黑曲霉酸性_甘露聚糖酶的纯化及部分性质研究

甘露聚糖酶的酶学性质研究甘露聚糖酶是一种半纤维素水解酶，以内切方式降解β-1，4糖苷键，降解产物的非还原末端为甘露糖，其作用底物包括葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖及β-甘露聚糖等。

它不仅能够降解肠道粘度，促进营养物质的消化和吸收，而且还可消除豆类中富含的β-甘露聚糖对葡萄糖吸收的干扰，极大提高饼粕尤其是豆粕的能量消化率；同时，添加了甘露聚糖酶后动物的抵抗力及整齐度都有提高。

甘露聚糖类物质作为半纤维素的第二大组分，广泛分布于自然界中。

它是所有豆科植物细胞壁的主要组成成分，在其他植物性饲料原料中含量也很高，如豆粕、小麦、菜籽粕、麸皮中半乳甘露聚糖占非淀粉多糖的含量分别为22.7％，11.9％，19.6％和33.7％。

我国猪、鸡的主要日粮是玉米／豆粕型日粮，尽管猪、鸡等单胃动物对玉米的消化率较高，但对豆粕的能量利用率仅为50％～60％。

单胃动物对豆粕能量的利用率如此低的原因可能是豆粕中含有22.7％左右的半纤维素是不能被单胃动物消化的非淀粉多糖。

饲料中添加甘露聚糖酶可以降解甘露聚糖、降低消化道内容物黏度，破坏植物性饲料细胞壁结构，使营养物质能与消化酶充分接触，提高内源酶的活性，改善肠道微生物菌群和提高肠粘膜的完整性等功能。

本文旨在通过对康地恩甘露聚糖酶的酶学性质研究，掌握有关数据，为实际应用提供理论依据和指导。

1材料与方法1.1 材料与试剂康地恩甘露聚糖酶；甘露聚糖（Sigma公司）；3,5—二硝基水杨酸（DNS）；甘露糖（Sigma公司）。

1.2 主要实验仪器 722型分光光度计；电子分析天平；可调恒温水浴锅；精密pH计等。

1.3 酶活力测定1.3.1酶活测定方法。

采用还原糖法（DNS）测定。

1.3.2 酶活力单位定义。

在40℃、pH4.5的条件下，每分钟从甘露聚糖（Sigma G0753）溶液中降解释放1 μg还原糖所需要的酶量为一个酶活力单位U。

1.3.3甘露糖标准曲线的绘制。

配制10mg/mL的甘露糖溶液100mL，吸取上述溶液分别配制成浓度为0.10～0.70 mg/mL的甘露糖标准溶液。

饲用β-甘露聚糖酶的作用机理及其酶学性质研究
罗长财;冯国华
【期刊名称】《中国饲料添加剂》
【年(卷),期】2009(000)011
【摘要】β-甘露聚糖酶作为一种新型饲用酶制剂，本文对其作用机理进行了阐述，并对黑曲霉产的β-甘露聚糖酶的酶学性质进行了系列研究。

研究结果表明：该酶
在最适反应温度、稳定性能等方面表现优良，适于作为饲用添加剂．
【总页数】4页(P21-24)
【作者】罗长财;冯国华
【作者单位】广东省溢多利生物科技股份有限公司研发中心,珠海519060
【正文语种】中文
【中图分类】S816.7
【相关文献】
1.饲用脂肪酶的酶学性质研究 [J], 桂涛;李春梅;张瑷明;邓利君
2.产甘露聚糖酶细菌的分离鉴定、酶的部分纯化及酶学性质研究 [J], 吴华伟;蔚鑫鑫;陈雪秋
3.饲用耐酸抗蛋白酶β-甘露聚糖酶的筛选分离及酶学性质 [J], 张文会;孙同韦;张
会图;王海宽;王洪彬;路福平
4.高产β-甘露聚糖酶菌株的分离鉴定及酶学性质研究 [J], 陈晓飞;李珊珊;刁文涛;
徐紫瑜;刘德海
5.2种水产饲用蛋白酶的主要酶学性质研究 [J], 齐莉莉;王进波
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第19卷 第7期 牡丹江大学学报 Vol.19 No.7 2010年7月 Journal of Mudanjiang University Jul. 201092 文章编号：1008-8717（2010）07-0092-03黑曲霉生产糖化酶及酶活测定单 海 艳（牡丹江大学，黑龙江 牡丹江 157000）摘 要：本文对黑曲霉突变株Uv11－48生产糖化酶液体深层发酵进行了全程生产工艺的研究，证实了黑曲霉突变株是一种产孢力强、抗污染能力强、易培养的糖化酶生产菌，经液体深层通风发酵可得出：只要充分利用突变株的有利条件，掌握好菌种特性，合理配制营养，控制好发酵条件，便可获得高酶活力的高产糖化酶。

本实验还运用了几种酶活力测定方法，以资进行优劣探讨。

关键词：黑曲霉；液体通风发酵；糖化酶；酶活力 中图分类号：Q-331 文献标识码：B 一、前言（一）黑曲霉菌种特性 1．黑曲霉的分类地位黑曲霉在分类学上处于：真菌门、半知菌亚门、丝孢纲、丝孢目、丛梗孢科、曲霉属、黑曲霉群，拉丁学名：Aspergillus niger 。

2．黑曲霉形态、生理、生态特性孢子头呈暗黑色，菌丝体由具横隔的分枝菌丝构成，菌丝黑褐色，顶囊球形，小梗双层，分生孢子球形，平滑或粗糙。

一般进行无性生殖，其可育细胞称足细胞。

3．黑曲霉突变株的形态、生理、生态、特征 在查氏培养基上菌落曲型为炭黑色，有辐射沟纹，从菌落边缘向中心，分化为伸长部位，活性部位，成熟部位，老化部位几个区域即孢子萌发最早出现于中心部位是伸展部位，并逐渐形成密生部位，分生孢子部位，最后在中心出现的是成熟部位，菌落背面无色或稍黄。

（二）糖化酶的分类、地位、性质及用途 1．糖化酶在国际酶学委员会，在系统命名法中的地位糖化酶是淀粉酶，在系统命名法中属水解酶类。

2．糖化酶的性质糖化酶（glucamylase ）又名糖化型淀粉酶（glueoamylase ）或淀粉葡萄糖苷酶。

其系统名称为淀粉α1.4-葡萄聚糖水解酶。

木聚糖酶生产及酶学性质的研究一、本文概述木聚糖酶是一类能够水解木聚糖及其相关多糖的酶类，广泛存在于自然界中，尤其是在植物、微生物和动物体内。

由于其在生物质转化、食品加工、饲料工业以及医药等领域的重要应用价值，木聚糖酶的研究与生产日益受到关注。

本文旨在全面综述木聚糖酶的生产方法、纯化技术以及酶学性质的研究进展，以期为木聚糖酶的进一步研究和应用提供理论支持和实践指导。

本文将对木聚糖酶的生产方法进行详细阐述。

这包括从天然来源中提取木聚糖酶，以及通过微生物发酵、基因工程等生物技术手段生产木聚糖酶。

在此基础上，还将探讨不同生产方法的优缺点，以及影响木聚糖酶产量的关键因素。

本文将关注木聚糖酶的纯化技术。

纯化是获得高质量、高活性木聚糖酶的关键步骤，本文将介绍常见的纯化方法，如硫酸铵沉淀、离子交换层析、凝胶过滤层析等，并分析各方法的优缺点及适用范围。

本文将重点研究木聚糖酶的酶学性质。

这包括木聚糖酶的分子量、最适pH值、最适温度、动力学参数等基本性质，以及酶的稳定性、抑制剂和激活剂等影响因素。

通过对这些酶学性质的研究，可以更深入地了解木聚糖酶的作用机制和催化性能，为其在各个领域的应用提供理论依据。

本文旨在通过系统研究木聚糖酶的生产及酶学性质，为木聚糖酶的进一步研究和应用提供全面、深入的理论支持和实践指导。

二、木聚糖酶的生产方法木聚糖酶作为一种重要的工业酶，其生产方法主要包括微生物发酵法、化学合成法和基因工程法。

其中，微生物发酵法因其产量高、成本低、条件温和且易于工业化生产等优点，成为目前木聚糖酶生产的主要方法。

微生物发酵法生产木聚糖酶主要利用能够产生木聚糖酶的微生物，如真菌、细菌和放线菌等，通过优化培养基成分、发酵条件和菌种选育等手段，提高木聚糖酶的产量和活性。

目前，黑曲霉、米曲霉和里氏木霉等真菌是木聚糖酶的主要生产菌种。

在发酵过程中，碳源、氮源、无机盐和生长因子等营养成分对木聚糖酶的产量和活性具有重要影响。

常用的碳源包括木聚糖、葡萄糖、果糖等，氮源则包括蛋白胨、酵母粉、豆饼粉等。

一、实验目的1. 学习并掌握黑曲霉菌的分离与鉴定方法；2. 了解黑曲霉菌的形态特征和生长习性；3. 掌握微生物实验的基本操作技能。

二、实验原理黑曲霉菌（Aspergillus niger）是一种广泛分布于自然界中的真菌，具有较强的发酵能力和酶活性。

本实验通过分离纯化黑曲霉菌，对其进行形态特征观察和生长条件研究，以了解其生物学特性。

三、实验材料1. 实验试剂：改良马丁培养基、葡萄糖酵母膏琼脂培养基、无菌水、无菌棉塞、无菌吸管、无菌培养皿等；2. 实验仪器：恒温培养箱、显微镜、酒精灯、接种环等；3. 实验样品：土壤、谷物、植物性产品等。

四、实验方法1. 样品处理（1）取适量样品（如土壤、谷物等）置于无菌培养皿中，加入适量无菌水，用玻璃棒充分搅拌，制成悬浮液；（2）取适量悬浮液，用无菌吸管吸取一定量的样品，涂布于改良马丁培养基上；（3）将涂布好的培养基置于恒温培养箱中，37℃培养24小时。

2. 分离纯化（1）观察培养基上生长的菌落，选取典型的黑曲霉菌菌落；（2）用接种环挑取菌落，分别接种于葡萄糖酵母膏琼脂培养基上；（3）将接种好的培养基置于恒温培养箱中，37℃培养24小时，观察菌落特征。

3. 形态观察（1）用显微镜观察菌落形态特征，包括菌丝、分生孢子梗、分生孢子等；（2）记录菌落颜色、形状、大小、菌丝特征等。

4. 生长条件研究（1）将分离得到的黑曲霉菌接种于葡萄糖酵母膏琼脂培养基上；（2）在不同温度、pH值、营养物质条件下，观察菌落生长情况；（3）记录菌落生长情况，分析生长条件对黑曲霉菌的影响。

五、实验结果与分析1. 分离纯化结果经过涂布培养和分离纯化，成功分离出黑曲霉菌。

菌落呈黑色，表面光滑，边缘整齐，具有明显的放射状沟纹。

2. 形态观察结果显微镜下观察，黑曲霉菌菌丝呈白色，具有分隔，分生孢子梗自菌丝顶端生出，呈直角或锐角，分生孢子球形，褐色。

3. 生长条件研究结果（1）温度：黑曲霉菌在25-37℃范围内生长良好，最适温度为37℃；（2）pH值：黑曲霉菌在pH值4.0-7.0范围内生长良好，最适pH值为6.0；（3）营养物质：黑曲霉菌在葡萄糖酵母膏琼脂培养基上生长良好，适宜的营养物质为葡萄糖、酵母膏。

饲用β-甘露聚糖酶的研究进展谢志恒;崔细鹏;周平发;史宝军【摘要】β-mannanase is a kind of new green feed additive. It can eliminate the anti-nutrition role of mannan, enhance the digestion and absorption of nutrients in intestinal tract; mannan oligosaccharides can improve the microbial environment in intestinal tract, enhance animal immunity. The source, physical and chemical characteristics, biological structure, mode of action and application of theβ-mannanase were summarized in this paper.%β-甘露聚糖酶是一种新型绿色饲料添加剂，其可以消除β-甘露聚糖的抗营养作用，促进动物对营养物质的消化吸收；其产物甘露寡糖能改善肠道微生物环境，提高动物免疫功能。

文章从β-甘露聚糖酶的来源、理化性质、生物学结构、作用方式及应用等方面阐述饲用β-甘露聚糖酶的研究进展。

【期刊名称】《饲料博览》【年(卷),期】2012(000)012【总页数】4页(P29-32)【关键词】β-甘露聚糖酶;作用方式;应用【作者】谢志恒;崔细鹏;周平发;史宝军【作者单位】广东溢多利生物科技股份有限公司,广东珠海519060;广东溢多利生物科技股份有限公司,广东珠海519060;广东溢多利生物科技股份有限公司,广东珠海519060;广东溢多利生物科技股份有限公司,广东珠海519060【正文语种】中文【中图分类】S816.8;S814β-甘露聚糖酶是一类能够水解含有β-1,4-甘露糖苷键的甘露聚糖及其衍生物（半乳甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳葡萄甘露聚糖）的内切水解酶，属于半纤维素酶类，能消除甘露聚糖对单胃动物各种营养物质的抗营养作用，其分解产物甘露寡糖在动物肠道中也起着重要的调节作用[1]。

产黄青霉β-甘露聚糖酶的高效表达、性质及应用甄红敏1，华晓晗1，马俊文2，温永平1,3，李延啸2,*，闫巧娟2,*，江正强1（1.中国农业大学食品科学与营养工程学院，北京100083；2.中国农业大学工学院，北京100083；3.蒙牛高科乳制品（北京）有限责任公司，北京100101）摘 要：将产黄青霉（Penicillium chrysogenum）来源的β-甘露聚糖酶（Pc Man26A）在毕赤酵母中高效表达，经高密度发酵，发酵液酶活力达25 200 U/mL。

该酶属于GH26家族，与黑曲霉（Aspergillus niger）CBS 513.88来源的β-甘露聚糖酶同源性最高（67.8%），是一个新型β-甘露聚糖酶。

Pc Man26A的最适催化条件为pH 6.0和50 ℃，在pH 4.0～8.0和45 ℃下具有良好的稳定性。

该酶对魔芋粉具有最高的比活力，为3 581.0 U/mg。

进一步利用该酶水解魔芋粉得到魔芋甘露寡糖，产品得率为86.2%；经分析，其主要组分为聚合度大于4的甘露寡糖。

该β-甘露聚糖酶适用于生产魔芋甘露寡糖，为魔芋甘露寡糖的酶法生产提供了更多的选择。

关键词：产黄青霉；β-甘露聚糖酶；毕赤酵母；魔芋粉；甘露寡糖High-level Expression, Characterization, and Application of a Novel β-Mannanase from Penicillium chrysogenum ZHEN Hongmin1, HUA Xiaohan1, MA Junwen2, WEN Yongping1,3, LI Yanxiao2,*, YAN Qiaojuan2,*, JIANG Zhengqiang1(1. College of Food Science and Nutritional Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China;2. College of Engineering, China Agricultural University, Beijing 100083, China;3. Meng Niu Hi-Tech Dairy (Beijing) Co. Ltd., Beijing 100101, China)Abstract: A cloned β-mannanase (Pc Man26A) gene from Penicillium chrysogenum was successfully expressed in Penicillium chrysogenum. At the end of high cell density fermentation, the enzymatic activity of the fermentation supernatant reached 25 200 U/mL. The enzyme belonged to the glycoside hydrolase family 26 and shared the highest amino acid sequence identity (67.8%) with β-mannanase from Aspergillus niger CBS 513.88. The optimal reaction conditions for Pc Man26A were pH 6.0 and 50 ℃, and it was stable at 45 ℃ and within a broad pH range of 4.0–8.0. The enzyme showed the highest specific activity (3 581.0 U/mg) towards konjac powder. Furthermore, Pc Man26A was used for konjac powder hydrolysis, yielding konjac manno-oligosaccharide with a yield of 86.2%. The main composition of the konjac manno-oligosaccharide was manno-oligosaccharides with degree of polymerization > 4. The recombinant β-mannanase provides a new option for the enzymatic production of konjac manno-oligosaccharide.Keywords: Penicillium chrysogenum; β-mannanase; Pichia pastoris; konjac powder; manno-oligosaccharideDOI:10.7506/spkx1002-6630-20200819-248中图分类号：Q814 文献标志码：A 文章编号：1002-6630（2021）08-0098-08引文格式：甄红敏, 华晓晗, 马俊文, 等. 产黄青霉β-甘露聚糖酶的高效表达、性质及应用[J]. 食品科学, 2021, 42(8): 98-105.DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200819-248. ZHEN Hongmin, HUA Xiaohan, MA Junwen, et al. High-level expression, characterization, and application of a novel β-mannanase from Penicillium chrysogenum[J]. Food Science, 2021, 42(8): 98-105. (in Chinese with English abstract) DOI:10.7506/spkx1002-6630-20200819-248. 收稿日期：2020-08-19基金项目：国家自然科学基金青年科学基金项目（31901627）；中国博士后科学基金面上项目（2018M641539）第一作者简介：甄红敏（1986—）（ORCID: 0000-0003-2233-1639），女，博士后，研究方向为食品生物技术。

饲用耐酸抗蛋白酶β-甘露聚糖酶的筛选分离及酶学性质张文会;孙同韦;张会图;王海宽;王洪彬;路福平【摘要】β–甘露聚糖酶作为饲料添加剂，不仅可以有效降解并消除饲料中的抗营养因子，还可以进一步增强动物的免疫反应并调控动物胃肠道中的微生态平衡．然而目前已发现的大部分β–甘露聚糖酶的酸稳定性差，并且容易被动物肠道中的蛋白酶所降解，因此很难在实际应用中发挥理想的效果．本研究从一株高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus sublitis)中分离纯化到一种新型β–甘露聚糖酶，并对其酶学性质进行了研究；结果显示：该酶的最适作用温度为50,℃，最适催化pH为5.5，Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe3+对该酶有明显的激活作用．稳定性研究表明：采用pH 2.0的酸性缓冲液处理1,h 后，残余酶活仍能保持70%,以上；进一步采用20,U/mL 的猪胰蛋白酶处理2,h，残余酶活仍在60%,以上，表明该酶不仅具有较好的酸稳定性，还对来源于猪胰腺的蛋白酶具有一定的抗性．这些研究结果显示：该酶作为一种新发现的β–甘露聚糖酶，在饲料行业中具有较好的研究前景和应用价值．%β-mannanases,which can be used as feed additives could not only eliminate the antinutritional factors in feed,but also enhance animal immune response and balance the micro-ecology of animal gastrointestinal tract. However,most of the previous ly reported β-mannanases hardly show satisfactory efficacy in practical application dueto their poor acid stability and susceptibility to digestive proteases. In the present research,a novel β-mannanase was isolated from the fermentation broth of a Bacillus subtilis strain,which can simutaneously overproduce proteases. The purifiedβ-mannanase exhibited op-timal activity at50,℃and pH 5.5. It can also be activated by the metal ions ofZn2+,Co2+,Cu2+and Fe3+. In addition,theβ-mannanase showed high acid stability and resistance to trypsin digestion. After one hour incubation in the acid buffer(pH 2.0)and a succession of two-hour treatment with porcine pancreatic protease(20,U/mL),the remained activities of the β-mannanase still reached more than 70%, and 60%, of the highest activity. These superior properties make the newly isolatedβ-mannanase a good candidate for feed additive.【期刊名称】《天津科技大学学报》【年(卷),期】2015(000)006【总页数】5页(P7-11)【关键词】β-甘露聚糖酶;枯草芽孢杆菌;纯化;酶学性质【作者】张文会;孙同韦;张会图;王海宽;王洪彬;路福平【作者单位】工业发酵微生物教育部重点实验室，工业酶国家工程实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457;工业发酵微生物教育部重点实验室，工业酶国家工程实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457;工业发酵微生物教育部重点实验室，工业酶国家工程实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457;工业发酵微生物教育部重点实验室，工业酶国家工程实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457;工业发酵微生物教育部重点实验室，工业酶国家工程实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457;工业发酵微生物教育部重点实验室，工业酶国家工程实验室，天津市工业微生物重点实验室，天津科技大学生物工程学院，天津 300457【正文语种】中文【中图分类】Q814近年来，随着人们环保意识的增强以及绿色饲料的兴起，对β-甘露聚糖酶在饲料工业的应用已成为一个新的研究热点[1].甘露聚糖占饲料中非淀粉多糖的30%,，是目前大量应用的玉米/豆粕型饲料中主要的抗营养因子[2].它们能结合大量的水分，使采食动物消化道中食糜的体积增大、黏度增加、养分与消化道内源酶的作用降低、营养物质的消化率下降，造成动物生长受阻、饲料转化率降低，从而使其代谢受到抑制[3].在饲料中添加甘露聚糖酶能有效消除它们的抗营养作用，提高动物的生产性能[4].另外，添加β-甘露聚糖酶后，在动物体内能够产生甘露寡糖，可进一步刺激和增强动物的免疫反应，调控动物胃肠道微生态环境，促进有益菌生长，抑制有害菌黏附[5].目前已发现的β-甘露聚糖酶种类很多，其中不乏催化性能优良的高比活β-甘露聚糖酶[6-8].而真正应用于饲料添加剂的β-甘露聚糖酶则为数不多，并且很难发挥理想效果.究其原因，是由于大部分β-甘露聚糖酶的酸稳定性较差，难以耐受单胃动物消化道中的强酸环境以及消化道中由酸性至中性的变化过程；另外也有一些β-甘露聚糖酶由于受到消化液中蛋白酶的降解作用而迅速失活[9].因此，寻找具有耐酸、抗蛋白酶特性的新型β-甘露聚糖酶是解决这一问题的关键所在.本研究以寻找适合用于饲料添加剂的新型β-甘露聚糖酶为目标，从一株可大量分泌表达蛋白酶的枯草芽孢杆菌(Bacillus sublitis)TCCC11286 中筛选分离到一种具有耐酸抗蛋白酶特性的β-甘露聚糖酶.1 材料与方法1.1 菌种枯草芽孢杆菌(Bacillus sublitis)TCCC11286，本实验室保藏.1.2 主要试剂胰蛋白酶，上海伯奥公司；角豆胶、甘露糖，Sigma 公司；其他试剂均为国产分析纯.从国内3 个商家所购买的β-甘露聚糖酶酶粉分别标记为A、B、C.1.3 培养基β-甘露聚糖酶产生菌筛选培养基(g/L)：角豆胶5，蛋白胨2，酵母浸出物2，KH2PO41，MgSO4·7H2O 0.25，琼脂2.牛奶筛选培养基(g/L)：牛肉膏5，蛋白胨10，NaCl 5，脱脂奶粉30，琼脂20，pH 7.0～7.2.LB 培养基(g/L)：酵母浸出物5，胰蛋白胨10，NaCl 10.摇瓶发酵培养基(g/L)：魔芋粉10，酵母膏2，MgSO40.3，FeSO40.01，K2HPO42，NaCl 1，(NH4)2SO45，吐温80 1，pH 7.0～7.2.1.4 蛋白酶及β-甘露聚糖酶产生菌的筛选蛋白酶产生菌的筛选：通过LB 固体培养基三区划线将来自实验室的枯草芽孢杆菌菌株在37,℃培养24,h，进行纯化和活化.将平板上长出的单菌落依次点接到牛奶筛选培养基上，37,℃培养24,h，产生蛋白酶的菌落周围将会出现透明圈，保存透明圈较大的菌株.β-甘露聚糖酶产生菌的筛选：将初筛得到的蛋白酶产生菌株依次点接到牛奶筛选培养基上、β-甘露聚糖酶产生菌筛选培养基上，37,℃培养24,h，将0.1%,刚果红溶液倾倒于长出菌落的筛选平板上，10～15,min 后倒去刚果红溶液，用l mol/L 的NaCl 溶液反复冲洗2～3 次；然后加入l mol/L NaCl 溶液静置15,min 后倒掉，此时，产生β-甘露聚糖酶的菌落周围将会出现透明圈，保存透明圈较大的菌落.1.5 β-甘露聚糖酶酶活的测定β-甘露聚糖酶能将甘露聚糖降解成寡糖和单糖.具有还原性末端的寡糖和有还原基团的单糖在沸水浴条件下可以与DNS 试剂发生显色反应.反应液颜色的强度与酶解产生的还原糖量成正比，而还原糖的生成量又与反应液中β-甘露聚糖酶的活力成正比.因此，通过分光比色测定反应液颜色的强度，可以计算反应液中β-甘露聚糖酶的活力.酶活单位定义：在pH 5.5、50,℃条件下，每分钟内底物降解释放1,µmol D-甘露糖所需要的酶量为1个酶活单位U.酶活测定：取 0.5,mL 适当稀释的酶液加入1.5,mL 0.5%,角豆胶溶液，50,℃保温20,min，加入2,mL DNS，沸水浴10,min，冷却至室温后用去离子水定容至15,mL；空白对照：0.5,mL 适当稀释的酶液加入2,mL DNS，50,℃保温20,min，加入1.5,mL 角豆胶溶液，沸水浴10,min，冷却至室温后用去离子水定容至15,mL.在波长550,nm 的条件下测定吸光度.1.6 β-甘露聚糖酶的纯化1.6.1 粗酶液的制备将枯草芽孢杆菌TCCC11286 接种于发酵培养基的摇瓶中，37,℃、170,r/min 培养48,h.将发酵液在4,℃、12,000,r/min 离心10,min，收集上清液，即为粗酶液.1.6.2 硫酸铵盐析采用分步盐析法.粗酶液中添加(NH4)2SO4至50%,饱和度，4,℃静置过夜，4,℃、8,000,r/min 离心20,min，弃沉淀；上清液继续添加(NH4)2SO4至80%,饱和度，4,℃静置过夜，离心，沉淀备用.1.6.3 阴离子交换层析将沉淀用pH 5.5 的乙酸-乙酸钠缓冲液溶解，透析袋透析脱盐，上样至已用乙酸-乙酸钠缓冲液平衡过的Hitrap Q HP 阴离子柱(5,cm×5,cm)上，阶段洗脱.用含有1,mol/L NaCl 的磷酸缓冲液以0～100%,的梯度进行洗脱，流量为0.5,mL/min，收集洗脱峰，测定各管的β-甘露聚糖酶活性.合并较高酶活性的收集液，透析，并利用超滤管进行浓缩.1.6.4 凝胶过滤层析将离子交换层析后的β-甘露聚糖酶的活性组分收集浓缩，然后上样至预先用乙酸-乙酸钠缓冲液平衡好的分子筛(Superdex 200 10/300,GL)上，用相同的缓冲液进行洗脱，流量为0.5,mL/min，收集浓缩含有β-甘露聚糖酶活性组分.对各步纯化组分进行聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)检测.1.7 β-甘露聚糖酶酶学性质的测定1.7.1 最适反应温度及温度稳定性采用pH 5.5 的乙酸-乙酸钠缓冲液配制β-甘露聚糖酶活性测定反应体系，将反应体系分别置于30～75,℃的温度下进行酶促反应，测定其酶活力.酶活力最高的温度为最适反应温度，其酶活力设为100%,，计算其他温度下的相对酶活力.将酶液分别置于30～75,℃处理60,min 后，测定酶活力，以0,℃下处理的β-甘露聚糖酶酶活力定为100%,，计算各温度处理后的相对酶活力，分析其温度的稳定性.1.7.2 最适反应pH 及pH 稳定性采用pH 2～12 的0.2,mol/L 的缓冲液(pH 2.0～8.0,Na2HPO4-柠檬酸，pH 9～10 甘氨酸-NaOH，pH 11.0～12.0,Na2HPO4-NaOH)配制β-甘露聚糖酶的催化反应体系，将反应体系于50,℃反应15,min 后测定酶活力，酶活力最高的pH 为最适pH，其酶活力设为100%,，计算其他pH 条件下的相对酶活力.采用pH 2～12 的不同的缓冲液处理酶液1,h 后，测定酶活力，以酶活力最大的pH 下的酶活力设为100%,，计算各pH 处理下的相对酶活力，分析其pH 的稳定性.1.7.3 不同金属离子与化学试剂对β-甘露聚糖酶稳定性的影响分别用1,mmol/L 和5,mmol/L 的金属离子溶液及其他化学试剂溶解酶解底物，测定酶活力，以未添加任何金属离子和化学试剂的底物下测得的酶活力为100%,，计算加入金属离子和其他化学试剂下的相对酶活力，研究金属离子和其他化学试剂对该酶活力的影响.1.8 β-甘露聚糖酶的耐酸抗蛋白酶测试将纯化后的β-甘露聚糖酶与市面上的商业酶(编号A、B、C)进行耐酸抗蛋白酶比较实验.1,mL 酶液加入到9,mL 50,mmol/L pH 2.0 的甘氨酸-盐酸缓冲液中，37,℃、120,r/min 孵育1,h，测定酶活力，以未处理过的酶活力定为100%,，计算各酶液处理后的相对酶活力，分析其稳定性.各取上述孵育液1,mL，加入到含有0.1%,胰蛋白酶的9,mL 20,mmol/L pH 5.5 乙酸-乙酸钠缓冲液中，37,℃继续孵育2,h，测定酶活力.以未经胰蛋白酶处理过的上述孵育液酶活力定为100%,，计算其处理后的相对酶活力，分析其稳定性.2 结果与分析2.1 蛋白酶和β-甘露聚糖酶产生菌的筛选蛋白酶产生菌的筛选结果如图1(a)所示，产蛋白酶的菌落周围会形成透明圈.β-甘露聚糖酶产生菌的筛选结果如图1(b)所示，产β-甘露聚糖酶的菌落周围会形成透明圈.图1 产β-甘露聚糖酶和蛋白酶菌株的筛选Fig.1 Isolation of strains producing the new β-mannanase and protease2.2 β-甘露聚糖酶的纯化将枯草芽孢杆菌 TCCC11286 摇瓶发酵，收集粗酶液，利用80%,的硫酸铵盐析离心后上清液中的β-甘露聚糖酶酶活力最低，透析液在过阴离子交换柱时出现3 个峰，并且只有第2 个峰收集液测到β-甘露聚糖酶的酶活力，将收集液经过凝胶过滤层析纯化后，比酶活由560,U/mg 提高到8,232.6,U/mg，纯化倍数达到14.7 倍，回收率为47%,.SDS-PAGE 结果如图2 所示.由图2 可以看出，纯化后的β-甘露聚糖酶是相对分子质量为3.7×104 的单一条带.2.3 β-甘露聚糖酶酶学性质分析将β-甘露聚糖酶纯酶液分别在不同pH 的缓冲体系中测定其酶活力，以pH 为横坐标，相对酶活力为纵坐标绘制曲线，结果如图3 所示，β-甘露聚糖酶的最适pH 为5.5，且在pH 2.0～10.0 范围内，酶活力保持在60%,以上.因此β-甘露聚糖酶在pH 2.0～10.0 之间比较稳定，有比较宽的pH 稳定范围，有很好的耐酸特性.该酶比已报道的酶更具有酸、碱稳定性[10]，这一特点更有利于该酶在饲料添加剂中的使用.图2 各个纯化步骤样品的聚丙烯酰胺凝胶电泳Fig.2 SDS-PAGE of the mannanase sample in each purification procedureM.蛋白质Marker；1.透析液；2.离子交换层析液；3.凝胶过滤层析液图3 β-甘露聚糖酶的最适pH及pH稳定性Fig.3 The optimal pH and pH stability of the new βmannanase在不同的温度(30～70,℃)下测定β-甘露聚糖酶纯酶液的酶活力，并计算相对酶活力.以温度为横坐标，相对酶活力为纵坐标绘制曲线，结果如图4 所示.结果表明：β-甘露聚糖酶的最适反应温度为50,℃，且在30～60,℃范围内，酶活力保持在60%,以上，在60,℃以上β-甘露聚糖酶的酶活力降到40%,以下.该酶的最适温度与大部分的来源于枯草芽孢杆菌的β-甘露聚糖酶相似，而B.,subtilis 168 的最适反应温度却是37,℃[11].β-甘露聚糖酶的温度稳定性有利于饲料添加剂的保存与运输.图4 β-甘露聚糖酶的最适温度及温度稳定性Fig.4 The optimum temperature and thermal stability of the new β-mannanase不同浓度的化学试剂及金属离子对β-甘露聚糖酶活性的影响结果如图5 所示.对于不同金属离子和化学试剂对β-甘露聚糖酶活性的影响结果表明：金属离子Hg2+和Ag+、表面活性剂SDS、吐温20、聚乙二醇辛基苯基醚(Triton X-100)对该β-甘露聚糖酶有不同程度上的抑制作用，Na+、Ni2+、K+、Ca2+、Mg2+、Ba2+、Pb2+、乙二胺四乙酸(EDTA)对该酶的酶活力基本没有影响，Mn2+、Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe3+对该酶有明显的激活作用.作为饲料添加剂，这一特性有利于抵抗胰蛋白酶和胃蛋白酶[12-14].图5 不同浓度的化学试剂及金属离子对β-甘露聚糖酶活性的影响Fig.5 Effects of metal ions and chemical reagents on th e activity of the new β-mannanase 2.4 β-甘露聚糖酶的耐酸抗蛋白酶测试用分离纯化到的β-甘露聚糖酶进行耐酸抗蛋白酶的测试，并与国内所售的3 种β-甘露聚糖酶进行比较，结果如图6 所示.枯草芽孢杆菌TCCC11286产的β-甘露聚糖酶耐酸相对酶活力在70%,以上，抗蛋白酶相对酶活力在60%,以上，均高于其他3 种β-甘露聚糖酶.因此，枯草芽孢杆菌TCCC11286 合成的β-甘露聚糖酶的耐酸抗蛋白酶活性较优，该酶在饲料添加剂的应用中具有很大的潜能.图6 β-甘露聚糖酶的耐酸和抗蛋白酶实验结果Fig.6 Acid and protease resistance experiment of the new β-mannanases3 结论本研究从一株高产蛋白酶的枯草芽孢杆菌中分离纯化到一种新型β-甘露聚糖酶，其最适反应温度为55,℃，最适pH 为5.5，在pH 2～10 的范围内稳定性较好，Zn2+、Co2+、Cu2+、Fe3+对该酶有明显的激活作用，此外，其具有良好的耐酸抗蛋白酶的特性，因此Bacillus subtilis TCCC11286 所合成的β-甘露聚糖酶是非常有价值的饲料添加剂原料，可进行深入研究，以实现β-甘露聚糖酶的工业化应用.虽然该酶的酶活力距离应用的要求还有一定的差距，但可以通过优化发酵条件或者诱变育种和结合分子手段构建高效表达的工程菌提高产量，以达到实际应用的目的.参考文献：［1］龙健儿，陈一平.β-甘露聚糖酶的研究现状[J].微生物学杂志，1998，18(3)：44-49.［2］Cai Hongying，Shi Pengjun，Luo Huiyang，et al.Acidic β-mannanase from Penicillium pinophilum C1：Cloning，characterization and assessment of its potential for animal feed application[J].Journal of Bioscience and 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β-甘露聚糖酶研究进展时间:2010-09-16 11:53来源: 作者: 点击: 次甘露聚糖是由β-1，4-D-吡喃甘露糖连接而成的线状多聚体，是半纤维素的第二大组分，广泛存在于自然界中，它是多种植物细胞壁的主要组成成分。

甘露聚糖在许多植物性饲料原料中含量很高，如豆粕中半乳甘露聚糖占非淀粉多糖含量的22.7%、小麦为11.9%、菜籽粕为19.6%、麸皮为33.7。

研究表明，甘露聚糖影响动物对营养物质的利用，是一种抗营养因子。

β-甘露聚糖酶是水解以β-1，4-D-吡喃甘露糖为主链的甘露寡糖、甘露多糖(甘露聚糖、葡萄甘露聚糖、半乳甘露聚糖)的内切水解酶，在饲料工业中作为一种绿色饲料添加剂，用于消除β-甘露聚糖的抗营养作用。

本文从β-甘露聚糖酶的来源、提纯方法、酶学性质、作用机理及应用等方面，对β-甘露聚糖酶做一简要介绍。

1 β-甘露聚糖酶的来源β-甘露聚糖酶在自然界中广泛存在，在动物(如海洋软体动物)、发芽植物的种子中(如长角豆、瓜豆、芦笋、番茄、胡萝卜等)和微生物中均有所发现，其中微生物是β-甘露聚糖酶的主要来源。

细菌、真菌和放线菌中均有多种是产β-甘露聚糖酶的常见类群，如细菌中的芽孢杆菌、假单胞菌、弧菌，真菌中的曲霉、木霉、酵母、青霉、多孔菌、核盘菌，放线菌中的链霉菌等。

对于合成β-甘露聚糖酶的微生物研究较多的是枯草芽孢杆菌、曲霉菌、里氏木霉菌及链霉菌等。

目前，应用于工业生产β-甘露聚糖酶的菌种也多为芽孢杆菌、曲霉、酵母等。

微生物来源的β-甘露聚糖酶具有许多优点，如酶活性高、生产成本低、提取方便，具有pH、温度作用范围广以及底物专一性较高等特点。

不论在工业生产还是理论研究中，微生物来源的β-甘露聚糖酶均已得到了广泛应用。

2 β-甘露聚糖酶的分离纯化及酶学性质2.1 分离纯化目前关于动、植物以及微生物中甘露聚糖酶的研究大多集中在对酶的分离、纯化、理化性质、对其降解产物的鉴定以及对应编码基因的克隆表达上。

生物工程下游技术实验（整理版）生物工程下游技术实验实验一酵母RNA的提取及含量测定（紫外吸收法）实验二黑曲霉β-D甘露聚糖酶的纯化盐析实验三盐析β-D甘露聚糖酶活力测定实验四柠檬酸摇瓶发酵及结晶提取实验一酵母RNA的提取及含量测定一、实验目的与要求1、了解并掌握稀碱法提取RNA的原理和方法。

2、熟悉和掌握紫外吸收法测定核酸含量原理和操作方法，3、熟悉紫外分光光度计的基本原理和使用方法。

二、实验原理由于RNA的来源和种类很多，因而提取制备方法也很各异。

一般有苯酚法、去污剂法和盐酸胍法。

其中苯酚法又是实验是最常用的。

组织匀浆用苯酚处理并离心后，RNA即溶于上层被酚饱和的水相中，DNA和蛋白质则留在酚层中。

向水层加入乙醇后，RNA即以白色絮状沉淀析出，此法能较好的除去DNA和蛋白质。

上述方法提取的RNA 具有生物活性。

工业上常用稀碱法和浓盐法提取RNA，用这两种方法所提取的核酸均为变性的RNA，主要用作制备核苷酸的原料，其工艺比较简单。

浓盐法使用10%左右氯化钠溶液，90℃提取3-4h，迅速冷却，提取液经离心后, 上清液用乙醇沉淀RNA。

稀碱法使用稀碱使酵母细胞裂解，然后用酸中和，除去蛋白质和菌体后的上清液用乙醇沉淀RNA或调pH2.5利用等电点沉淀。

酵母含RNA达2.67-10.0%，而DNA含量仅为0.03-0.516%，为此，提取RNA多以酵母为原料。

核酸、核苷酸及其衍生物的分子结构中的嘌呤、嘧啶碱基具有共轭双健系统（-C=C一C=C-），能够强烈吸收250-280nm 波长的紫外光。

核酸（DNA,RNA）的最大紫外吸收值在260nm 处。

遵照Lambert-Beer 定律，可以从紫外光吸收值的变化来测定核酸物质的含量。

在不同pH 溶液中嘌呤、嘧啶碱基互变异构的情况不同，紫外吸收光也随之表现出明显的差异，它们的摩尔消光系数也随之不同。

所以，在测定核酸物质时均应在固定的pH溶液中进行。

核酸的摩尔消光系数（或吸收系数），通常以ε（ρ）来表示，即每升含有一摩尔核酸磷的溶液在260nm 波长处的消光值（即光密度，或称为光吸收）。