分子生物学的方法鉴定微生物32页PPT

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一、 原核微生物分类系统
（一）《伯杰氏鉴定细菌学手册》 (Bergey’s Manual of Determinative Bacteriology)
美国宾夕法尼亚大学的细菌学教授伯杰(D.Bergey)(18601937) 伯杰氏手册: 是目前进行细菌分类、鉴定的最重要参考书， 其特点是描述非常详细，包括对细菌各个属种的特征及进行 鉴定所需做的实验的具体方法。
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界Ⅱ：真细菌(Bacteria)
部17：γ-变形细菌(γ-Proteobacteria，150属854 种)
部18：δ-变形细菌(δ-Proteobacteria，39属128 种)
部19：ε-变形细菌(ε-Proteobacteria，6属56种) 部20：梭菌(Clostridia)和相关细菌(73属403种) 部21：柔膜菌(Mollicutes，10属191种)
（二）伯杰氏系统细菌学手册 (Bergey’s Manual of Systematic Bacteriology)
第一版 1984年问世，至1989年出齐，共4卷。 第二版 由George Garrity主编分为5卷，将从2000年 起陆续出版。这一版纳入了研究核糖体RNA测序所产 生的许发育)分类系统。
• 部2：产甲烷菌(Methanogens，21属97种) • 部3：盐杆菌(Halobacteria，14属50种) • 部4：热原体(Thermoplasma，2属4种) • 部5：热球菌(Thermococci，5属19种)
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界Ⅱ：真细菌(Bacteria)
部6：产液菌(Aquifex)和相关细菌(3属5种) 部7：栖热袍菌(Thermotoga)和Geotogas，9

性
•增加定量的精确性
全程监控,准确的算法进行定量
•结果分析更加快捷方便,无需跑胶
基因和蛋白质芯片
原理
基因芯片(gene chip)也称为DNA微距阵(DNA
microarray)、DNA芯片(DNA chip)等。它是指
将大量靶基因或寡核苷酸片段有序地高密度地
排列固定于玻片、硅片等固相载体上，然后与
因芯片，蛋白质芯片，组织芯片等。
荧光定量 PCR（real-time PCR)
此外，该试剂盒还具有检测特异
HCG)，人生长激素(HGH)含量进行定量分析, 测定9种肿瘤(如
荧光定量PCR标记方法
可以快速分类和定量分析
National Institute of Allergy and Infectious Diseases (NIAID)圈定的最致
长因子（VEGF）和人促黄体生成激素（hLH）等也都有了诊断基
因芯片。在肿瘤方面,蛋白质芯片已成功地应用于诊断白血病、
乳腺癌、心力衰竭等疾病的诊断,诊断用的抗体芯片有霍乱毒素、
待测的标记样品的基因按碱基互补配对原理进
行杂交，通过激光共聚焦荧光检测系统等对芯
片进行扫描，再经计算机软件处理，从而获取
大量的信息。
基因微阵列技术优势
基因微阵列技术作为一种高通量的检测
新技术,可以同时检测数以万计的生物分
子，现在已经广泛应用于各个方面，其
中包括病原生物的监控和诊断。
发现未知病原体。例如确定SARS-CoV应
性的P53芯片，能诊断药物代谢缺乏症的细胞色素P450芯片. 在
病原体的检测方面, 成功的例子有HBV、丙型肝炎病毒HCV、甲型
肝炎病毒（HAV）、庚型肝炎病毒（HGV）、巨细胞病毒（CMV）、

烧伤病人的治疗通常是取烧伤病人的 健康皮 肤进行 自体移 植，但 对于大 面积烧 伤病人 来讲， 健康皮 肤很有 限，请 同学们 想一想 如何来 治疗该 病人
微生物的鉴定（identification）:
借助于现有的微生物分类系统，通过特 征测定，确定未知的、或新发现的、或未 明确分类地位的微生物所应归属分类群的 过程。
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该法常用于肠道菌、噬菌体和病毒的分类鉴定。 利用此法，已将伤寒杆菌、肺炎双球菌等菌分成数 十种菌型。
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4．生态学特征
生态学特征主要包括它与其它生物之间的关系（是 寄生还是共生？寄主范围以及致病的情况）、在自然界 的分布情况（pH情况、水分程度等）、渗透压情况（是 否耐高渗、是否有嗜盐性等）。
在具体鉴定时，可参看中国科学院微生物研究所 细菌分类组编著的《一般细菌常用鉴定方法》一书。
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3．要有合适的鉴定方法
微生物种类繁多，特征各异，性状有主次之分。 因此，在鉴定某种微生物时，要选用合适的鉴定方法， 确定主要的测试项目。

11、越是没有本领的就越加自命不凡。——邓拓 12、越是无能的人，越喜欢挑剔别人的错儿。——爱尔兰 13、知人者智，自知者明。胜人者有力，自胜者强。——老子 14、意志坚强的人能把世界放在手中像泥块一样任意揉捏。——歌德 15、最具挑战性的挑战莫过于提升领 导者本 身在这 方面以 身作则 才能收 到成效 。—— 马卡连 柯 14、劳动者的组织性、纪律性、坚毅 精神以 及同全 世界劳 动者的 团结一 致，是 取得最 后胜利 的保证 。—— 列宁 摘自名言网
15、机会是不守纪律的。——雨果
谢谢
微生物的分类和分子鉴定
11、战争满足了，或曾经满足过人的 好斗的 本能， 但它同 时还满 足了人 对掠夺 ，破坏 以及残 酷的纪 律和专 制力的 欲望。 ——查·埃利奥 特 12、不应把纪律仅仅看成教育的手段 。纪律 是教育 过程的 结果， 首先是 学生集 体表现 在一切 生活领 域—— 生产、 日常生 活、学 校、文 化等领 域中努 力的结 果。— —马卡 连柯(名 言网)

二级结构
蛋白质局部主链的空间结构， 包括α-螺旋、β-折叠等。
三级结构
整条肽链中全部氨基酸残基的 相对空间位置Байду номын сангаас即整条肽链每 一原子的相对空间位置。
四级结构
由两条或两条以上的多肽链组 成的一类结构，每一条多肽链
都有完整的三级结构。
蛋白质的功能与分类
结构蛋白：作为细胞的结构，如膜蛋白，染色体蛋白等 。 酶：催化生物体内的化学反应。
分子生物学是生物学的重要分支
01
分子生物学以生物大分子为研究对象，揭示生命现象的分子基
础，是生物学的重要分支之一。
分子生物学推动生物学的发展
02
分子生物学的发展推动了生物学的研究从细胞水平向分子水平
深入，为生物学的发展提供了新的理论和技术支持。
分子生物学与其他学科的交叉融合
03
分子生物学与遗传学、生物化学、微生物学、免疫学等学科存
。
表观遗传学调控
通过改变染色质结构和DNA 甲基化等方式来调控基因表达
。
05
蛋白质的结构与功能
蛋白质的分子组成
氨基酸
蛋白质的基本组成单元，共有20 种标准氨基酸。
肽键
连接氨基酸之间的主要化学键。
辅基与辅酶
某些蛋白质还包含辅基或辅酶， 以辅助其功能的发挥。
蛋白质的结构层次
一级结构
指蛋白质中氨基酸的排列顺序 。
重组DNA分子的构建和 筛选
PCR技术及其应用
01
02
PCR技术的基本原理和步骤
引物的设计和选择
03
04
PCR反应体系和条件优化
PCR技术在DNA扩增、突变 分析、基因分型等领域的应用
基因克隆与基因工程

例1：苏云金芽孢杆菌蜡螟亚种 Bacillus thuringiensis （subsp）galleria 例2：椭圆酿酒酵母（或酿酒酵母椭圆变种） Saccharomyces cerevisiae （var）ellipsoideus
由于细菌分类单元的划分缺乏一个易于操作的统一标准， 为了减少因采用不同标准界定分类单元所造成的混乱， 细菌系统分类也像其他生物分类一样采用“模式概念”
学名（scientific name）
指一个菌种的科学名称，它是按照《国际 细菌命名法规》命名的、国际学术界公认并通 用的正式名字。
一、双名法（binominal nomenclature）
双名法指一个物种的学名由前面一个属名（generic name）和后面一个种名加词（specific epithet）两部分
Ainsworth从1966年起，就把真菌界分为两大门 （粘菌门和真菌门），并把真菌门再分成五个亚门。 目前，该系统已为各国广大真菌分类学者所普遍采 用，影响较大。
三、酵母菌的分类
酵母菌的分类普遍采用荷兰的Loddov在1970 年提出的分类系统。
在这个分类系统中，以是否形成各类有性孢子 作为分类的起点，
细致的观察和测试，参照一定的，用对比的方法来 确定该微生物的分类地位。
第一节 通用分类单元
三、种以下的分类单元
亚种（subspecies，subsp.，ssp.） 变种（variety，var.） 型（form） 类群（group） 菌株（strain） 小种（race） 相（phase） 态（state）
一般指自然存在的微生物交互变异中的一定阶段。
（八）态（state）
通常指微生物的菌落变异状态，如粗糙、光 滑或粘液状等。

第一，由于16 S rDNA具有高度保守性，且分子小、包含的信息量较少，对 于亲缘关系较近的细菌，其分辨率不高。
第二，16 S rDNA序列分析只能在属的水平上区分细菌，而在水平分类这个 环节上仍然需要借助其他手段加以辅助分析。
8
细菌核心基因（看家基因）
虽然说细菌的基因组的大小和基因段是千差万别，但是 无论多么小，它们必须包含有所有的信息去允许细菌 去执行多种必要的功能，给予细胞维持内部的代谢平 衡的能力，复制和进化，这三种主要的活细胞的功能 。细胞经常能够吸收代谢物但其不是功能蛋白，因此 ，它们必须去依赖它们自有的基因产物去执行不要的 功能。
9
1.信息的存储和加工 DNA的代谢：（1）基本的复制功能（2）DNA的修复、限制和 修饰 RNA的代谢 ： （1）基本的转运功能（2） 翻译 （3） RNA的降解 2 蛋白质的加工、折叠、分泌 3 细胞的结构和细胞壁的加工 4 活跃且处于中间的代谢
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gyrB亚单位蛋白的基因 ，属于信息通路中与DNA复制、限制、修饰或修复有关的蛋白编码 基因。在大多数细菌中，以单拷贝的形式存在细菌基因组的rnpA— rmpH—dnaA—dnaN—recF—gyrB—rnpA基因簇中。编码的是唯一 一种能诱导DNA负超螺旋的拓扑异构酶一DNA促旋酶的B亚单位蛋白 GyrB。
常见的几种方法： （1）标记法 （2）吸光度法 （3）荧光强度法等
3
DNA-DNA杂交
核酸杂交目前常采用固相杂交法，将待测菌株双链核酸解成单链固定 在硝酸纤维素滤膜等固相支持物上，置入含有经标记的并解链的参照菌 株的单链核酸(探针)液中复性，形成新的双链核酸，测定杂合双链的相对 放射性强度来确定菌株问的同源性程度。
12
Kasai在对小单孢菌属(Micromonospora)15个有效描述的种和4个亚种的gyrB序 列的研究中，得到了与基于16 S rDNA序列相似的系统发育关系，但种内关系结 果不同。经过与DNA—DNA杂交的比较分析，结果表明：基于gyrB序列的分类 关系更符合DNA—DNA杂交结果。

（2）种的加名词：又称种加词，它代表一个物种的次要特征。 （3）字母的发音：按规定，学名均按拉丁字母发音规则发音。
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第二节 微生物分类系统
一、Bergey 氏原核生物分类系统
该分类系统把原核生物分为古生菌和细菌界，它们相当于 三域学说中的两个域，古生菌界包括2门、 5组、8纲、11目 、 17科和63属，共有208个种；而细菌界则包括16门 、26组 、27 纲 、62目 、163科和814属，共有4727个种 。因此至今所记载 过的整个原核生物共有4935种。
微生物的分类鉴 定
1
微生物的分类鉴定
目前所知道的微生物种类已超过10万种，而且这个数字正在急 剧扩大。微生物工作者只有在掌握了分类学知识的基础上，才能 对纷繁的微生物类群有一个清晰的轮廓，并对它们进行分类。
微生物分类学是一门按微生物的亲缘关系把它们成条理清楚 的各种分类单元或分类群的科学。它的具体任务有三，即分类、 命名和鉴定。
⑵进行特征测定或从文献中收集有关OUT的各项特征资料； ⑶根据所编制的计算机程序要求，将特征资料进行编码、标 准化并输入计算机； ⑷由计算机计算各OUT之间的相似性并根据相似性的数值进 行聚类分析、分群归类；
⒉化学分类法
微生物分类中，根据微生物细胞的特征 性化学组分对微生物进行分类的方法称为化学
5
第一节 通用分类单元
3 、型（form）：曾用作的同义词，现已废除，紧作若干变异型的
后缀，如:生物变异型、形态变异型、致病变异型、噬菌变异型
和血清变异型等。 4、菌株（strain）：又称品系，它表示任何由一个独立的单细胞
（或单个病毒粒）繁殖而成的纯遗传型群体及其一切后代。因此， 一种微生物的每一不同来源的纯培养物或纯分离物均可称为菌种 的一个菌株。

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细菌自动鉴定系统
API细菌数值鉴定系统 “Enterotube”系统 “Biolog”全自动和手动 细菌鉴定系统
API细菌数值鉴定系统流程 7
微生物分类鉴定中的现代方法
核酸分析鉴定微生物的遗传型 细胞化学成分用作鉴定指标
（略） 数值分类法（略）
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核酸分析鉴定微生物的遗传型
DNA是除少数RNA病毒以外的一切微生物的遗传信息载体。每一种微 生物均有其自己特有的、稳定的DNA即基因组的成分和结构，不同种 微生物间基因组序列的差异程度代表着它们之间亲缘关系的远近、疏密。 因此可以用基因组的一些指标作为鉴定微生物类别的依据。
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核酸分子杂交
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rRNA寡核苷酸数目
20世纪70年代末由于美国伊利诺斯大学的C.R.Woese 等人对大量微生物和其他生物进行16s和18srRNA的寡 核苷酸测序，并比较其同源性水平后，提出了一个与 以往各种界级分类不同的新系统，称为三域学说， "域"是一个比界更高的界级分类单元，过去曾称原界。 三个域指的是细菌域(以前称"真细菌域")、古生菌域 (以前称古细菌域)和真核生物域。
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微生分类鉴定中的现代方法
DNA碱基比例测定 核酸分子杂交法 rRNA寡聚核苷酸编目
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DNA碱基比例
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DNA碱基比例
每个生物种都有特定的 GC%范围，因此 可以作为 分类鉴定的指标。细菌的 GC%范围为25--75%，变化 范围最大，因此更适合于 细菌的分类鉴定。
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DNA碱基比例
GC%测定主要用于对表型特征难区分的细菌作 出鉴定，并可检验表型特征分类的合理性，从分子 水平上判断物种的亲缘关系。
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rRNA寡核苷酸数目