水体叶绿素a测定方法

⽔质叶绿素a的测定分光光度法编制说明附件3《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》（征求意见稿）编制说明《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》标准编制组⼆○⼀五年⼋⽉项⽬名称：⽔质叶绿素a的测定分光光度法项⽬统⼀编号：939承担单位：辽宁省环境监测实验中⼼编制组主要成员：王秋丽、赵丽娟、王琳、丁振军、刘畅、徐天赐、姜永伟、秦⾬、郭杨、朱⼴钦、叶明、贺业菊标准所技术管理负责⼈：周⽻化、雷晶、张虞标准处项⽬负责⼈：张朔⽬录1项⽬背景 (1)1.1任务来源 (1)1.2⼯作过程 (1)2标准制订的必要性分析 (3)2.1叶绿素A的环境危害 (3)2.2相关环保标准和环保⼯作的需要 (4)3国内外相关分析⽅法研究 (5)3.1主要国家、地区及国际组织相关分析⽅法研究 (5)3.2国内相关分析⽅法研究 (8)4标准制订的基本原则和技术路线 (10)4.1标准制订的基本原则 (10)4.2标准制订的技术路线 (10)5⽅法研究报告 (12)5.1⽅法研究的⽬标 (12)5.2⽅法原理 (13)5.3试剂和材料 (13)5.4仪器和设备 (16)5.5样品的采集和保存 (17)5.6分析步骤 (21)5.7结果计算 (31)5.8质量保证和质量控制 (34)5.9注意事项 (34)6⽅法验证 (35)6.1⽅法验证⽅案 (35)6.2⽅法验证过程 (36)7与开题报告的差异说明 (38)8本标准实施的建议 (39)9参考⽂献 (39)《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》编制说明1项⽬背景1.1任务来源（1）2006年6⽉，根据《关于下达2006年度国家环境保护标准制订项⽬计划的通知》（环办函[2006]371号），原国家环保总局办公厅下达了制订《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》国家环保标准制修订计划，项⽬统⼀编号为：939。

（2）《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》项⽬承担单位为：辽宁省环境监测实验中⼼。

1.2 ⼯作过程1.2.1 前期调研⼯作（1）成⽴标准编制组2006年7⽉，辽宁省环境监测中⼼承接了《⽔质叶绿素a的测定分光光度法》制修订任务以后，成⽴了标准编制组。

浅析地表水叶绿素a的测定地表水叶绿素a是指水体中存在的一类儿茶酚类色素，其含量是反映水体生物量的重要指标。

地表水叶绿素a可以通过多种方法进行测定，本文将从测定原理、测定方法、测定前样品的处理等方面进行分析。

地表水叶绿素a可以通过光谱分析的方法进行测定。

其原理是利用叶绿素a具有吸收红外光的特性，通过分析吸收的比例可以确定叶绿素a的含量。

在测定过程中，首先需要将样品过滤，以去除悬浮颗粒和有机物。

然后，通过光谱分析，可以得到在不同波长下吸光度的数据，进而得到叶绿素a的含量。

1. 高效液相色谱法高效液相色谱法是目前常用的测定地表水叶绿素a的方法之一。

在该方法中，需要使用高效液相色谱仪进行测定。

首先，将样品处理后通过高效液相色谱柱进行分离。

然后，通过检测出样品中叶绿素a在不同波长下的吸光度，来计算其含量。

2. 电泳法电泳法通过电泳分离的原理，分离出未知样品中叶绿素a，然后通过计算分离的系统电泳图谱中的峰面积，来计算样品中的叶绿素a含量。

3. 荧光法荧光法可以使用激光光源来激发样品中叶绿素a分子，从而使其发射荧光，然后通过检测荧光强度来计算叶绿素a的含量。

在进行地表水叶绿素a测定前，需要先处理样品。

这是因为样品中可能存在许多干扰物，如悬浮颗粒和有机物，这些干扰物会影响到测定结果。

常见的样品处理方法包括：1. 过滤法通过过滤样品，去除其中的悬浮颗粒和其他杂质。

在过滤时应选用适当的大小和类型的过滤器，使得过滤后的样品中的颗粒和其他杂质都能够被完全除去。

2. 沉淀法通过使用化学沉淀方法，如硫酸铝沉淀法等，将有机物或其他干扰物从样品中沉淀出来，然后去除沉淀物，以得到更纯净的样品。

叶绿素a测定实验报告（一）实验目的及意义水体富营养化可以通过跟踪监测水中叶绿素的含量来实现，其中叶绿素a是所有叶绿素中含量最高的，因此叶绿素a的测定能示踪水体的富营养化程度。

（二）水样的采集与保存1.确定具体采样点的位置2.在采样点将采样瓶及瓶盖用待测水体的水冲洗3-5遍3.将采样瓶下放到距水面0.5-1m处采集水样2.5L4.在采样瓶中加保存试剂，每升水样中加1%碳酸镁悬浊液1mL5.将采样瓶拧上并编号6.用GPS同步定位采样点的位置（三）仪器及试剂仪器：1.分光光度计2.比色池：10mm3.过滤装置：过滤器、微孔滤膜（孔径0.45μm，直径60mm）4.研钵5.常用实验设备试剂：1.碳酸镁悬浮液：1%。

称取1.0g细粉末碳酸镁悬浮于100mL蒸馏水中。

每次使用时要充分摇匀2.乙醇溶液（四）实验原理将一定量的试样用微孔滤膜过滤，叶绿素会留在滤膜上，可用乙醇溶液提取。

将提取液离心分离后，测定750、663、645、630mm的吸光度，计算叶绿素的浓度。

（五）实验步骤1.浓缩：在一定量的试样中添加0.2mL碳酸镁悬浮液，充分搅匀后，用直径60mm 的微孔滤膜吸滤.过滤器内无水分后,还要继续抽吸几分钟.如果要延时提取,可把载有浓缩样品的滤膜放在干燥器里冷冻避光贮存。

2. 提取：将载有浓缩样品的滤膜放入研钵中，加入7mL乙醇溶液至滤纸浸湿的程度,把滤膜研碎,再少量地加乙醇溶液，把滤膜完全研碎，然后用乙醇溶液将已磨碎的滤膜和乙醇溶液洗入带刻度的带塞离心管中，使离心管内提取液的总体积不超过10mL，盖上管塞，置于的暗处浸泡24h。

3.离心：将离心管放入离心机中，以4000r/min速度离心分离20min。

将上清液移入标定过的10mL具塞刻度管中，加少量乙醇于原提取液的离心管中，再次悬浮沉淀物并离心，合并上清液。

此操作重复2-3次，直至沉淀不含色素为止，最后将上清液定容至10mL。

4.测定：取上清液于10mm的比色池中，以乙醇溶液为对照溶液，读取波长750,663,645和630mm的吸光度。

水生生态系统初级生产力的测定——叶绿素法一、实验目的1.学习测定水体初级生产力的原理和操作过程。

2.学习估算水体初级生产力方法，为评价水体生产性能做准备。

二、实验原理叶绿素a是植物光和作用的重要光合色素，在一定的光照强度下，叶绿素a的含量与光合作用强度之间存在密切关系，因此，叶绿素a的含量是水生生态系统初级生产力的中的重要指标。

同时，叶绿素a的含量的测定，也可以用于水体富营养化水平的评价，是水质监测的重要项目。

浮游植物叶绿素的测定方法常用分光光度法，初级生产力Ps=CaQ(Q=3.7)三、实验器具及试剂采水器、抽滤器、研钵、滤纸、玻璃棒、矿泉水瓶、分光光度计、离心机、漏斗、丙酮等三、实验步骤取适量水样，加少量碳酸镁粉，经滤膜减压过滤，截留水样的浮游植物细胞；将滤膜放入冰箱低温干燥后，以90％丙酮研磨提取样品滤膜，将滤液离心分离，提取上清液定容10mL 比色管，于1cm比色皿中，以90％丙酮为参比，在TU- 1901 型分光光度计于750nm、663nm、645nm、630nm 波长处测定吸光度值后，按下式计算叶绿素含量。

叶绿素a （mg/m3） = [11.64（A663- A750）- 2.16(A645- A750)+0.10(A630- A750)]×V1/(V×C)五、实验结果叶绿素a含量的计算叶绿素a （mg/m3） = [11.64（A663- A750）- 2.16(A645- A750)+0.10(A630- A750)]×V1/(V ×C)C——比色皿光程(1cm)；A——吸光度；V1——提取液定容后体积(mL)；V——水样体积(L)所以叶绿素a的含量Ca=11.64（0.036- 0.014）- 2.16(0.019- 0.014)+0.10(0.020- 0.014)]×2.8/(0.5×10)=1.374（mg/m3）2.初级生产力的估算Ps=1000CaQCa——为表层叶绿素a含量（mg/m3）Q——通话系数（3.7）所以Ps=1000CaQ=1.374×3.7=5.0801六、分析和讨论结果分析有以上数据显示，华师湖泊表层水的叶绿素含量为1.374（mg/m3），初级生产（mgC/mgChla.h）。

浅析地表水叶绿素a的测定地表水是指地球表面流动或静止的水体，是人类生活和生产所必需的重要资源之一。

地表水的质量直接关系到人类的健康和生存环境，其中叶绿素a是一种能够反映水体叶绿素含量的重要指标。

本文将对地表水叶绿素a的测定进行浅析，以期为相关工作者提供一定的参考。

一、地表水叶绿素a的概述叶绿素a是光合作用中最主要的光合色素，也是植物和浮游植物的绿色素。

它是一种重要的生物标志物，是测定水质的重要指标之一。

叶绿素a的含量可以反映水体的营养盐含量、浊度和有机物质等。

一般情况下，水体中含有叶绿素a的浓度越高，其水质也就越差。

测定地表水中叶绿素a的含量对于评价水质具有重要意义。

二、地表水叶绿素a的测定方法1. 比色法比色法是测定叶绿素a含量的常用方法之一，可以根据样品的吸光度值来计算出叶绿素a的浓度。

具体测定步骤为：首先将样品经过预处理后，用特定的波长的光源辐射，测出样品的吸光度值，然后根据已知的标准曲线来计算叶绿素a的浓度。

2. 高效液相色谱法高效液相色谱法是一种精密准确的测定方法，通过色谱柱的分离和检测系统的测定，可以快速准确地测定出叶绿素a的含量。

这种方法的优点是测定结果准确可靠，可以应用于对于叶绿素a的精确测定。

3. 荧光法荧光法是一种快速灵敏的测定方法，通过叶绿素a在光照下的荧光特性来快速准确地测定其含量。

这种方法的优点是操作简便，结果迅速，适用于对叶绿素a含量的快速筛查。

三、地表水叶绿素a的影响因素1. 光照条件光照条件是影响叶绿素a含量的重要因素之一，充足的光照可以促进叶绿素a的生物合成，有利于提高其含量。

2. 营养盐含量水体中的营养盐含量是影响叶绿素a含量的关键因素之一，过高或过低的营养盐含量都会影响叶绿素a的生物合成。

3. 温度水体中的温度也会对叶绿素a的含量产生一定的影响，适宜的温度条件有利于叶绿素a的稳定合成和积累。

4. pH值水体的酸碱度也会对叶绿素a的含量产生一定的影响，过高或过低的pH值都会影响叶绿素a的生物合成和稳定性。

标题：水质中叶绿素a的测定——荧光分光光度法一、概述水是生命之源，保持水质清洁对人类健康和生态环境至关重要。

叶绿素a是植物和浮游生物体内的主要叶绿素成分，它对于水体中的生物和化学过程具有重要影响。

对水体中叶绿素a的测定具有重要意义。

在众多叶绿素测定方法中，荧光分光光度法以其快速、灵敏、准确的特点而受到广泛关注。

二、荧光分光光度法原理及优势1. 荧光分光光度法原理荧光分光光度法是通过叶绿素a在特定激发光波长下产生荧光信号，并测定荧光光谱的强度来间接测定叶绿素a的浓度的一种方法。

其原理是叶绿素a在特定波长范围内吸收光线后发生激发态转变为基态过程中发射荧光。

通过检测叶绿素a的荧光强度，可以推断水体中叶绿素a的浓度。

2. 荧光分光光度法优势a. 灵敏度高：荧光分光光度法对叶绿素a含量的检测具有高灵敏度，能够在较低浓度范围内进行准确测定。

b. 非破坏性：该方法无需对样品进行破坏性处理，不影响样品原有特性，适用于连续监测和长期调查。

c. 快速准确：荧光分光光度法测定简单快速，结果准确可靠。

三、荧光分光光度法测定叶绿素a的步骤1. 样品采集样品来源于自然水体或实验室模拟水体。

应在样品收集后尽快进行实验分析，或进行样品的冷冻保存。

2. 仪器调试根据仪器操作手册调试荧光分光光度仪，确定最佳激发波长和检测波长。

3. 样品处理将样品进行预处理，如滤过滤膜去除颗粒物，或使用溶解剂提取叶绿素a。

4. 校准仪器利用标准叶绿素a溶液校准荧光分光光度仪，确定荧光强度和叶绿素a浓度的线性关系。

5. 测定样品放置校准后的仪器测定样品荧光强度，根据标准曲线计算叶绿素a 的浓度。

四、荧光分光光度法在水质监测中的应用荧光分光光度法在水质监测中具有广泛的应用价值，主要体现在以下几个方面：1. 监测水体富营养化程度：叶绿素a是水体富营养化的重要指标之一，荧光分光光度法可以快速准确地测定水体中叶绿素a的含量，从而评估水体富营养化程度。

2. 生态环境评估：荧光分光光度法可对水体中微生物的活性和生态环境进行评估，对水体生物多样性和生态平衡的研究具有重要意义。

海洋生物学实验浮游植物叶绿素含量的测定一、实验目的：１、通过浮游植物细胞密度与单位水体叶绿素a（Chla）含量的测定，了解浮游植物数量和生物量的表示方法，并对不同粒径浮游植物加以比较。

２、学会使用采水瓶、水样固定、浓缩及浮游植物计数框的方法，掌握叶绿素ａ的测定方法。

二、原理：见《海洋生态学》P192-194生物量是指某一特定时间、某一特定范围内存在的有机体的量。

浮游植物是海洋生态系统的初级生产者，而初级生产水平与叶绿素a 含量存在密切关系，因而往往用叶绿素a含量来表示浮游植物的生物量。

海洋生态系统的种类组成结构以及能流、物质流特征与初级生产者的粒径大小有密切关系。

不同类型海区初级生产者的粒径组成存在很大差异，了解某一特定海区初级生产者的粒径组成，有助于深入研究海区的新生产力水平、营养平衡状态等结构、功能特征。

三、仪器与设备：１、分光光度计3、采水瓶4、抽滤器5、微孔滤膜6、冰箱7、离心机四、药品与试剂：丙硐、甲醛、MgCO3等。

五、实验步骤：1、采样：选择完站位后，以500mL、或1000mL采水瓶采取一定水层（也可几个水层比较）的水样。

2、水样处理：将所取水样分别以0.45μm微孔滤膜（叶绿素a 总量）、2μm核孔滤膜（＞2μm孔径叶绿素a含量）以及先经20μm孔径筛绢过滤后再以2μm核孔滤膜（2-20μm孔径叶绿素a含量）过滤，以90%丙酮溶解滤膜后冰冻过夜。

3、数据测定：滤膜冰冻24小时后取出离心，取上清液于分光光度计测定叶绿素a含量（方法见附页），将所得不同孔径叶绿素a 含量及占叶绿素a总量比例等数据填入测定数据表中。

附：叶绿素a含量测定方法（分光光度法）：A．检测限：0.02mg/m3。

B．方法概述：已知体积的海水以玻璃纤维过滤器过滤，用90％丙酮将色素从滤器上萃取出来，其浓度以分光光度法测定。

C．仪器和设备：１、分光光度计２、抽滤器３、电动吸引器４、采水瓶５、微孔滤膜６、离心沉淀器７、冰箱８、离心管D．取样方法和贮存：将0.5-10升海水经0.45μm微孔滤膜过滤。

实验三富营养化湖中藻量的测定（叶绿素a法）一、实验目的富营养化湖由于水体受到污染，尤以氮磷为甚，致使其中的藻类旺盛生长。

此类水体中代表藻类的叶绿素a浓度常大于10微克/升。

本实验通过测定不同水体中藻类叶绿素a浓度，以考查其富营养化情况。

二、器材与用品1、分光光度计（波长选择大于750nm，精度为0.5－2nm）。

2、比色杯（1cm；4cm）。

3、台式离心机（3500r/min）4、离心管（15ml具刻度和塞子）；冰箱5、匀浆器或小研钵。

6、蔡氏滤器；滤膜（0.45微克，直径47mm）。

7、真空泵（最大压力不超过300kpa）。

8、MgCO3悬液：lg MgCO3细粉悬于100ml蒸馏水中。

9、90％的丙酮溶液：90份丙酮＋10份蒸馏水。

10、水样：两种不同污染程度的湖水水样各2L.三、方法和步骤1、按浮游植物采样方法，湖泊、水库采样500ml，池塘300ml。

采样点及采水时间同“浮游植物”。

2、清洗玻璃仪器：整个实验中所使用的玻璃仪器应全部用洗涤剂清洗干净，尤其应避免酸性条件下而引起的叶绿素a分解。

3、过滤水样；在蔡氏滤器上装好滤膜，每种测定水样取50－500ml减压过滤。

待水样剩余若干毫升之前加入0.2ml MgCO3悬液、摇匀直至抽干水样。

加入MgCO3可增进藻细胞滞留在滤膜上，同时还可防止提取过程中叶绿素a被分解。

如过滤后的载藻滤膜不能马上进行提取处理，应将其置于干燥器内，放冷（4℃）暗处保存，放置时间最多不能超过48小时。

4、提取；将滤膜放于匀浆器或小研钵内，加2－3ml90％的丙酮溶液，匀浆，以破碎藻细胞。

然后用移液管将匀浆液移入刻度离心管中，用5ml90％丙酮冲洗2次，最后向离心管中补加90％丙酮，使管内总体积为10ml。

塞紧塞子并在管子外部罩上遮光物，充分振荡，放冰箱避光提取18－24小时。

5、离心：提取完毕后，置离心管于台式离心机上3500r/min，离心10min，取出离心管，用移液管将上清液移入刻度离心管中，塞上塞子，3500r/min在离心10min。

水体浮游植物叶绿素a含量的测定实验简介叶绿素a是估算浮游植物生物量的重要指标。

浮游植物叶绿素a的测定方法较多，目前大多采用Lorenzen 提出的单色法，此法只测定叶绿素a，并对脱镁叶绿素a的干扰进行了校正。

通过实验，学习用热乙醇法对不同水体浮游植物叶绿素a含量的测定方法。

必做实验，6学时。

一、实验目的通过对不同水体叶绿素a含量的测定，了解水生生态系统浮游植物生物量的估算方法，进一步认识浮游植物在水体生态系统生产中的重要地位。

二、实验原理浮游植物的主要光合色素是叶绿素(Chlorophyll)，常见的有叶绿素a、b 和c。

叶绿素a存在于所有的浮游植物中，大约占有机物干重的1～2%，是估算浮游植物生物量的重要指标。

浮游植物叶绿素a的测定方法较多，主要有高效液相色谱法（HPLC法）、分光光度计法和荧光光度计法三种。

高效液相色谱法能精确测定各种光合色素的含量，但仪器昂贵，分析操作步骤繁琐。

荧光法具有较高的灵敏度，但需要荧光光度计等设备。

分光光度法又分为三色法和单色法两种。

过去通常采用三色法，但由于结果计算较粗，误差大，现已较少采用。

目前大多采用Lorenzen 提出的单色法，此法只测定叶绿素a，并对脱镁叶绿素a的干扰进行了校正。

根据萃取溶剂不同Lorenzen 单色法又分为丙酮法和乙醇法，我国多年来一直使用丙酮法。

近年来国际上从萃取效果、安全和保健等考虑，已逐渐改用乙醇法。

三、实验用品721型分光光度计（或同类产品）、抽滤器（47mm不锈钢或有机玻璃抽滤器）、真空泵、医用离心机、可调节控温水浴锅、温度计、冰箱、醋酸纤维滤膜（直径47mm孔径0.45微米）、90%乙醇，1mol/L盐酸、10 ml离心管，250ml玻璃三角瓶。

四、实验操作1．按浮游植物采样方法采集水样。

在抽滤器上装好醋酸纤维滤膜（或玻璃纤维滤纸）。

取合适体积水样（一般湖泊、水库取样500ml，池塘250ml）经滤膜过滤后，将带样品的滤膜向内对折，放入10 ml离心管，保存于冰箱冷冻室，若置于低温冰箱（-20℃）中，则可较长期（三个月）保存样品。