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养鱼塘水中叶绿素a的测定孔琪摘要测定叶绿素a的仪器和方法有许多种，分光光度法测定叶绿素a是一简便易行的测定方法，水样经离心或过滤浓缩、研磨、丙酮提取后，定容，取上清液分别测量750nm、645nm、663nm、652nm等几个波长下的吸光度值，根据经验公式可分别计算出叶绿素a含量关键词分光光度法叶绿素a前言叶绿素作为水生态系统中主要初级生产者一浮游植物的生物量和生产力的指标,具有测定方便快速和重复性好等优点.在水生生物学研究,水质评价和富营养化水体的调查研究中,叶绿素既作为生态系统结构指标,又作为功能指标被广泛使用.叶绿素在红光(600nm以上)区域有吸收波长极值,因而用分光光度法可以测定叶绿素的含量1 试验部分1.1主要仪器与试剂90%丙酮溶液，2mol/LHcl；10mL具塞小试管 1cm玻璃比色皿，滤纸玻璃纤维滤膜，可见分光光度计1.2实验步骤1.2.1水样处理：所取的水样应往湖中间点不能去表面水样，水样中如有大的微粒，可用搅拌器搅拌2～3 min，以至混合均匀。
1.2.2 将100~500mL水样经玻璃纤维滤膜过滤，记录过滤水样的体积。
将滤纸卷成香烟状，放入小瓶或离心管。
加10mL或足以使滤纸淹没的90％丙酮液，记录体积，塞住瓶塞，并在4℃下暗处放置4h。
如有浑浊，可离心萃取。
将一些萃取液倒入1cm玻璃比色皿，加比色皿盖，以试剂空白为参比，分别在波长665nm和750nm处测其吸光度。
1.2.3 加滴2mol/L盐酸于上述两只比色皿中，混均并放置1min，再在波长665nm和750nm 处测定吸光度。
2 结果与讨论2.1结果处理酸化前： A=A665-A750酸化后： A a=A665a-A750a在665 nm处测得吸光度减去750 nm处测得值是为了校正浑浊液。
用下式计算叶绿素- a的浓度（μg/L）：2.2计算：叶绿素-a=29*（0.01+0.05）*12/200=0.1044μg/L3结论3.1池塘水中的叶绿素-a含量为0.1044μg/L.参考文献[1]王飞儿, 吕唤春, 陈英旭, 等. 2004. 千岛湖叶绿素a浓度动态变化及其影响因素分析[J]. 浙江大学学报(自然科学版)，30(1): 22-26.[2]中国药典2005版一部[s].北京:化学工业出版社.2005:3SQ[3]胡韧, 林秋奇, 段舜山, 等. 2002. 热带亚热带水库浮游植物叶绿素a与磷分布的特征[J]. 生态科学，21(4): 3l0-3l5.[4]林丽贞, 陈纪新, 刘媛,等.2007. 东、黄海典型海区分粒级浮游植物叶绿素a的周日波动及影响因子[J].台湾海峡，26(3): 342-350.[5] 刘镇盛, 王春生, 倪建宇, 等. 2003.抚仙湖叶绿素a的生态分布特征[J]. 生态学报，23(9): l773-l780.[6] 国家环境保护总局《水和废水监测分析方法》编委会编. 2002. 水和废水监测分析方法(第四版) [M]. 北京: 中国环境科学出版社，2002.[7] 黄祥飞. 湖泊生态调查观测与分析[M]. 2000北京: 中国标准出版社.。
⽔质叶绿素a的测定分光光度法编制说明附件3《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》（征求意见稿）编制说明《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》标准编制组⼆○⼀五年⼋⽉项⽬名称：⽔质叶绿素a的测定分光光度法项⽬统⼀编号：939承担单位：辽宁省环境监测实验中⼼编制组主要成员：王秋丽、赵丽娟、王琳、丁振军、刘畅、徐天赐、姜永伟、秦⾬、郭杨、朱⼴钦、叶明、贺业菊标准所技术管理负责⼈：周⽻化、雷晶、张虞标准处项⽬负责⼈：张朔⽬录1项⽬背景 (1)1.1任务来源 (1)1.2⼯作过程 (1)2标准制订的必要性分析 (3)2.1叶绿素A的环境危害 (3)2.2相关环保标准和环保⼯作的需要 (4)3国内外相关分析⽅法研究 (5)3.1主要国家、地区及国际组织相关分析⽅法研究 (5)3.2国内相关分析⽅法研究 (8)4标准制订的基本原则和技术路线 (10)4.1标准制订的基本原则 (10)4.2标准制订的技术路线 (10)5⽅法研究报告 (12)5.1⽅法研究的⽬标 (12)5.2⽅法原理 (13)5.3试剂和材料 (13)5.4仪器和设备 (16)5.5样品的采集和保存 (17)5.6分析步骤 (21)5.7结果计算 (31)5.8质量保证和质量控制 (34)5.9注意事项 (34)6⽅法验证 (35)6.1⽅法验证⽅案 (35)6.2⽅法验证过程 (36)7与开题报告的差异说明 (38)8本标准实施的建议 (39)9参考⽂献 (39)《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》编制说明1项⽬背景1.1任务来源（1）2006年6⽉，根据《关于下达2006年度国家环境保护标准制订项⽬计划的通知》（环办函[2006]371号），原国家环保总局办公厅下达了制订《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》国家环保标准制修订计划，项⽬统⼀编号为：939。
（2）《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》项⽬承担单位为：辽宁省环境监测实验中⼼。
1.2 ⼯作过程1.2.1 前期调研⼯作（1）成⽴标准编制组2006年7⽉，辽宁省环境监测中⼼承接了《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》制修订任务以后，成⽴了标准编制组。
分光光度法测定叶绿素a方法比较王康1，凌彦群2（1.四川省乐山井研县环境监测站，四川乐山613100；2.四川省乐山市环境监测站，四川乐山616400）摘要：叶绿素a作为评价水体富营养化程度的重要指标之一，探讨其监测分析方法的实用性具有重要的现实意义。
本文通过实验分析比较了叶绿素a测定中的两种样品处理方法——研磨萃取法和反复冻融-浸提法的优缺点；采用分析实验数据统计处理方法评价叶绿素a的测定值。
结果表明：用反复冻融-浸提法处理水样具有安全、高效特性，750nm处吸光度值容易达到0.005；两种分析方法得到的结果无显著性差异；由此两法在室内所获得的分析结果具有可比性。
关键词：分光光度法；叶绿素a；研磨萃取法；反复冻融-浸提法Comparison of the Analysis Methods for Chlorophyll-a bySpectrophotometryWANG Kang1，LING Y anqun2（1.Environmental monitoring station of Jingyan, Leshan, 613100, China；2.Environmental monitoringstation of Leshan, Leshan, 614000, China）Abstract:Chlorophyll-a is one of index in eutrophication for water. Grinding extraction method and repeated freeze-thaw extraction method is the two methods for sample pretreatment in Determination of chlorophyll-a by spectrophotometry. The experiment showed that repeated freeze-thaw extraction method is increase efficiency and safer. The absorbance is less than 0.005 in 750nm. There was no difference of Two computing formulae results.Keywords:spectrophotometry, chlorophyll-a, grinding extraction method, repeated freeze-thaw extraction method叶绿素a是衡量湖泊、水库、河流等水体富营养化程度的重要指标之一。
水体叶绿素a测定方法文稿归稿存档编号：[KKUY-KKIO69-OTM243-OLUI129-G00I-FDQS58-叶绿素a的测定方法——乙醇+分光光度法1、水样的保存水样注入水样瓶后，应放置在阴凉处，并避免阳光直射。
若水样的进一步处理需要较长时间（大于12h），则应置于0℃~4℃低温下保存。
水样量视水体中浮游植物多少而定，一般应采0.5~2L。
2、抽滤在抽滤装置的滤器中放入GF/C滤膜。
抽滤时负压应不大于50kPa。
抽滤完毕后，用镊子小心地取下滤膜，将其对折（有藻类样品的一面向里），再用普通滤纸吸压，尽量去除滤纸上的水分。
如不立即提取，应将滤膜放在黑暗低温条件下保存。
在普通冰箱冷冻室中可存放几天，在-20℃低温冰箱中可保存30天。
3、提取研磨可用玻璃研钵。
将滤膜剪碎放入研钵，加入90%乙醇溶液7~8ml，研磨3~5分钟直至变为匀浆。
将研磨后的匀浆移入具塞带刻度的离心管中。
用少量提取液冲洗研钵或匀浆器，冲洗液并入离心管中，使终容积略小于10ml。
盖上关塞，摇动后置于黑暗低温处进行提取至少6-24h。
4、离心将装有提取液的离心管放入离心机中，转速3500~4000rpm，离心10~15min。
将上层叶绿素提取液移入定量试管中，再用少量提取液清洗、离心二次取得提取液。
最后将提取液定容到10ml。
如果大批样品需同步操作时，可减少离心步骤，直接在提取液中浸泡滤膜6-24h，取其清液即可。
5、测定用90%乙醇溶液作为参照液（参照比色皿中盛放90%乙醇溶液，并用90%乙醇调分光光度计零点）。
测定定容后的提取液在665nm和750nm处的吸光度，并计算两个吸光度的差记为A1；然后向比色皿中加入1滴1mol/L的盐酸酸化，酸化5—10min(可以用不同时间实验再进行调整)后再次测定酸化后的提取液在665和750nm处的吸光度，并且把酸化后的两个吸光度的差记为A2.则提取液中叶绿素a的浓度为：Chla=27.9×（A1－A2）×V提取液/V脱镁叶绿素浓度为：Chla=27.9×（1.7 A2－A1）×V提取液/V其中Chla为水样中的叶绿素a含量，单位为ug/L；V提取液为提取液的最终定容体积,单位为mL；V为抽滤水样的体积，单位为L。
标题：水质中叶绿素a的测定——荧光分光光度法一、概述水是生命之源，保持水质清洁对人类健康和生态环境至关重要。
叶绿素a是植物和浮游生物体内的主要叶绿素成分，它对于水体中的生物和化学过程具有重要影响。
对水体中叶绿素a的测定具有重要意义。
在众多叶绿素测定方法中，荧光分光光度法以其快速、灵敏、准确的特点而受到广泛关注。
二、荧光分光光度法原理及优势1. 荧光分光光度法原理荧光分光光度法是通过叶绿素a在特定激发光波长下产生荧光信号，并测定荧光光谱的强度来间接测定叶绿素a的浓度的一种方法。
其原理是叶绿素a在特定波长范围内吸收光线后发生激发态转变为基态过程中发射荧光。
通过检测叶绿素a的荧光强度，可以推断水体中叶绿素a的浓度。
2. 荧光分光光度法优势a. 灵敏度高：荧光分光光度法对叶绿素a含量的检测具有高灵敏度，能够在较低浓度范围内进行准确测定。
b. 非破坏性：该方法无需对样品进行破坏性处理，不影响样品原有特性，适用于连续监测和长期调查。
c. 快速准确：荧光分光光度法测定简单快速，结果准确可靠。
三、荧光分光光度法测定叶绿素a的步骤1. 样品采集样品来源于自然水体或实验室模拟水体。
应在样品收集后尽快进行实验分析，或进行样品的冷冻保存。
2. 仪器调试根据仪器操作手册调试荧光分光光度仪，确定最佳激发波长和检测波长。
3. 样品处理将样品进行预处理，如滤过滤膜去除颗粒物，或使用溶解剂提取叶绿素a。
4. 校准仪器利用标准叶绿素a溶液校准荧光分光光度仪，确定荧光强度和叶绿素a浓度的线性关系。
5. 测定样品放置校准后的仪器测定样品荧光强度，根据标准曲线计算叶绿素a 的浓度。
四、荧光分光光度法在水质监测中的应用荧光分光光度法在水质监测中具有广泛的应用价值，主要体现在以下几个方面：1. 监测水体富营养化程度：叶绿素a是水体富营养化的重要指标之一，荧光分光光度法可以快速准确地测定水体中叶绿素a的含量，从而评估水体富营养化程度。
2. 生态环境评估：荧光分光光度法可对水体中微生物的活性和生态环境进行评估，对水体生物多样性和生态平衡的研究具有重要意义。
HJ897-2017水质叶绿素a的测定分光光度法Water quality—Determination of chlorophyll a—Spectrophotometric method（发布稿）本电子版为发布稿。
请以中国环境出版社出版的正式标准文本为准。
2017-12-21发布2018-02-01实施环境保护部发布目次前言 (ii)1适用范围 (1)2规范性引用文件 (1)3方法原理 (1)4试剂和材料 (1)5仪器和设备 (2)6样品 (2)7分析步骤 (3)8结果计算与表示 (4)9精密度和准确度 (4)10质量保证和质量控制 (5)11废物处理 (5)i前言为贯彻《中华人民共和国环境保护法》和《中华人民共和国水污染防治法》，保护环境，保障人体健康，规范水中叶绿素a的测定方法，制定本标准。
本标准规定了测定地表水中叶绿素a的分光光度法。
本标准为首次发布。
本标准由环境保护部环境监测司和科技标准司组织制订。
本标准起草单位：辽宁省环境监测实验中心。
本标准验证单位：上海市环境监测中心、大连市环境监测中心、丹东市环境监测中心站、辽阳市环境监测站、朝阳市环境监测中心站和辽宁北方环境检测技术有限公司。
本标准环境保护部2017年12月21日批准。
本标准自2018年2月1日起实施。
本标准由环境保护部解释。
ii水质叶绿素a的测定分光光度法警告：丙酮对人体健康有一定危害，操作时应在通风橱中进行，佩戴防护器具，避免接触皮肤和衣物。
1适用范围本标准规定了测定水中叶绿素a的分光光度法。
本标准适用于地表水中叶绿素a的测定。
本标准测定丙酮提取液中叶绿素a的检出限为0.04mg/L。
当取样体积为200ml，丙酮提取液体积为10ml时，本方法的检出限为2μg/L，测定下限为8μg/L。
2规范性引用文件本标准引用了下列文件或其中的条款。
凡是不注日期的引用文件，其有效版本适用于本标准。
GB/T14581水质湖泊和水库采样技术指导HJ494水质采样技术指导HJ/T91地表水和污水监测技术规范3方法原理将一定量样品用滤膜过滤截留藻类，研磨破碎藻类细胞，用丙酮溶液提取叶绿素，离心分离后分别于750nm、664nm、647nm和630nm波长处测定提取液吸光度，根据公式计算水中叶绿素a的浓度。
两种方法测定地表水中叶绿素a的比较康琦【摘要】比较了分光光度法和高效液相色谱(HPLC)法测定地表水中叶绿素a的结果.研究表明:两种方法的精密度无显著差异;叶绿素a标准样品测定结果也无显著差异;在测定地表水样品时,分光光度法测定结果高于HPLC法,差异主要由664 nm波长下有较强吸收的物质造成.分光光度法测定结果偏高但操作简单,HPLC法测定结果精准但操作复杂,分光光度法在水质监测工作中更加具有优势.%The determination results of chlorophyll a in surface water were compared between spectrophotometry and high performance liquid chromatography ( HPLC ) . The study showed that there was no significant difference in the precision of the two methods, as well as the chlorophyll a standard determination results. When it came to surface water samples, the results of spectrophotometry were higher than those of HPLC. The difference was mainly made by substances with strong absorption at 664 nm. Spectrophotometry was not accurate but easy to operate, HPLC was accurate but complicated, spectrophotometry had more advantage in monitoring water quality.【期刊名称】《广州化工》【年(卷),期】2018(046)011【总页数】3页(P71-73)【关键词】地表水叶绿素a;分光光度法;HPLC法【作者】康琦【作者单位】青浦区环境监测站,上海 201799【正文语种】中文【中图分类】X832叶绿素a存在于所有浮游植物中，且在一定程度上可以表征浮游植物的生物量[1]。
方法验证报告项目名称：水质叶绿素ａ的测定方法名称：《水质叶绿素ａ的测定分光光度法》HJ897-2017报告编写人：参加人员：审核人员：报告日期：1 实验室基本情况1.1 人员情况实验室检测人员已通过标准《水质叶绿素ａ的测定分光光度法》HJ897-2017的培训，熟知标准内容、检测方法及样品数据采集和处理等，考核合格，得到公司技术负责人授权上岗。
表1参加验证人员情况登记表1.2 检测仪器/设备情况表2主要仪器基本情况1.3 检测用试剂情况表3主要试剂及溶剂基本情况1.4 环境设施和条件情况实验室具有校准合格的温湿度计，环境可以控制在标准要求范围内，满足检测环境条件。
另外实验室配备了洗眼器、喷淋设施、护目镜、灭火器等的安全防护措施，符合实验室安全内务的要求。
2 实验室检测技术能力2.1方法原理将一定量样品用滤膜过滤截留藻类，研磨破碎藻类细胞，用丙酮溶液提取叶绿素，离心分离后分别于750nm、664nm、647nm、630nm波长处测定提取液的吸光度，根据公式计算水中叶绿素ａ的浓度。
2.2.样品的采集按照GB/T14581、HJ/T91和HJ494中的相关规定进行样品的采集。
样品的采集用有机玻璃采水器采集水面下0.5m样品，采样体积为1L，在样品中加入1ml碳酸镁悬浊液，以防止酸化引起色素溶解。
2.2.样品的保存样品采集后应在0℃-4℃避光保存、运输，24h内运送至检测实验室过滤（若样品24h 不能送达检测实验室，应现场过滤，滤膜避光冷冻运输）。
2.3试样的制备2.3.1过滤在过滤装置上装好玻璃纤维滤膜。
确定取样200ml（根据水体的营养状态确定取样体积富营养和中营养过滤体积为100-200ml，贫营养过滤体积为500-1000ml），用量筒量取200ml混匀的样品，进行过滤，最后用少量的蒸馏水冲洗滤器壁。
过滤时负压不超过50kpa，在样品刚刚完全通过滤膜时结束抽滤，用镊子将滤膜取出，将有样品的一面对折，用滤纸吸干滤膜水分。
分光光度法测定水中的叶绿素a
分光光度法测定水中的叶绿素a
1 检出限
水样体积300 mL、使用1 cm比色皿时，叶绿素a的检出限为0.11 μg/L，测定下限为0.5 μg/L；叶绿素b的检出限为0.25 μg/L，测定下限为1.0 μg/L；叶绿素c的检出限为0.25 μg/L，测定下限为1.0 μg/L。
2 方法原理
将一定量水样用玻璃纤维膜过滤，收集藻类，使用反复冻融法对藻类细胞进行破碎，用90%丙酮溶液提取叶绿素，根据叶绿素光谱依次测定750 nm、664 nm、647 nm、630 nm波长下的吸光度，计算叶绿素含量。
3 试剂和材料
3.1 碳酸镁悬浊液：ω（MgCO3）= 1%，1.0 gMgCO3 100 mL纯水
3.2 丙酮溶液：ψ（C3H6O）= 90%，900 mL丙酮加100 mL纯水
3.3 盐酸溶液：c（HCl）=0.1 mol/L。
8.5 mL浓盐酸加入500 mL纯水，冷却后稀释至1000 mL。
4 仪器和设备
4.1 抽滤装置
4.2 滤膜
4.3 具塞玻璃离心管
4.4 水浴锅
4.5 离心机：转速3000 ~ 4000 r/min
4.6 分光光度计
4.7 比色杯：3 cm
5 水样采集
5.1 水样采集
采集500 ~ 1000 mL 水样于棕色玻璃瓶或深色塑料瓶中。
5.2 保存
避光保存，低温运输，在-20℃以下的冰箱内保存，在25 d 内分析测试。
6 分析步骤
6.1 清洗玻璃仪器
所有玻璃仪器应该清洗干净，尤其避免酸性条件下引起的叶绿素a 的分解。
6.2 滤膜过滤
每种测定水样取300 mL ，加入0.6 mLMgCO 3悬浊液，用滤膜过滤。
6.3 提取
将滤膜转移至具塞试管，加少量碳酸镁粉末和10 mL 已水浴加热至50℃的90%丙酮溶液。
塞紧塞子并在管子外部罩上遮光物，充分震荡，避光提取4 h 。
6.4 离心
提取完毕后，离心管置于离心机上4000 r/min 离心20 min ，取出离心管，用移液管将上清液移入刻度离心管中，塞紧塞子，4000 r/min 再离心10 min 。
记录提取液的体积。
6.5 测定光密度
移入3 cm 比色杯中，以90%的丙酮溶液做为空白，分别在750 nm 、664 nm 、647 nm 、630 nm 波长处测定吸光值。
注意：664 nm 光密度值要求在0.2与1.0之间，如果不在范围内应改变水样量。
7 结果计算 7.1 叶绿素计算公式
[]6647506477506307501chl 211.85() 1.54()0.08()a
A A A A A A V V L
ρ------=
[]6647506477506307501chl 221.03() 5.43() 2.66()b A A A A A A V V L ρ------=
[]6647506477506307501chl 224.52()7.60() 1.67()c A A A A A A V V L ρ------=
式中：
V 1——提取液体体积，mL V 2——水样体积，L
L ——比色皿光程，cm 。
L = 3 cm 。
8 富营养化评价标准
表1 湖泊富营养化的叶绿素a 评价标准
类型
贫营养型中营养型富营养型叶绿素a 浓度（μg/L ）≤4 4 - 10
10 - 150。
