛋白质带有正电 荷外，大多数蛋白质都带有负电荷。
❖ 酸碱引起的蛋白质变性可能是因为蛋白质溶 液pH值的改变导致多肽链中某些基团的解离 程度发生变化，从而破坏了维持蛋白质分子 空间结构所必需的某些带相反电荷基团之间 因静电作用形成的键。
冷冻对蛋白质产生不利影响的原因：
❖ 1、蛋白质水合环境发生变化。 ❖ 2、体系结冰后盐浓度增大产生盐效应。 ❖ 3、冷冻浓缩效应，使二硫键交换反应增加。
3 机械处理
揉捏、振动、挤压或搅打等高速机械 剪切，都能引起蛋白质变性。
剪切速率愈高，蛋白质变性程度则愈大。 同时受到高温和高剪切力处理的蛋白质，则 发生不可逆变性。
蛋白质
Td
平均疏水性

的病人
有机酸沉 淀
生成不溶性盐
苦味酸、鞣酸、三氯醋酸、 磺基水杨酸等生物碱试剂
沉淀蛋白滤液等
蛋白质沉淀分类
（1）可逆沉淀反应：蛋白质分子内部结构并未发生 显著变化，基本保持原有的性质，沉淀因素除去后， 能溶于原来的溶剂中。例如：盐析、乙醇低温短时作 用，可用于蛋白质提纯。 （2）不可逆沉淀反应：蛋白质分子内部结构、空 间构象遭到破坏，失去原来的天然性质，不再溶于 原溶剂。例如：加热、有机酸反应。
步骤
现象
取试管1，加入1mL蛋白质氯化 观察有无蛋白质的沉
钠溶液和21mL95%乙醇
淀
静置，弃去上清液，取出部分 蛋白沉淀，加少量蒸馏水
观察沉淀的再溶解
解释结论
3. 蛋白质的不可逆反应——重金属盐（3支试管）
试管 操作
现象
操作
现象
试管 1 ①1mL蛋白质溶液
观 察 有 无 弃去上清液，取 观察沉淀
蛋白质分 子表面
水化膜 同种电荷
稳定的亲水胶 脱水，失去电荷
沉淀反应
可逆沉淀反应 （不变性沉淀反应）
如：盐析作用…
不可逆沉淀反应 （变性沉淀反应） 如：重金属盐沉淀作用…
三、实验仪器和试剂
1. 试剂
• 蛋白质溶液：取10mL鲜鸡蛋清，用蒸馏水稀释至 200ml，搅拌后用2-3层纱布过滤，新鲜配制。加 入少量氯化钠可加速溶解球蛋白。
（1）盐析 （2）有机试剂 （3）重金属盐 （4）有机酸 （5）加热
…………
蛋白质沉淀变性的常见方法
常用方法 盐析
有机试剂 盐析
原理 破坏蛋白质胶体溶液的水化
层和电荷层 脱水作用；降低水的介电常 数和蛋白质溶解度；蛋白质
析出

氯化钠等)在蛋白质溶液中达到一定浓 下,蛋白质的性质和生理功能 定义
度时,会使蛋白质的溶解度降低而使其 发生改变的现象称为蛋白质的
从溶液中析出,这种作用称为盐析
变性
特征
可逆
不可逆
实质
溶解度降低,物理变化
结构、性质改变,化学变化
名称
盐析
变性
碱金属、镁、铝等轻金属 条件
盐或铵盐的浓溶液
加热、加压、振荡、超声波、放射线、 紫外线、强酸、强碱、重金属盐、甲 醛、乙醇等
PART 03
蛋白质的性质——显色
操作
向盛有2mL鸡蛋 清溶液的试管中 加入5滴浓硝酸， 加热。观察实验 现象。
现象
结论
蛋白质的性质——显色
操作
现象
结论
向盛有2mL鸡蛋清溶液 向蛋白质溶液加入浓 含苯环的蛋白质遇到
的试管中加入5滴浓硝酸， 硝酸会有白色沉淀产 浓硝酸会有白色沉淀
加热。观察实验现象。 生，加热后沉淀变黄 产生，加热沉淀变黄
B．蛋白质溶液不能产生丁达尔效应 A．和 B．CH3OCH3和CH3CH2OH
C．正戊烷和新戊烷
D．和
【答案】C
C．蛋白质溶液中加入CuSO4溶液产生盐析现象
D．蛋白质在紫外线的照射下将会失去生理活性
谢谢观看与支持
【思考与讨论】
问题1 因误服铅、汞等重金属盐中毒的患者在急救时，为什么可 口服牛奶、蛋清或豆浆？ 误服重金属盐，可口服牛奶、蛋清或豆浆，其目的是吸收重 金属盐解毒，减少人体蛋白质变性。
问题2 为什么紫外线可用于环境和物品消毒，放射线可用于医疗器械 灭菌？
紫外线用于环境和物品消毒，放射线用于医疗器械消毒，都 是利用紫外线或放射线使蛋白质凝固，从而使细菌死亡。

R1 O H
R2 O H R 3 O H
R4 O H R5 O H R6 O H R7
H2N C C N
C C N C C N
C C N C C N C C N C COOH
H
H
H
H
H
H
H
公式4：N原子数= 肽键数＋肽链数＋R基上N原子数=各氨基酸N原子总数
公式5：O原子数= 肽键数＋2×肽链数＋R基上O原子数
n
na-18(n-m)
na-18n
氨基
数目
羧基
数目
至少 1 个
至少 m 个
至少 0 个
组成元素
组成
氨基酸
脱
水
缩
合
多肽
折
叠
盘
旋
蛋白质
C、H、O、N（P、S、Fe等）
必需氨基酸：8种
种类：21种
通式： H2N
非必需氨基酸：13种
H O
C
C
OH
R
特点：至少有一个－NH2和一个－COOH连在同一个C原子上等
（
B
）
A．798、2和2
B．798、12和10
C．799、1和1
D．799、11和9
氨基酸分子结构
通式
3、蛋白质相对分子质量的计算：
R2
R1
H2N
C
C OH H N C COOH
H H
H O
H2O
公式3：蛋白质相对分子质量=氨基酸数×氨基酸平均相对分子质量 - 脱去的
水分子数（氨基酸个数-肽链条数）×18
● 三个不同种氨基酸可形成多少种三肽？
排序： =6
● 体内21种氨基酸，能形成多少种三肽？

蛋白质盐析和变性的比较
概念
盐析
蛋白质溶液中加浓轻 金属盐或铵盐溶液， 使蛋白质析出
变性
蛋白质在某些条件作用下凝聚，丧失生 理活性
变化条件
浓轻金属盐或铵盐溶 受热、紫外线、强酸、强碱、重金属盐，
液
某些有机物等
变化实质 物理变化（溶解度降低） 化学变化
变化过程 用途
可逆 分离，提纯
不可逆 杀菌，消毒等
盐析和变性的区别
杀菌，消毒
化学变化
Байду номын сангаас
不可逆
受热、紫外线、强酸、 强碱、重金属盐，某些 有机物等
蛋白质在某些条件作 用下凝聚，丧失生理 活性
变性
用途
过程 实质 条件 定义
分离提纯
可逆 物理变化
（溶解度降低） 一定浓度盐溶液
蛋白质溶液中加浓无 机盐溶液，使蛋白质 析出
盐析

细胞功能失调
细胞内的蛋白质相互作用 和功能依赖于其正确的构 象，变性导致这些相互作 用和功能失调。
免疫反应抑制
一些抗原性蛋白质变性后 ，其免疫原性减弱或消失 ，导致免疫反应受到抑制 。
对生物结构的影响
细胞器结构破坏
细胞内许多重要功能由细胞器完成， 而这些细胞器的结构主要由蛋白质构 成，因此蛋白质变性可破坏细胞器结 构。
蛋白质变性过程中的结构变化研究
蛋白质变性过程中，其结构会发生改变。未来研究将进一步探究这种结构变化与功能变化之间的关系，为理解 蛋白质的功能和调控提供更多线索。
蛋白质变性对生物的影响研究
蛋白质变性对生物体内平衡的影响
蛋白质在生物体内发挥着重要的功能，其变性可能会影响生物体内平衡，对生 物体的生长、发育和代谢等产生影响。未来研究将进一步探究这种影响及其机 制。
蛋白质变性的过程
01
02
03
初期
蛋白质分子中的次级键， 如氢键、疏水键等发生变 化，导致蛋白质的空间构 象开始变得不稳定。
中期
蛋白质的空间构象被破坏 ，导致其理化性质发生改 变。
后期
蛋白质的生物活性完全丧 失，成为变性蛋白。
03
蛋白质变性的影响
对生物活性的影响
酶活性丧失
蛋白质变性后，其空间构 象发生变化，导致酶的活 性中心被掩盖，从而失去 催化活性。
染色体畸变
膜结构破坏
生物膜的主要成分是蛋白质和脂质， 蛋白质变性可破坏膜的稳定性，导致 膜结构破坏。
在细胞分裂过程中，蛋白质参与染色 体的组装和分离，变性可能导致染色 体畸变。
对生物功能的影响
代谢紊乱
许多酶促反应在体内是连续进行的，蛋白质变性可导致这些酶促 反应受阻，从而导致代谢紊乱。