色谱分析法3

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高效液相色谱法3

2.内标法内标法分为工作曲线法内标一点法内标二点法内标对比法校正因子法在HPLC中最常用内标对比法。选择内标物的三个条件(纯、样品中不含有、保留时间接近)，在HPLC中的要求与GC完全一致。一般可选择一个化学结构与待测物质相似、物理性质相近的纯物质作为内标物，加到待测样品溶液中，经过样品前处理后进样。使用内标法可抵消因仪器稳定性差、进样量不够准确等原因带来的实验误差。
(一) 多环芳烃的分析一多环芳烃的分析(图21－18) 多环芳烃的分析，可用反相或吸附色谱法分析。反相色谱法用ODS柱，用乙腈−水或甲醇−水为流动相。但用甲醇−水时，保留时间较长，因此多采用梯度洗脱。多环芳烃也可用硅胶(YWG等)柱，以不含水的正己烷为流动相，也能获得较好的分离效果，但需注意溶解样品的溶剂应与流动相的性质相近。许多多环芳烃是致癌物质，其含量监测在食品分析与环境保护监测中都有实用意义。
(1)内标对比法：这种方法不需知校正因子又具有内标法的定量准确度与进样量无关的特点，方法简便实用。在药物分析中分析结果(含量)常用标示量％表示:
( Ai / As )样品 (ms )样品 W 标示量% = × × ×100% ( Ai / As )对照 (ms )对照 m
(21.13)
式中(ms)样品与(ms)对照分别是内标物在试样溶液及对照溶液中的量，W为平均片重(或丸重等)，m是取样量，其它符号的含义同GC章。若试样溶液与对照溶液中加人内标物的量相等，所称取的样品重与平均片重相同，则上式的后二项均等于1。
A的标示量％=(178024／202694)÷(154856／171222)×100％=97.l％ P的标示量％=(820968／202694) ÷(692272／171222)×100％=100.l％ C的标示量％=(407792／202694) ÷(372221／171222)×100％=92.5％

色谱分析法

29
9.分配系数K与分配比k的关系
ms cs Vs Vm K k k cm m m Vs Vm
其中β称为相比率。相比率是反映色谱柱柱型特点的又一个参数。例如，对填充柱，其β值一般为6~35，对毛细管柱，其β值一般为60~600。
11:19
30
10. 分配比与保留时间的关系
11:19
37
• 但由于死时间tM包含在tR中，而tM并不参加柱内的分配，所以理论塔板数、理论塔板高并不能真实地反映色谱柱的好坏。为此： • 常用有效塔板数或有效塔板高度作衡量柱效能的指标。计算式如下：
' ' tR t 2 R 2 n有效 5.54( ) 16( ) Y1 Y 2
H有效
第六章
色谱分析法
11:19
1
第一节概述
一、色谱法简介 u 色谱法是由1906年俄国植物学家茨维特最早创立的。
11:19
2
石油醚
植物叶石油醚溶液
CaCO3
11:19
3
色谱法中: 起分离作用的分离柱称为色谱柱。固定在柱内的填充物称固定相。携带试样混合物流过此固定相的流体（气体或液体），称为流动相。
L n H
n称为理论塔板数。
11:19
35
(2)
以气相色谱为例，载气进入色谱柱不是连续
进行的，而是脉动式，每次进气为一个塔板体积。
(3) 所有组分开始时存在于第0号塔板上，而且试
样沿轴（纵）向扩散可忽略。
(4) 分配系数在所有塔板上是常数，与组分在某
一塔板上的量无关。
11:19
36
塔板理论指出：
i．保留时间tR：指被测组分从进样开始到出现色谱峰最高点时所需的时间，如图15－6中的O΄B 所示。

色谱法定量分析方法及原理

色谱法定量分析方法及原理定量分析就是要确定样品中某一组分的准确含量。

色谱定量分析与绝大部分的仪器定量分析一样，是一种相对定量方法，而不是绝对定量方法。

它是根据仪器检测器的响应值与被测组分的量，在某些条件限定下成正比的关系来进行定量分析的。

也就是说，在色谱分析中，在某些条件限定下，色谱峰的峰高或峰面积（检测器的响应值）与所测组分的数量（或浓度）成正比。

一、原理色谱法定量分析的根据是组分i通过检测器时产生的信号大小，即组分i的峰面积A（或组分i的峰高h i）与进入检测器的组分i的质量mi成正比A x m 或h i x mi，由此得到：A=Sm; h i=S（h）m 或者m=A/S i=Af i ; m=h/S i（h）=hf 心）式中A i -------- 组分i的峰面积，mm；m i -------- 组分i进入检测器的量，g或mol数；h i -------------- 组分i的峰高，mmS i——组分i的绝对响应值；f i -------------- 组分i的绝对校正因子；S i（h）——组分i的峰高绝对响应值；f i（h）-----组分i的峰高绝对校正因子。

二、色谱定量分析的方法1、归一化法定量分析。

归一化法定量是色谱分析法中常用而且简单准确的方法。

归一化法只适用于样品中所有组分都能从色谱柱流出并被检测器检出，且都在线性范围内，同时又能测定或查出所有组分相对校正因子的样品。

各组分含量的计算公式为：f i A iX i 100%Z f i A i式中，X，f i，A分别为试样中被测组分的百分含量、相对质量校对因子和色谱峰面积，这个式子也称为面积校正归一化法。

归一化法定量的特点是比较简单、方便，其结果与进样量无关，仪器的操作条件稍有变动对结果影响不大。

当所有组分的校正因子都相同时，上式可简化为：A iX i 100%、A i此式又称为面积归一化法，在FID上，各种烃类的f i都很相近，在计算时采用此式给定量分析带来了极大的方便。

气相色谱的定性分析方法

fm'

Ms Mi
(3)、相对响应值
相对响应值是物质 i 与标准物质 S 的响应值(灵敏度)
之比，单位相同时，与校正因子互为倒数，即
Si
1 fi
和只与试样、标准物质以及检测器类型有关，而与操
作条件和柱温、载气流速、固定液性质等无关，不受
操作条件的影响，因而具有一定的通用性，是一个能
二、气相色谱的定量分析方法
定量分析就是要确定样品中组分的准确含量。气相色谱的定量分析与大多数的仪器分析方法一样，是一种相对定量方法，而不是绝对定量方法。
气相色谱定量分析的依据是：在一定的条件下，被
测谱本组峰公分的式峰为i 通面：过积检A测i 成器正的比数。量因(或此浓气度相)色w谱i定与量该分组析分的色基 W i = fi Ai 析再必用式须适中测当的量的f 其定i称峰量为面计组积算分方A的法i校和，正确将因定色子组谱。分峰由的面式校积可正换知因算，子为定f试量i ，样分
的组分的量 mi ，另一方面要准确测量出峰面积或峰高，
并要求严格控制色谱操作条件，这在实际工作中有一定困难。因此，实际测量中通常不采用绝对校正因子，而采用相对校正因子。
(2)、相对校正因子
相对校正因子是指组分 i 与另一标准物 S 的绝
对校正因子之比，用表示：
fi'
fi fs
mi / Ai ms / As
中组分的含量。
1、峰面积的测量
在使用积分仪和色谱工作站测量蜂高和峰面积时，仪器可根据人为设定积分参数(半峰宽、峰高和最小峰面积等)和基线来计算每个色谱峰的峰高和峰面积。然后直接打印出峰高和峰面积的结果，以供定量计算使用。
当使用一般的记录仪记录色谱峰时，则需要用手工测量的方法对色谱峰和峰面积进行测量。虽然目前已很少采用手工测量法去测量色谱峰的峰高和峰面积。但是了解手工测量色谱峰峰高和峰面积的方法对理解积分仪和色谱工作站的工作原理及各种积分参数的设定是大有裨益的。所以，以下简单介绍两种常用的手工测量法。

色谱的定量分析

色谱的定量分析1.色谱分析有几种定量方法色谱分析常用的定量方法：归一化法、内标法和内加（增量）内标法、外标法。

1、面积归一化法优点是简便、准确，当操作条件变化时对结果影响较小，宜于分析多组分试样中各组分的含量。

但是试样中所有组分必须全部出峰，因此，此法在使用中受到一定限制。

2、外标法是用纯物质配成一系列不同浓度的标准溶液（或直接购买不同浓度标准溶液）分别取一定体积，注入色谱仪，根据峰面积和浓度做标准曲线。

在分析未知样时按与标准曲线相同的操作条件和方法，由标准曲线查出所需组分的浓度（现在在工作站上直接就能求出浓度）。

此法要求进样准确，操作条件稳定，分析样品和标准曲线条件必须一致。

3、内标法是试样中所有组分不能全部出峰或只要求测定试样中某个或某几个组分时，可采用此法。

内标法是在准确称取一定量的试样中，加入一定的标准物质（内标物），根据内标物和试样的质量以及色谱图上的相应峰面积，计算待测组分的含量。

内标法的关键是选择合适的内标物，内标物应是试样中不存在的纯物质，物质与被测物质相近，能溶于样品中，但不能于样品发生反应。

此法比较费事，一般不使用于快速分析。

2.常用的层析分析方法有哪些在分离分析特别是蛋白质分离分析中，层析是相当重要、且相当常见的一种技术，其原理较为复杂，对人员的要求相对较高，这里只能做一个相对简单的介绍。

一、吸附层析1、吸附柱层析吸附柱层析是以固体吸附剂为固定相，以有机溶剂或缓冲液为流动相构成柱的一种层析方法。

2、薄层层析薄层层析是以涂布于玻板或涤纶片等载体上的基质为固定相，以液体为流动相的一种层析方法。

这种层析方法是把吸附剂等物质涂布于载体上形成薄层，然后按纸层析操作进行展层。

3、聚酰胺薄膜层析聚酰胺对极性物质的吸附作用是由于它能和被分离物之间形成氢键。

这种氢键的强弱就决定了被分离物与聚酰胺薄膜之间吸附能力的大小。

层析时，展层剂与被分离物在聚酰胺膜表面竞争形成氢键。

因此选择适当的展层剂使分离在聚酰胺膜表面发生吸附、解吸附、再吸附、再解吸附的连续过程，就能导致分离物质达到分离目的。

色谱分析方法(三)

离子色谱的组成
IC 仪器由流动相传送部分、分离柱、检测器和数据处理4个部分组成。 1 、流动相传送部分 IC 的流动相通过的管道、阀门、泵、柱子及接头等不仅要求耐高压, 而且还要求耐酸碱腐蚀。 2 、分离柱：分离柱是离子色谱的关键部件之一, 是惰性材料, 一般均在室温下使用。抑制器是抑制型电导检测器的关键部位, 能自动连续工作, 不用复杂和有害的化学试剂是现代抑制器的主要特点。
分离模式
1. 离子交换离子交换是用于分离阴离子和阳离子常见的典型分离方式。在色谱分离过程，样品中的离子与流动相中对应离子进行交换，在一个短的时间，样品离子会附着在固定相中的固定电荷上。由于样品离子对固定相亲和力的不同，使得样品中多种组分的分离成为可能。
离子交换色谱（ion exchange chromatography)的固定相是离子交换剂。根据分离离子的不同而采用阳离子交换剂或阴离子交换剂。其机理是离子交换剂基团与组分离子的交换，可用离子交换平衡式来表示:
高纯水中的离子型杂质电镀槽中的抗坏血酸
土壤中离子尿中草酸化妆品液体中的阴离子
制药
电力食品 / 饮料造纸. /纸浆
化学 / 液体
冷却水 / HPW 酒 / 饮料/ 糖果纸浆液・处理水
化学品中的重金属
锅炉蒸汽中的杂质饮料中有机酸纸张和液体中的离子
离子色谱的基本流程图
淋洗液
色谱柱
检测池
• 常用的填料有分子筛、葡聚糖凝胶、微孔聚合物、微孔硅胶或玻璃珠等，可根据载体和试样的性质，选用水或有机溶剂为流动相。
凝胶色谱特点： 1、保留时间是分子尺寸的函数，因此有可能提供分子结构的某些信息 2、保留时间短，谱峰窄，容易检测，可用灵敏度低的检测器 3、固定相与分子间的作用力极弱，趋于零，即柱不能很强地保留分子，因此寿命长。凝胶颗粒微孔直径不同的固定相，其线性范围不同，可以用于分离不同分子量范围的组分。凝胶色谱在生物样品（蛋白质、酶、核酸等）与高分子化学分析中有重要的应用价值。

(第三章)药物分析-色谱分析法

纸色谱
1）紫外光：对未知化合物，展开后在用显色剂以前，应先在紫外灯下进行察看。紫外光常用两种波长254 nm与365 nm。
2）碘：碘是一种非破坏性显色剂，价廉易得，显色迅速、灵敏。与物质的反应往往是可逆的。
3）水：为非破坏性显色剂，用于硅胶薄层，纸色谱不常用。
纸色谱
④ 测量Rf值与鉴定：
必须注意：展开剂也须事先用缓冲液平衡后再使用。
斑点拖尾现象形成的几种原因：
① 点样量过多，超过了滤纸溶剂的溶解能力。
② 物质电离，导致Rf值差异。
③ 被分离的物质与滤纸上的Cu2+、Ca2+、Mg2+等杂质形成络合物而形成拖尾，可改用纯滤纸展开。 ④ 某些物质在展开过程中分解，产物有不同的Rf值。
样点朝上，展开剂从上向下通过薄层或滤纸。展开剂通过滤纸条或纱布条作为桥梁进行转移。展开剂受吸附和重力的双重作用，展开较快。
特殊装置
纸色谱的下行展开法
3. 双向展开
用于某些复杂成分或Rf值较小的成分的展开
B
d
C
c
b
a
d
c
b
a
A
混合样品
CB
A
**边缘效应：消除边缘效应的方法： 1. 将展开槽、纸或薄层板用展开剂蒸气饱和； 2. 在层析缸内壁贴上用展开剂浸湿的滤纸条； 3. 点样位置距离边缘一定距离。
（1）氧化铝：有碱性、中性和酸性三类，粒度规格大多为100～150目。碱性氧化铝（pH9~10）：适用于碱性物质（如胺、生物碱）和对酸敏感的样品（如缩醛、糖苷等），也适用于烃类、甾体化合物等中性物质的分离。酸性氧化铝（pH3.5~4.5）：适用于酸性物质如有机酸、氨基酸等以及色素和醛类化合物的分离。中性氧化铝（pH7~7.5）：适用于醛、酮、醌、苷和硝基化合物以及在碱性介质中不稳定的物质如酯、内酯等的分离，也用来分离弱的有机酸和碱等。

色谱分析方法

色谱分析方法
色谱分析是一种用于分离、鉴定和定量化化合物的方法，它是化学分析中非常重要的一部分。

色谱分析方法主要包括气相色谱（GC）和液相色谱（HPLC）两大类，它们在不同的应用领域具有广泛的用途。

气相色谱是一种基于气相流动的分离技术，它适用于挥发性化合物的分析。

在气相色谱中，样品首先被蒸发成气态，然后通过色谱柱进行分离，最后由检测器进行检测和定量。

气相色谱具有分离效率高、分析速度快、灵敏度高等优点，因此在环境监测、食品安全、药物分析等领域得到了广泛应用。

液相色谱是一种基于液相流动的分离技术，它适用于非挥发性化合物的分析。

在液相色谱中，样品首先被溶解在流动相中，然后通过色谱柱进行分离，最后由检测器进行检测和定量。

液相色谱具有分离效果好、适用范围广、操作简便等优点，因此在生物医药、化工生产、食品加工等领域得到了广泛应用。

除了气相色谱和液相色谱外，还有许多其他类型的色谱分析方法，如超临界流体色谱、离子色谱、毛细管电泳等。

这些方法在不
同的应用领域具有独特的优势，可以满足不同化合物分析的需求。

色谱分析方法的选择取决于样品的性质、分析的目的、分离的
要求等因素。

在实际应用中，需要根据具体情况选择合适的色谱分
析方法，并结合适当的检测技术进行分析。

同时，还需要对色谱分
析方法进行优化，以提高分离效率、减少分析时间、提高灵敏度等。

总之，色谱分析方法作为一种重要的化学分析手段，在现代化
学分析中具有不可替代的地位。

通过不断地研究和改进，相信色谱
分析方法将在更广泛的领域发挥更重要的作用。

色谱定量分析方法(校正归一化法)—标准曲线法

二、定量分析方法
2.内标法
内标法的优点是：进样量的变化、色谱条件的微小变化对内标法定量结果的影响不大，特别是在样品前处理（如浓缩、萃取、衍生化等）前加入内标物，然后在进行前处理时，可部分补偿欲测组分在样品前处理时的损失。若要获得很高的精密结果时，可以加入数种内标物，以提高定量分析的精度。
作业
1. 色谱定量分析的基本公式是什么？ 2. 什么是标准曲线法？ 3. 标准曲线法有何优缺点？ 4. 什么是内标法？ 5. 内标法对内标物有哪些要求？
二、定量分析方法
1.标准曲线法
优绘制好标准曲线后测定工作就变得相当简单，可直接从标准工作上读出含量，因为特别适合大点量样品的分析。
每次样品分析的色谱条件（检测器的影响性能，柱温，流动相流速及组成，进样量，柱效等）很
缺点
难完全相同，因此容易出现较大误差。此外，标准曲线绘制时，一般使用欲测组分的标准样品
《色谱分析及操作》
色谱定量分析方法（标准曲线法、内标法)
01
定量分析
一、概述
定量分析就是要确定样品中某一组分的含量。色谱定量分析与绝大部分是仪器定量分析一样，是一种相对定量分析，而不是绝对定量分析。色谱分析是根据仪器检测的响应值与被测组分的量进行分析，在某些条件限定下成正比的关系来进行定量分析的，也就是说，在色谱分析中，在某些条件限定下，色谱峰的峰高或峰面积与所测组分的数量成正比。因此，色谱定量分析的基本公式为：ωi=fiAi或Ci=fihi
（或已知准确含量的样品），而实际样品的组成却千差万别，因此必将给测量带来一定的误差。
二、定量分析方法
2.内标法
若试样中所有组分不能全部出峰，或只要求测定试样中某个或某几个组分的含量时，可以采用内标法定量。所谓内标法就是将一定量选定的标准物（称内标物S）加入到一定量试样中，混合均匀，在一定操作条件下注入色谱仪，出峰后分别测量组分i和内标物S的峰面积（或峰高），按下式计算组分i的含量。

色谱分析法导论-(3)

要参数。
k K VS tR' VM tM
相比β
色谱柱内固定相和流动相体积之比
VM K
VS k
是柱型及结构的重要特征。
4. 色谱相关术语
❖ 关于色谱峰 ❖ 关于保留值 ❖ 关于分配平衡
关于色谱峰的术语
标准偏差σ
峰峰高
峰面积
半峰宽
峰宽
基线
色谱峰宽（区域宽度）峰底宽 Wb 在色谱峰两边的转折点所画的切线与基线相交的截距。标准偏差σ 拐点间距离的一半 0.607h
对柱型研究和发展的影响（2）
➢ B=0? ➢ 溶质在液体中的扩散系数DL≈10-5cm2/s ➢ 溶质在气体中的扩散系数Dg≈10-1cm2/s ➢ DL 《 Dg ➢ 当采用液体作流动相时 B→0 ➢ 液体作流动相时可用更细的固定相，A ↓ ➢ HPLC柱效比GC要高2~3个数量级
操作条件对柱效的影响（1）
茨维特的实验
因此
❖ 色谱法是一种分离方法。
它的特点是：有两相，一是固定相，一是流动相，两相作相向运动。
❖ Chromatography
❖ 将色谱法用于分析中，则称为色谱分析。
色谱分析是一种分离、分析法。
2、色谱法分离原理
❖ 当流动相中所携带的混合物流过固定相时，就会和固定相发生作用(力的作用)。由于混合物中各组分在性质和结构上有差异，与固定相发生作用的大小也有差异。因此在同一推动力作用下，不同组分在固定相中的滞留时间有长有短，从
时间将大大延长。因此，k的最佳范围是1<k<10。
❖ 改变容量因子的方法有：
改变柱温改变相比，即改变固定相的量和改变柱死体积，
其中死体积对k/(k+1)的影响很大，使用死体积大的柱子，分离度将受到很大损失。在高效液相色谱中改变流动相的配比是最简便、最有效的方法

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4、检测器、
作用—— 用来连续监测经色谱柱分离后的流出物的作用组成和含量变化的装置。对检测器的要求是：组成和含量变化的装置。对检测器的要求是：灵敏度高，重复性好、线性范围宽、度高，重复性好、线性范围宽、死体积小以及对温度和流量的变化不敏感等
紫外-可见检测器紫外可见检测器荧光检测器
电极
电导仪
电极
应用于离子色谱
清华大学材料与表面组
（5）示差折光检测器）
浓度型监测器，浓度型监测器，适当条件下对所有的溶质都有响应，应用范围宽
清华大学材料与表面组
液相色谱分离模式
一、吸附色谱（adsorption chromatography））原理：原理：
基于被测组分在固定相表面具有吸附作用，基于被测组分在固定相表面具有吸附作用，且各组分的吸附能力不同，组分的吸附能力不同，使组分在固定相中产生保留和实现分离。留和实现分离。
• 反相反相HPLC（reversed phase HPLC）：（）：
– 由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，由非极性固定相和极性流动相所组成的液相色谱体系，与正相HPLC体系正好相反。其代表性的固定相是十八体系正好相反。与正相体系正好相反烷基键合硅胶(ODS柱），代表性的流动相是甲醇和乙烷基键合硅胶柱），代表性的流动相是甲醇和乙是当今液相色谱的最主要分离模式，腈。是当今液相色谱的最主要分离模式，适合于分离芳烃、芳烃、稠环芳烃及烷烃等化合物
清华大学材料与表面组
键合固定相
最常使用的全孔微粒硅胶（～最常使用的全孔微粒硅胶（3～10µm）是化）优点是：学键合相硅胶，优点是：硅胶的强度大； ①硅胶的强度大； ②微粒硅胶的孔结构和表面积易人为控制 ③化学稳定性好最常用的键合相键型是：硅烷化键合相，最常用的键合相键型是：硅烷化键合相，它是硅胶与有机硅烷反应的产物；
2. 反相色谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，极反相色谱中，溶质按其疏水性大小进行分离，性越大疏水性越小的溶质，性越大疏水性越小的溶质，越不易与非极性的固定相结合，相结合，所以先被洗脱下来
清华大学材料与表面组
三、体积排斥色谱又称凝胶色谱和分子筛色谱）（又称凝胶色谱和分子筛色谱）
原理：以多孔性物质作固定相，原理：以多孔性物质作固定相，样品分子受固定相孔径大小的影响而达到分离的一种液相色谱分离模式。相色谱分离模式。
目前最常用的检测器主要有：测器主要有：
电化学检测器蒸发光散射检测器示差折光检测器质谱检测器
清华大学材料与表面组
（1）紫外可见检测器）紫外-可见检测器
检测室
光栅
光源
二极管阵列检测器
清华大学材料与表面组
（2）荧光检测器）
1. 许多有机化合物，特别是芳香族化合物、许多有机化合物，特别是芳香族化合物、被一定强度和波长的紫外光照射后，被一定强度和波长的紫外光照射后，发射出较激发光波长要长的荧光。出较激发光波长要长的荧光。但可以与发荧光物质反应衍生化后检测。荧光物质反应衍生化后检测。 2. 特点：有非常高的灵敏度和良好的选择特点：灵敏度要比紫外检测法高2∼ 个数量性，灵敏度要比紫外检测法高 ∼3个数量级，特别适合于药物和生物化学样品的分析。
固定相：固定相：
固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、固定相通常是活性硅胶、氧化铝、活性炭、聚乙聚酰胺等固体吸附剂，烯、聚酰胺等固体吸附剂，所以吸附色谱也称液固吸附色谱。活性硅胶最常用。固吸附色谱。活性硅胶最常用。
清华大学材料与表面组
吸附色谱
1. 流动相：流动相：
弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，弱极性有机溶剂或非极性溶剂与极性溶剂的混合物，如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷/甲醇）、二氯甲烷甲醇、如正构烷烃（己烷、戊烷、庚烷等）、二氯甲烷甲醇、乙酸乙酯/乙腈等乙酸乙酯乙腈等
色谱分离过程
eluent
Temporal course
清华大学材料与表面组
按离子在固定相中的保留机理分类
• 离子交换色谱 • 离子排斥色谱 • 离子对反相分配色谱 • 离子抑制色谱 • 金属配合物分配色谱
清华大学材料与表面组
离子色谱可以分离的物质
• 无机阴离子酸根阴离子无机阴离子: • 无机阳离子碱金属碱土金属过渡金属无机阳离子: 碱金属,碱土金属碱土金属,过渡金属 • 有机阴离子: 有机酸烷基磺酸多聚磷酸烷基磺酸,多聚磷酸有机阴离子有机酸,烷基磺酸 • 有机阳离子有机胺生物碱吡啶有机阳离子: 有机胺,生物碱生物碱,吡啶 • 天然有机物糖,醇,酚,水溶性维生素天然有机物: 醇酚水溶性维生素 • 生物物质有机磷化合物核酸核苷酸碱基生物物质: 有机磷化合物,核酸核苷酸,碱基核酸,核苷酸碱基, 蛋白质
清华大学材料与表面组
液液分配色谱类型
• 正相正相HPLC（normal phase HPLC）：（）：
– 是由极性固定相和非极性（或弱极性）流动相所组成是由极性固定相和非极性（或弱极性）体系。的HPLC体系。其代表性的固定相是改性硅胶、氰基柱体系其代表性的固定相是改性硅胶、代表性的流动相是正己烷。等，代表性的流动相是正己烷。吸附色谱也属正相 HPLC， HPLC，适合于分离极性化合物
清华大学材料与表面组
正相色谱
• 正相色谱常用的流动相及其冲洗强度的顺序是：序是：正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜异丙醇正己烷＜乙醚＜乙酸乙酯＜
其中最常用的是正已烷，虽然其价格较贵，其中最常用的是正已烷，虽然其价格较贵，但80 和邻位、％的顺、反和邻位、对位异构体仍然要用正相的顺、色谱来进行分离
清华大学材料与表面组
OH OH + C18H37SiCl3 OH
O O O Si
C18H37
最常用的“万能柱” ——“C18柱”，简称最常用的“万能柱” 柱 “ODS”柱，即十八烷基硅烷键合硅胶填料柱）。在反相色谱中发挥（Octadecylsilyl，简称，简称ODS）。在反相色谱中发挥）。着极为重要的作用，可完成高效液相色谱70～％着极为重要的作用，可完成高效液相色谱～80％的分析任务。的分析任务。 C18有较高的碳含量和更好的疏水性，对各种有较高的碳含量和更好的疏水性，有较高的碳含量和更好的疏水性类型的生物大分子有更强的适应能力，类型的生物大分子有更强的适应能力，在生物化学分析工作中应用最为广泛。分析工作中应用最为广泛。
• 在正相色谱柱中，极性弱的先流出在正相色谱柱中，
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反相色谱
1. 反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下：反相色谱最常用的流动相及其冲洗强度如下：
H2O＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜四氢呋喃＜甲醇＜乙腈＜乙醇＜丙醇＜异丙醇＜常用的流动相组成是：甲醇常用的流动相组成是：“甲醇—H2O”和“乙腈和乙腈—H2O”，，通常优先考虑“甲醇通常优先考虑“甲醇—H2O”流动相流动相
大分子全排出V 大分子全排出 R = V0 小分子全进入V 小分子全进入 R = V0 + VS 中分子部分进入V 中分子部分进入 R = V0 + KVS
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离子色谱
离子性成分在色谱固定相中=
离子色谱分析
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固定相
离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。离子交换色谱常用的固定相为离子交换树脂。目前常用的离子交换树脂分为三种形式：常用的离子交换树脂分为三种形式：一是常见的纯离子交换树脂；离子交换树脂；第二种是玻璃珠等硬芯子表面涂一层树脂薄层构成的表面层离子交换树脂；第三种为层树脂薄层构成的表面层离子交换树脂；大孔径网络型树脂按结合的基团不同，按结合的基团不同，离子交换树脂可分为阳离子交换树脂和阴离子交换树脂
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按键合到载体上的官能团可分为：按键合到载体上的官能团可分为：
1. 非极性键合固定相：键合在载体表面的功能分非极性键合固定相：子是烷基、苯基等非极性有机分子。子是烷基、苯基等非极性有机分子。如最常用的ODS（Octa Decyltrichloro Silane）柱或C18 （）柱或柱、C8、C4等、等 2. 极性键合固定相：键合在载体表面的功能分子极性键合固定相：是具有二醇基、醚基、氰基、氨基等极性基团是具有二醇基、醚基、氰基、的有机分子
一般分为：液液色谱、键合相（一般分为：液液色谱、键合相（bonded-phase）色谱）
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液液分配色谱
1. 液-液分配色谱固定相是通过物理吸附的液分配色谱固定相是通过物理吸附的液分配色谱固定相方法将固定液涂在载体表面，方法将固定液涂在载体表面，由于流动相的溶解作用或机械力作用，的溶解作用或机械力作用，固定相容易流导致保留行为的改变，重现性很差，失，导致保留行为的改变，重现性很差，引起分离试样的污染 2. 后来发展起来的键合固定相以化学键合的后来发展起来的键合固定相键合固定相以化学键合的方法将功能分子结合到惰性载体上，方法将功能分子结合到惰性载体上，固定相就不会溶解到流动相中去
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离子交换色谱
（ion exchange chromatography, IEC）
IEC使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固使用表面有离子交换基团的离子交换剂作为固定相。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）定相。带负电荷的交换基团（如磺酸基和羧酸基）可以用于阳离子的分离，带正电荷的交换基团（可以用于阳离子的分离，带正电荷的交换基团（如季胺盐）可以用于阴离子的分离。季胺盐）可以用于阴离子的分离。不同离子与交换基的作用力大小不同，基的作用力大小不同，在树脂中的保留时间长短不从而被相互分离。同，从而被相互分离。