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金属硫蛋白对仔猪抗氧化功能及SOD基因表达的影响【关键词】金属硫蛋白；抗氧化酶；基因表达；仔猪【Abstract】 AIM: To inverstigate the effects of exogenous Znmetallothionein (ZnMT) on antioxidative function and gene expression of SOD in weaning piglets. METHODS: Eighteen piglets(Duroc×Landrace×Yorkshire) were selected and pided into 3 groups (1，2 and 3) randomly. The piglets were sport to produce stress. ZnMT of piglet liver dissolved in physiological saline were then injected into the piglets of group 1， 2 and 3 with the concentrations of 0， 0.8，1.6 mg/kg， respectively. Three and 6 h later， 3 piglets were selected from each group randomly and slaughtered to get liver samples. The biochemical indexes related to antioxidation and the level of SOD gene expression in liver were determined. RESULTS: After ZnMT injection， the activities of SOD and GSHPX increased significantly (P<0.05)， the content of MDA decreased significantly (P<0.05)， and the level of antireactive oxygen species and antisuperoxide anion had the trend of improvement. Six hours after ZnMT injection， the level of SOD gene expression in group 2 and 3 increased significantly as compared withthat in group 1 (P<0.05). The level of SOD gene expression in group 2 and 3 at 6 h enhanced significantly as compared with that at 3 h. Thus，our data indicated that ZnMT treatment stimulated SOD mRNA expression in a time and dosedependent manner. CONCLUSION: Activity of antioxidase can be increased by supplement of ZnMT， thereby improving the power of antistress.【Keywords】 metallothionein; antioxidative enzyme; gene expression; piglet【摘要】目的：用仔猪作模型，研究经锌元素诱导的外源性金属硫蛋白（ZnMT）对机体抗氧化功能和超氧化物歧化酶(SOD)基因表达的影响. 方法：选用杜长大杂交仔猪18头，随机分为3组(1，2和3）. 分别肌肉注射经生理盐水溶解的猪肝ZnMT 0 mg/kg (1组），0.8 mg/kg （2组）， 1.6 mg/kg （3组），让仔猪运动产生应激. 注射MT后3 h和6 h，分别从每组取3头仔猪屠宰取肝脏，测定肝脏中与抗氧化有关的生化指标，检测肝脏SOD基因表达水平. 结果：在应激条件下，补充外源性ZnMT一段时间后，仔猪肝脏SOD，GSHPX活性显著升高(P<0.05)，MDA含量显著降低(P<0.05)，肝脏抗活性氧和抗超氧阴离子水平也有提高的趋势. 在注射ZnMT后6 h，0.8 mg/kg，1.6 mg/kg组仔猪肝脏SOD基因表达水平比对照组显著提高(P<0.05). 0.8 mg/kg组和1.6 mg/kg组6 h SOD基因表达水平比3 h显著增加，表明MT对SOD基因表达的诱导与时间和剂量关系密切. 结论：补充外源性ZnMT可提高应激机体的抗氧化物酶活性，从而提高机体的抗应激能力.【关键词】金属硫蛋白；抗氧化酶；基因表达；仔猪0引言应激可使机体脂质过氧化反应增强，继而通过产生自由基造成组织损伤，致生物体病变，生产力下降，甚至死亡［1］. 金属硫蛋白（metallothionein，MT）是分子量低、富含半胱氨酸的金属结合蛋白. 研究表明，MT具有显著的清除自由基、抗脂质过氧化和增强机体免疫力的作用［2-3］. 因此，MT通过清除自由基，可增强抗氧化酶的活性，阻断脂质过氧化链式反应，减少膜脂质过氧化损伤，减少DNA损伤. 因而将MT应用于动物，完全有可能达到缓解氧化应激，提高生长速度，减少疾病的发生，减缓鲜肉氧化速度，延长动物利用年限，提高经济效益的目的. 但以往有关金属硫蛋白的抗氧化、抗应激研究以内源性为主，而且大都仅从抗氧化酶的活性变化来探讨金属硫蛋白清除自由基、抗氧化的作用. 有关MT在猪体内的研究鲜见报道. 基于此，我们以杜长大杂交仔猪为对象，通过注射外源性ZnMT，测定肝脏与自由基有关的生化指标以及肝脏中SOD基因表达水平，从蛋白和基因水平探讨外源性ZnMT在应激状态下对抗氧化酶的影响.1材料和方法1.1材料选用胎次、日龄相同并且体质量相近的杜长大三元杂交雄性仔猪18头，14 d一次性断奶，单栏饲养，自由采食和饮水. 试验前体质量（4.42±0.24）kg. 屠宰前1 d停食，不断水. 梯度PCR仪：德国Eppendorf生产，型号为5331055888；稳压稳流电泳仪：北京六一仪器厂生产，型号为DYY6B；凝胶成像系统：美国UVP Biolmaging System生产，型号为GDS8000；紫外分析仪：北京六一仪器厂生产，型号为WD9403B；紫外分光光度计：德国Eppendorf生产，型号为603105430；超低温冰箱：青岛海尔股份有限公司生产，型号为BD396LT65W；台式离心机：德国Eppendorf生产，型号为Centrifuge 5415D；低温离心机：德国Eppendorf生产，型号为Centrifuge 5810R；微波炉：青岛海尔股份有限公司生产，型号为HR6702DW. 猪肝ZnMT：本课题组提取的产品；BIOXYTECH SOD525TM试剂盒：购自OXIS公司；谷胱甘肽过氧化物酶(GSHPX)活力测定试剂盒、丙二醛(MDA)测定试剂盒、活性氧(ROS)测定试剂盒、超氧阴离子(SOA)自由基测定试剂盒：购自南京建成生物工程研究所；ISOGEN总RNA抽提试剂盒：购自日本基因株式会社；RTPCR试剂：购自Amersham Pharmacia Biotech公司；琼脂糖及Tris：购自Roche公司；Gene RulerTM 100 bp DNA Ladder：购自MBI Fermntas公司.1.2方法1.2.1试验设计将18头供试仔猪，随机分为3组，每组6头. 驱赶仔猪使其产生应激，然后3组分别肌肉注射经生理盐水溶解的猪肝ZnMT 0 mg/kg（1组），0.8 mg/kg（2组），1.6 mg/kg（3组）. 在注射MT后3 h和6 h，分别从每组随机抽取3头仔猪，从前腔静脉放血屠宰，取肝脏，测定肝脏中与抗氧化有关的生化指标，检测肝脏SOD基因表达水平.1.2.2样品采集解剖时取两份1 g左右的肝脏迅速用无菌锡铂纸包好并编号于液氮中速冻，再转移至-70℃冰箱中以备总RNA的抽提和肝脏上清液的制备.1.2.3肝脏上清液的制备取0.2 g左右经低温保存的肝组织在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称质量，放入玻璃匀浆管中，然后用移液管量取预冷的生理盐水(8.6 g/L)，生理盐水的体积是组织块质量的9倍. 将匀浆管下端插入盛有冰水混合物的器皿中，上下转动捣杆数10次，充分研碎，使组织匀浆化. 将制备好的100 mL/L的匀浆在4℃，3000 r/min离心15 min，取上清液.1.2.4肝脏中与抗氧化有关的生化指标的测定肝脏上清液中SOD活性，GSHPX， MDA， ROS和SOA自由基水平的测定按各试剂盒说明书操作.1.2.5基因表达分析采用半定量RTPCR方法，以3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)为内标［4］.1.2.5.1总RNA的提取采用ISOGENLS总RNA抽提试剂盒，按说明书操作，提取的总RNA经紫外分光光度计测得A260/A280在1.8~2.0之间，可作为逆转录反应的模板.1.2.5.2引物设计根据网上(/)发表的基因序列（SOD：E06791， GAPDH：AF017079 ）采用引物设计软件进行设计，SOD上游引物：5′ ATTCATGGCGACGAAGGC 3′，下游引物：5′ TCAATTACACCACAGGCCA3′，扩增长度453 bp；内标GAPDH上游引物5′ TGAACGGATTTGGCCGCAT3′，下游引物5′ TTCTCCATGGTCGTGAAGA3′，扩增长度297 bp；引物均由日本株式会社DNA合成事业部合成.1.2.5.3RTPCR反转录聚合酶链式反应(RTPCR)用ReadtoGo RTPCR beads试剂采用一步法进行.1.2.5.4RTPCR产物定量取15 μL PCR扩增产物于20 g/L琼脂糖凝胶上电泳（含溴化乙锭），在凝胶成像系统下观察结果并拍照. 采用图像处理系统对PCR产物条带进行密度扫描，以3磷酸甘油醛脱氢酶(GAPDH)作为RTPCR的质控，将待测SOD基因表达与其对应GAPDH表达的比值进行比较后得出一相对量，从而计算出各组的基因表达量的相对变化量.统计学处理：计量数据以x±s表示. 采用SAS6.12统计软件进行方差分析(GLM过程)，并用Duncan法进行多重比较.2结果2.1MT对仔猪肝脏抗氧化能力的影响仔猪应激时注射外源性ZnMT一段时间后，仔猪肝脏SOD，GSHPX活性升高，MDA含量降低，抗活性氧和抗超氧阴离子水平也有提高的趋势. 尤其在注射ZnMT后6 h，肝脏SOD，GSHPX活性，MDA含量各组比较差异具有统计学意义(P<0.05，表1).同时由表1知，注射相同剂量ZnMT，6 h SOD，GSHPX活性比3 h提高，且Ⅲ组6 h SOD，GSHPX活性比3 h提高(P<0.05)，MDA含量降低(P<0.01). 各组肝脏抗活性氧和抗超氧阴离子水平6 h与3 h相比也有提高的趋势.表1不同剂量的MT 对仔猪肝脏中与抗氧化有关的指标的影响2.2MT对仔猪肝脏SOD基因表达水平的影响由表2和图1，2可知，注射MT后3 h各组相比，肝脏SOD基因表达水平差异不显著(P>0.05). 注射MT后6 h各组相比，Ⅲ组肝脏SOD基因表达水平比Ⅰ组显著提高(P<0.05). 注射相同剂量ZnMT 在不同的时间，第1组3 h与6 h肝脏中SOD基因表达水平相比差异不显著(P>0.05). 第2组和第3组6 h肝脏中SOD基因表达水平比其3 h的显著提高(P<0.05).表2不同剂量的MT对仔猪肝脏中SOD基因表达水平的影响3讨论正常情况下，机体存在一个完整的包含酶系和非酶系的抗氧化系统，抗氧化酶有SOD，GSHPX等，非酶系有VE、还原性谷胱甘肽等，均有清除自由基的作用. 在他们的协同作用下，使体内过多的自由基转变为无害的水，起到抗氧化的作用. 羟自由基是最活跃，也是毒性较大的含氧自由基. 由于至今体内尚未发现羟自由基的清除酶系，MT有效地抗羟自由基作用显得重要. Adel等［5］比较了MT与谷胱甘肽抗羟自由基保护DNA的作用，发现当MT浓度为13 μmol/L时，DNA的降解几乎完全被抑制，而10 mmol/L的GSH才能达到此作用. 而且在某些应激情况下，GSH 水平下降，而MT合成增加. 本试验结果表明，注射外源ZnMT后，在一定的时间和浓度下，可显著提高仔猪肝脏SOD，GSHPX的活性，降低肝中MDA的含量. 肝脏抗活性氧和抗超氧阴离子的水平也有提高的趋势，从而提高机体的抗应激能力.本结果同时表明，仔猪应激时，外源性补充ZnMT一段时间后，SOD mRNA表达水平提高，SOD的活性增加. Sugino等［6］研究小鼠的黄酮细胞发现SOD活性还受精胺的调控，这种调控是发生在转录水平. ZnMT中半胱氨酸含量丰富，在巯基化合物生成的同时，并有精氨酸残基，这样提供了SOD活性增强的物质基础.【参考文献】［1］祁克宗.内毒素性微循环山羊氧自由基代谢的研究［J］.中国农业科学，1999，32(3): 90-95.［2］ Zhou ZB. Effect of Zn7metallothionein on oxidative stress in liver of rats with severe thermal injury［J］. Acta Pharmacol Sin，2003，24(8): 764-760.［3］郑军恒，李海洋，茹刚，等.金属硫蛋白清除羟自由基的研究［J］.北京大学学报:自然科学版，1999，35(2):573-576.［4］ Hou DX， Fukuda M， Fujii M， et al. Transcriptionalregulation of nicotinamide adenine dinucleotide phosphate: quinone oxidoreductase in murine hepatoma cells by 6(methylsufinyl)hexyl isothiocyanate， an active principle of wasabi (Eutrema Wasabi Maxim.)［J］. Cancer Lett， 2000， 161: 195-200.［5］ Adel J， de Ruiter N. Inhibition of hydroxyl radicalgenerated DNA degradation by metallothionein［J］. Toxicol Lett， 1989，47: 191-196.［6］ Sugino N， Telleria CM. Differntial regulation of copperzinc superoxide dismutase and manganese superoxide dismutase in the ratcorpus luteum induction of manganese superoxide dismutase messenger ribonucleic acid by inflammafory cytokines ［J］. Biol Reprod， 1998，59: 599-605.。
金属硫蛋白1、MT命名及定义根据与 MT结合的金属的不同，对只舍一种金属，例如 Cd或 Cu等，可分别定名为镉金属硫蛋白或铜金属碗蛋白等；还可根据结合金属的摩尔含量写成Cd7–MT、Zn7–MT等 (表示每分子结合7个分子Cd或Zn)。
对于含一种以上金属，如同时含 Cd和Zn时，可写成Cd，Zn-MT。
对其分子结构上的差别，可用罗马数字和小写字母标出，例如MT-Ⅱ、MT-Ⅰ、MT-Ⅱa等。
经典MT定义：根据金属硫蛋白命名委员会（Thecommitteeon the Nomenclature of Metallothionein）的建议，1988年，Kagi将具有以下特征的蛋白质或多肽定义为MT（Kagi & Schaffer, 1988）。
1.低分子量，一般为6,000－7,000道尔顿，含60-63个氨基酸残基；2.高金属含量，每分子蛋白质可结合7个二价金属离子，或多至18个一价金属离子；3.特有的氨基酸组成，无芳香族氨基酸及组氨酸；4.富含Cys残基(约23-33%)，无二硫键；特征的氨基酸序列，Cys残基在氨基酸序列中占据相当保守的位置；5.所有的Cys残基均以还原态存在；并通过巯基以硫酯键结合金属离子；从而具有金属巯基化合物的特征吸收光谱。
实际上，这只是对经典MT的一个定义。
现在MT家族所包括的成员远远超出以上定义的范围。
※ Cys半胱氨酸2、MT的分类1.1 根据 MT的结构差异，一般将其分3类第1类：MT的氨基酸序列中的半胱氨酸位置与最先从马肾中分离的 MT的氨基酸序列中的半胱氨酸位置紧密相关的多肽。
所有哺乳动物的 MT都属于这一类。
其它来源的 MT只要其基本结构与哺乳动物的MT相似亦归这一类。
第2类：MT氨基酸序列结构中的半胱氨酸位置与马肾 MT关系较远，与哺乳动物 MT没有或很少有相似的进化关系。
如酿酒酵母和某些高等植物的 MT属于这一类。
第 3类：非典型的 MT。
是一类由非转译合成的金属硫醇盐多肽，由γ-谷氨酰半胱氨酰基单元组成。
金属硫蛋白在动物营养学上的应用吴力专;李丽立;张彬【摘要】综述了金属硫蛋白(MT)在动物的健康、疾病以及生长性能等方面的重要作用.MT能参与畜禽体内微量元素Cu、Zn等的代谢,可利用MT来评价动物机体Zn的营养状态;MT具有抗应激的作用;MT有重金属解毒作用,在高铜、高锌日粮的促生长机理中发挥重要作用;MT促进动物机体生长发育;此外,MT在Se对动物机体的各种生理作用中发挥重要作用.【期刊名称】《长江大学学报（自科版）农学卷》【年(卷),期】2006(003)001【总页数】5页(P156-160)【关键词】金属硫蛋白(MT);微量元素;高铜高锌日粮;硒【作者】吴力专;李丽立;张彬【作者单位】长江大学动物科学学院,湖北,荆州,434025;中国科学院亚热带农业生态研究所,湖南,长沙,410125;湖南农业大学动物科技学院,湖南,长沙,410128【正文语种】中文【中图分类】R151.2;S811.3金属硫蛋白(Metallothionein，MT)是一类广泛存在于生物体内的低分子量富含半胱氨酸、能被金属结合的蛋白。
自1957年美国哈佛大学的Marsgoshes和Vallee从马肾中首次发现MT以来，人们对不同来源的MT进行了系统的研究[1]。
MT的生物学意义涉及生物机体微量元素贮存运输和代谢、重金属解毒、拮抗电离辐射、清除自由基以及机体生长发育、生殖衰老、肿瘤发生、免疫应激反应等各个方面，其研究涉及农业、医药保健、生物工程、环境保护等各个领域[2]。
以前许多研究大多数着眼于MT对机体的金属自身平衡或解毒方面的作用，而分子生物学则侧重于对MT基因表达调控的研究，最近MT的研究又有了新的进展，一个崭新的研究领域—金属硫蛋白在动物营养学上的应用诞生了，由于这方面的研究与人类生活质量息息相关，因而成为当今MT在动物营养学研究的一大亮点。
1 畜禽体内MT的代谢过程激素、干扰素和多种炎症因子及金属离子等都能诱导MT基因转录合成大量的MT-mRNA。
锌金属硫蛋白对小鼠免疫功能的影响
吴烽;董胜璋;林忠宁;杨巧媛
【期刊名称】《卫生毒理学杂志》
【年(卷),期】2002(16)2
【总页数】3页(P91-93)
【关键词】锌;锌金属硫蛋白;细胞免疫;白细胞介素;体液免疫;动物实验
【作者】吴烽;董胜璋;林忠宁;杨巧媛
【作者单位】增城出入境检验检疫局;中山医科大学公共卫生学院环境卫生学教研室
【正文语种】中文
【中图分类】R392.3
【相关文献】
1.二甲基苯蒽对金属硫蛋白基因敲除小鼠免疫功能的影响 [J], 雷志明;阮明;邱飞婵;魏雪涛;李雪婷;贾凤兰;尚兰琴;张宝旭
2.金属硫蛋白3对快速老化痴呆模型小鼠海马锌和铜含量的影响 [J], 马飞煜;张艳梅;王虎;田贤先
3.缺锌对生长期小鼠肾脏金属硫蛋白-1表达的影响 [J], 许长录;田娟;李洪秀;郭敏
4.锌、硒对镉中毒小鼠金属硫蛋白合成及脂质过氧化损伤的影响 [J], 聂晓兰;林波;温坤;张永雪
5.钙、锌对小鼠肝金属硫蛋白合成及肝锌、钙水平的影响 [J], 戴建国;杨森;陈景衡因版权原因，仅展示原文概要，查看原文内容请购买。
自从Ｔｏｄｄ等人于１９３４年首次证明锌是高等动物营养所必需的元素以来，人们研究发现微量元素锌在动物和人体内具有广泛的生理生化功能，被称为“生命元素”和人类的“智慧元素”。
近年来，锌在畜牧生产和医学领域中得到了广泛的应用。
１锌在动物体内的分布锌分布于机体的所有组织器官中，各种动物体内锌的含量差异不大，正常动物体内锌的总含量为３０ｍｇ·ｋｇ－１左右，大致的分布为：骨骼２８％，肝脏和皮肤８％，血液２％～３％，其他器官０．６％～１％。
血浆中的锌３０％～４０％参与酶活性和功能，６０％～７０％与白蛋白松散结合，是体内锌的主要运输形式。
肌肉中锌的含量因其色泽和功能活性的不同而异，牛的腹侧巨肌平均含锌量为２４７ｍｇ·ｋｇ－１干脱脂物质，背最长肌为６９ｍｇ·ｋｇ－１。
猪奶中锌含量为４．９４ｍｇ·ｋｇ－１，奶中的锌与酪蛋白盐类结合存在，初乳中锌的含量是常乳的３４倍。
母猪、母牛、山羊及绵羊奶中锌的含量大约为５ｍｇ·ｋｇ－１。
毛、羽中锌的含量能客观反映日粮锌的水平，蛋中锌的含量也受日粮锌水平的影响。
动物在性成熟前，前列腺中锌的含量特别丰富，精液中也含有较多的锌［１］。
２锌在动物体内的吸收与代谢锌的吸收部位因畜种而有所不同，在单胃动物，锌主要在小肠远端被吸收；在反刍动物，约有１／３的锌在真胃吸收，其余在小肠；鸡在腺胃和小肠吸收锌。
动物体内锌的平衡状态、锌含量和吸收细胞内束缚锌的物质对锌的吸收起调节作用，动物体对锌的吸收率与日粮锌水平成反比。
被吸收的锌与血液转运蛋白结合，运送到肝脏和其他组织器官。
锌在体内以小分子可溶性物质参与代谢，吸收过程包括快速进入黏膜细胞和比较缓慢地进入血流两个阶段。
锌还可以通过胎盘从血浆转移到胎儿体内，所以胎儿的骨骼和肝脏中锌含量较高。
不同组织器官锌的累积和代谢、周转速率不同，肝脏是锌贮存和代谢的主要场所，骨骼和神经系统中的锌周转代谢速率较慢，而毛中的锌基本上不存在分解代谢。
