哺乳动物卵母细胞体外成熟培养中影响因素分析

卵母细胞体外成熟的影响因素乔利敏1,2 黄成定2　李向臣1　姚雅馨2　关伟军13 马月辉1(1中国农业科学院北京畜牧兽医研究所北京100094　2甘肃农业大学动物科技学院兰州730070) 【摘要】随着哺乳动物体外受精、细胞核移植技术的不断深入,人们对成熟卵母细胞以及哺乳动物胚胎需求量日益增加,卵巢内丰富的卵泡资源是胚胎工程迅速发展的基础。

本文从卵巢因素、供体、体外培养条件和成熟培养液中添加成分等对卵母细胞IVM的影响进行了分析,为胚胎的体外生产提供理论基础和科研依据。

关键词:卵母细胞;体外成熟;影响因素 胚胎移植技术成熟与否是胚胎工程技术成败的基础,而卵母细胞体外成熟质量又是决定胚胎移植技术成功的关键。

IVM可以为体细胞核移植提供大量的受体细胞,也为体外受精提供大量的MⅡ期卵母细胞,因此IVM已经成为胚胎体外生产和体外受精的重要环节之一。

虽然近几年来在卵母细胞的体外成熟方面已经取得了飞速发展,但是卵母细胞的体外成熟还存在很多问题。

现就卵母细胞体外成熟的影响因素进行概述。

1　卵巢因素和供体对卵母细胞体外成熟的影响1.1　卵巢所处性周期的影响有学者研究表明,卵巢所处性周期阶段影响卵母细胞的成熟培养,在无黄体期卵巢上的卵母细胞比黄体期和黄体前期卵巢上卵母细胞成熟效果要好。

崔亚利等〔1〕根据卵巢上是否有明显突出卵巢表面的黄体,将卵巢分为黄体期和卵泡期,分别在两期卵巢上卵泡中抽取卵母细胞进行体外成熟培养发现,二者无统计学差异,但是卵泡期卵母细胞成熟培养效果(63.9%)较好,说明卵巢性周期阶段对卵母细胞体外成熟存在一定影响,但影响不大。

2000年郭继彤〔2〕对繁殖季节和非繁殖季节山羊卵母细胞进行研究发现,非繁殖季节可采集到比繁殖季节更多的可用卵母细胞,并且非繁殖季节的屠宰山羊卵巢卵母细胞成熟培养效果(74.1%)优于繁殖季节的屠宰山羊卵巢卵母细胞(67.7%)。

在非繁殖季节屠宰的山羊,几乎没有大卵泡的发生。

试论牛卵母细胞体外受精技术牛卵母细胞体外受精是指在脱离母体的情况下，人为创造母牛体内繁殖条件，在牛体外完成精卵结合，培育出受精卵并在体外培养至桑椹胚或是囊胚阶段，将胚胎移植到母牛体内孕育胎儿。

体外受精是繁育犊牛的重要技术，在牛繁殖领域应用普遍，涉及到的技术有牛卵母细胞的采集、成熟培养与判断，牛精子的筛选、获能，以及具体的受精操作等。

针对技术应用关键节点及技术参数、操作细节的分析研究，最终达到获取高质量胚胎的目的，助力于养牛业的高质量发展。

1 牛卵母细胞体外采集与培养技术1.1 牛卵母细胞体外采集技术1.1.1 采集方式常用的动物卵母细胞采集方式如下：（1）直接采集成熟的卵母细胞，采用超排技术从动物的输卵管采集，但不适用于牛这种大型动物；（2）活体采卵，选择繁殖性能优秀的母牛，借助腹腔镜直接采集，对采集母牛的繁殖性能影响较小；（3）从屠宰场获取，宰杀母牛后直接采集牛卵巢。

该采集方式简单、直接、成本低，可大批量采集。

1.1.2 采集技术在从屠宰场获取牛卵巢后，将其放入保温瓶中，瓶中事先装入用生理盐水稀释的硫酸庆大霉素，温度大约是30 ℃，用于保持牛卵巢的新鲜度。

在1 h 内完成卵泡的收集，在实验室环境下，使用生理盐水清洗干净牛卵巢，然后使用注射器直接吸取卵泡，获取卵泡液，准备进行体外成熟培养。

1.2 体外成熟培养使用体视显微镜筛选质量好的卵母细胞用于体外成熟培养，将筛选出的卵母细胞放入培养液中，培养液中含有17-E2 的中央记忆型T 细胞1.5 μg/mL；胎牛血清10%，促黄体生成素20%；卵泡刺激素20 μg/mL。

将培养液放入经过温度校正后的培养箱中，温度调整至38～39 ℃，气象条件为5%的CO2，培养时间22～24 h，需根据牛卵母细胞采集时的成熟情况，适当延长1～2 h，但不可超过26 h，一旦超过牛卵母细胞将进入老化期。

1.3 体外成熟判定在培养24 h 后进行牛卵母细胞的成熟检查，当其进入第二次减数分裂中期则判定为成熟。

低氧分压通过低氧诱导因子(HIF)影响卵母细胞的体外成熟和早期胚胎的发育刘晓淋;杜凤娇;雷钏;阮秋燕;吴柱连;孙洪亮;赵鑫;邓彦飞;陆凤花【摘要】卵母细胞和早期胚胎的体外培养(IVC)是哺乳动物胚胎工程的一项关键技术,是生殖生物学和转基因与克隆技术等生物技术研究的基础.影响卵母细胞和早期胚胎体外培养的因素包括培养液组成成分、离子浓度和渗透压,培养环境气相组成和温度等.最近研究表明,培养系统中的氧分压可以显著影响胚胎的发育,而这种影响主要由低氧诱导因子(hypoxia-inducible factor,HIF)进行调控.作者综述了氧分压及HIF对卵母细胞和早期胚胎体外发育的影响,并对HIF的结构及调控机制进行讨论,为研究低氧培养技术在卵母细胞和早期胚胎体外培养中的应用提供依据.【期刊名称】《中国畜牧兽医》【年(卷),期】2015(042)006【总页数】7页(P1559-1565)【关键词】低氧诱导因子;氧分压;卵母细胞;早期胚胎【作者】刘晓淋;杜凤娇;雷钏;阮秋燕;吴柱连;孙洪亮;赵鑫;邓彦飞;陆凤花【作者单位】广西大学,亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁530004;广西大学,亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁530004;广西大学,亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁530004;广西大学,亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁530004;广西大学,亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁530004;广西大学,亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁530004;广西大学,亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁530004;广西大学,亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁530004;广西大学,亚热带农业生物资源保护与利用国家重点实验室,南宁530004【正文语种】中文【中图分类】S814.6近年来，虽然胚胎体外培养技术取得了长足进展，但研究结果表明，体外培养胚胎的发育与体内胚胎相比，存在显著差异。

中国畜牧兽医 2024,51(3):1171-1182C h i n aA n i m a lH u s b a n dr y &V e t e r i n a r y Me d i c i n e 哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展李有为1,程亚倬2,商继勇2,张廷龙1,孙铭菊2(1.青岛农业大学海都学院,莱阳265200;2.青岛农业大学动物医学院,青岛266109)摘 要:体外成熟是哺乳动物胚胎工程获得成熟卵母细胞的主要途径,卵母细胞质量直接影响早期胚胎发育,妊娠的建立及维持,胎儿的发育等㊂哺乳动物卵巢表面数量众多的小卵泡可以作为胚胎工程卵母细胞的来源,但从哺乳动物卵巢获取的卵母细胞成熟差异较大,存在处于发育各个时期的卵母细胞,小卵泡卵母细胞体外成熟质量差,发育能力不足㊂如何提高小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力以充分挖掘优良母畜的遗传资源,提高胚胎工程效率成为研究热点㊂基于此,文章概述哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展,比较大㊁小卵泡卵母细胞物质积累差异㊁卵泡的卵泡液成分及含量差异以及卵泡颗粒细胞和卵丘细胞的差异,分析哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因,分析总结提高哺乳动物小卵泡体外成熟卵母细胞发育能力的措施,包括抑制核成熟㊁成熟前培养㊁颗粒细胞及卵丘细胞与卵母细胞共培养,期望能够为小卵泡卵母细胞发育调控机制的研究及发育能力的提高提供理论指导㊂关键词:哺乳动物;小卵泡;卵母细胞;体外成熟中图分类号:S 814.6文献标识码:AD o i :10.16431/j .c n k i .1671-7236.2024.03.029 开放科学(资源服务)标识码(O S I D ):收稿日期:2023-08-12基金项目:山东省自然科学基金项目(Z R 2020Q C 193);重庆市妇幼保健院开放课题(2020K F K T 005);青岛农业大学高层次人才科研基金(663/1120012)联系方式:李有为,E -m a i l :l i yo u w e i 008@163.c o m ㊂通信作者孙铭菊,E -m a i l :s u n 8911@163.c o m R e s e a r c hP r o gr e s s o n i n v i t r o M a t u r a t i o no f S m a l l F o l l i c l e -d e r i v e dO o c yt e s i n M a m m a l i a n L IY o u w e i 1,C H E N G Y a z h u o2,S H A N GJ i y o n g 2,Z H A N G T i n g l o n g 1,S U N M i n g ju 2(1.H a i d uC o l l e g e ,Q i n g d a oA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,L a i y a n g 265200,C h i n a ;2.C o l l e g e o fV e t e r i n a r y M e d i c i n e ,Q i n g d a oA g r i c u l t u r a lU n i v e r s i t y ,Q i n g d a o 266109,C h i n a )A b s t r a c t :I nv i t r o m a t u r a t i o ni st h e m a i n w a y f o r m a m m a l i a ne m b r y oe n g i n e e r i n g too b t a i n m a t u r e o o c y t e s .T h e q u a l i t y o f o o c y t e s d i r e c t l y a f f e c t s e a r l y e m b r y o n i c d e v e l o pm e n t ,e s t a b l i s h m e n t a n dm a i n t e n a n c eo f p r e g n a n c y ,a n df e t a ld e v e l o p m e n t .T h e l a r gen u m b e ro f s m a l l f o l l i c l e so n t h e s u r f a c e o f m a m m a l i a n o v a r i e s c a n p r o v i d e o o c y t e s t h a t a p p l y t o e m b r y o e n g i n e e r i n g ,b u t t h eo o c y t e so b t a i nf r o mt h eo v a r y a r ea td i f f e r e n ts t a g e st h a ts h o w sd i f f e r e n t m a t u r e c a p a c i t y ,a n d t h e q u a l i t y o f i n v i t r o m a t u r a t i o n o f o o c yt e s f r o ms m a l l f o l l i c l e s a r e p o o r a n d d e f i c i e n t i nd e v e l o p m e n t a l a b i l i t y .H o wt o i m p r o v e t h e i n v i t r o m a t u r a t i o n a b i l i t y o f s m a l l f o l l i c l e o o c y t e s t of u l l y t a p i n t ot h e g e n e t i cr e s o u r c e so fe x c e l l e n tf e m a l ea n i m a l sa n di m pr o v et h e e f f i c i e n c y o fe m b r y o e n g i n e e r i n g h a s b e c o m e ar e s e a r c h h o t s p o t .B a s e d o n t h i s ,t h er e v i e w s u m m a r i z e s t h e r e s e a r c h p r o g r e s so f i n v i t r o m a t u r a t i o no f s m a l l f o l l i c l eo o c yt e s i n m a m m a l i a n ,c o m p a r e s t h e d i f f e r e n c e s i n a c c u m u l a t i o n o f o o c y t em a t e r i a l ,t h e d i f f e r e n c e s i n t h e c o m po s i t i o n a n d c o n t e n t o f f o l l i c u l a r f l u i d ,a n d t h e d i f f e r e n c e s b e t w e e n f o l l i c u l a r g r a n u l o s a c e l l s a n d c u m u l u s c e l l si n l a r g e a n d s m a l l f o l l i c l e s ,a n a l y z e s t h e r e a s o n s f o r t h e p o o r q u a l i t y ofm a m m a l i a ns m a l l f o l l i c l e中国畜牧兽医51卷o o c y t e s i n v i t r o m a t u r a t i o n,a n a l y z e s a n d s u m m a r i z e s t h em e a s u r e s t o i m p r o v e t h ed e v e l o p m e n t a l a b i l i t y o f m a m m a l i a ns m a l l f o l l i c l eo o c y t e s i nv i t r o m a t u r a t i o n,i n c l u d i n g i n h i b i t i o no fn u c l e a r m a t u r a t i o n,p r e-m a t u r a t i o n c u l t u r e o f o o c y t e a n d c o-c u l t u r e o f o o c y t e s w i t h g r a n u l o s a a n d c u m u l u s c e l l s,w h i c ha i m e s a t p r o v i d i n g t h e o r e t i c a l g u i d a n c e f o r t h e r e s e a r c ho f t h ed e v e l o p m e n t r e g u l a t i o nm e c h a n i s mo f s m a l l f o l l i c l e o o c y t e s a n d t h e i m p r o v e m e n t o f d e v e l o p m e n t a l c a p a c i t y. K e y w o r d s:m a m m a l s;s m a l l f o l l i c l e s;o o c y t e s;i n v i t r o m a t u r a t i o n家畜卵母细胞随着卵泡长大而生长成熟,获得发育能力,卵母细胞良好的生长成熟是决定雌性生产及繁殖能力的重要指征㊂卵母细胞体外成熟培养(I VM)是利用体外培养体系模拟体内卵母细胞成熟环境,将未成熟的卵母细胞培养至第二次减数分裂中期(MⅡ)的过程㊂卵母细胞体外成熟是研究哺乳动物卵母细胞成熟和胚胎发育的基础,是辅助生殖的关键,是保护和扩繁优良家畜的重要前提㊂进行体外成熟培养的卵母细胞取自卵巢表面卵泡,但卵巢表面大腔卵泡数量非常有限,不能满足科研和临床需求,数量众多的小卵泡作为卵母细胞来源受到更多学者关注㊂但小卵泡卵母细胞的体外成熟质量差,发育能力显著低于大卵泡卵母细胞[1-3]㊂研究者们试图探究小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因及提高小卵泡卵母细胞体外成熟质量的措施,但这些问题仍未被完全阐明,也未见系统的论述㊂因此,作者系统论述哺乳动物小卵泡卵母细胞的利用现状及研究意义,从卵母细胞生长的卵泡微环境方面分析小卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力差的原因,概述提高小卵泡卵母细胞体外成熟质量的措施,为改善哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟培养系统提供新思路,继而提升优良家畜繁殖利用效率,促进胚胎工程技术的发展和应用㊂1哺乳动物小卵泡卵母细胞的利用现状及研究意义哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力显著低于大卵泡卵母细胞㊂研究表明,直径2.5~4.0m m的猪卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力低于4.5~6.0m m卵泡卵母细胞[1];山羊卵巢上直径<3m m卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力低于直径>3m m卵泡卵母细胞[2],且只有来自直径1.5m m以上山羊卵泡的卵母细胞才具有完成减数分裂的能力[4];在牛的研究中发现卵巢上直径<3m m卵泡卵母细胞体外成熟质量及发育能力低于直径>8m m卵泡卵母细胞[3,5]㊂人小卵泡(直径<10m m)卵母细胞体外成熟和发育能力显著低于大卵泡卵母细胞[6]㊂因此,哺乳动物胚胎工程利用的卵母细胞大都取自大卵泡进行体外成熟培养,如在猪上选取卵巢表面卵泡直径3~6m m的卵母细胞[7]㊂哺乳动物卵泡的生长经历原始卵泡㊁初级卵泡㊁次级卵泡㊁三级卵泡和成熟卵泡阶段,随着卵泡生长,卵母细胞生长成熟㊂胎儿期哺乳动物卵巢中存在数百万卵泡,但仅有少数卵泡能够发育成熟并排出成熟卵母细胞,其余大部分小卵泡在不同生长时期发生闭锁或退化㊂胚胎工程技术的研究和推广应用需要大量廉价和高质量的卵母细胞,卵巢表面大卵泡数量有限,因此需要高效利用数量众多的小卵泡㊂探究小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因,提高小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力和利用率,能够充分挖掘优良母畜的繁殖潜能,为动物繁育技术的发展提供理论指导,促进畜牧业健康㊁稳定㊁持续发展;改良卵母细胞体外成熟培养体系,为相关科学研究提供大量廉价的试验材料,促进胚胎工程技术的发展;同时在指导人类辅助生殖小卵泡的利用,减少激素刺激的副作用,提高辅助生殖成功率方面有重要意义㊂2小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因哺乳动物卵母细胞生长成熟依赖卵泡形成的微环境,卵泡外包卵泡膜,生长至有腔卵泡阶段,卵泡内形成卵泡腔,卵泡腔内含卵泡液,卵母细胞外包卵丘细胞位于卵泡腔中,卵丘细胞连接卵泡腔周围的颗粒细胞,卵泡内的卵泡液㊁卵丘细胞和颗粒细胞维持卵母细胞的生长成熟㊂因此,下文从卵母细胞自身生长程度㊁卵泡液成分和含量㊁卵丘及颗粒细胞功能三方面比较大小卵泡的差异,探究小卵泡卵母细胞体外成熟质量差的原因㊂2.1大、小卵泡的卵母细胞物质积累差异卵母细胞随着卵泡长大而生长,染色质逐渐凝集,转录活性逐渐减低,完成胞质物质的积累以获得成熟和发育能力,小鼠染色质凝集型卵母细胞无转录活性[8],直径>3m m猪卵泡中的卵母细胞转录27113期李有为等:哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展逐渐沉默[9-10]㊂转录逐渐沉默过程中,卵母细胞完成转录物的积累,支持后期的成熟和胚胎发育,这是大㊁小卵泡卵母细胞体外发育能力差异的重要因素㊂高通量测序技术为卵母细胞生长成熟机制的研究提供技术支持,利用转录组测序分析不同大小卵泡的牛卵母细胞,发现在卵泡发生过程中重要差异表达基因,如调节转录的转录因子2(T A F2)㊁染色质重塑相关的蛋白磷酸酶1的催化亚基-β同工酶(P P P1C B)㊁能量代谢相关的溶质载体家族25-腺嘌呤核苷酸转运子成员31(S L C25A31),细胞内分子运输相关的N-乙酰葡糖胺-1-磷酸二酯酶(N A G P A)㊁半胱氨酸/组氨酸富含1(C Y H R1)和溶质载体家族39-锌转运子成员12(S L C3A12)[3]㊂来自人类原始卵泡和初级卵泡的卵母细胞在参与调节卵母细胞休眠和激活途径的基因表达上存在差异[11]㊂在小鼠中,染色质凝集的卵母细胞与弥散性染色质构型卵母细胞相比有380个差异表达基因,且大多数基因下调[12]㊂猪卵母细胞转录组数据分析差异表达基因显示,与小卵泡组相比,大卵泡卵母细胞中有60个基因上调,262个基因下调[13]㊂因此,大小卵泡卵母细胞基因表达的差异与卵母细胞成熟和发育能力的获得密切相关,但具体关系及起决定性作用的因子仍需要进一步探究㊂卵母细胞内成熟及发育相关因子的研究尚不充分,仅局限于特定因子的比较和分析㊂卵母细胞成熟促进因子(M P F)介导多种信号调控卵母细胞成熟㊂在猪小卵泡中M P F活性以及参与卵母细胞成熟的细胞周期依赖性激酶1(C D K1)㊁增殖细胞核抗原(P C N A)㊁细胞外信号调节激酶2(E R K2)的表达量显著低于大卵泡卵母细胞[14]㊂卵母细胞中原癌基因丝氨酸/苏氨酸激酶(c-MO S)参与维持减数分裂阻滞并具有调节M P F活性的作用[15-16],猪小卵泡生发泡(G V)期卵母细胞中c-M O S基因转录水平低[17]㊂猪小卵泡卵母细胞中调控卵丘扩展的基因(如骨形态发生蛋白(B M P15)㊁生长分化因子9 (G D F9)㊁透明质酸合成酶2(H A S2)㊁肿瘤坏死因子α诱导蛋白6(T N F I P6)等)表达量低,使卵丘扩展能力不足,同时引起表皮生长因子受体(E G F R)信号通路下调,卵母细胞发育能力低[18]㊂环磷酸腺苷(c AM P)是哺乳动物中保守且普遍存在的第二信使,在卵泡发育及卵母细胞成熟过程中发挥重要作用,卵母细胞减数分裂的阻滞和恢复依赖于c AM P㊂小卵泡卵母细胞c AM P含量低于大卵泡卵母细胞[19],小卵泡卵母细胞对c AM P的感应不如大卵泡,在体外成熟培养过程中添加c AM P 的类似物d i b u t y r y l c AM P(d b-c AM P),培养11h 时大卵泡c AM P含量是小卵泡卵母细胞的3倍[20]㊂卵母细胞旁分泌因子G D F9和B M P15具有调控卵泡生长[21],促进卵丘细胞和颗粒细胞的生长㊁分化,阻止卵丘细胞凋亡,促进卵母细胞成熟㊁排卵㊁受精和胚胎发育的作用[22-23]㊂G D F9和B M P15的表达模式在不同物种之间存在差异,绵羊㊁牛㊁负鼠和仓鼠在原始卵泡卵母细胞中开始表达,而大鼠㊁小鼠和人类在初级卵泡开始表达,发育至次级卵泡开始激增[24-25]㊂猪小卵泡卵母细胞中G D F9水平低于大卵泡卵母细胞,在经过体外成熟培养后大卵泡卵母细胞G D F9表达量仍显著高于小卵泡卵母细胞[26]㊂G D F9基因敲除后,卵泡生长阻滞在初级卵泡阶段,小鼠雌性不育[27],B MP15基因敲除(B MP15-/-)的小鼠生殖能力降低,排卵减少, G D F9+/-和B MP15-/-的小鼠卵泡发生㊁卵丘细胞和受精能力均出现异常[28-29]㊂另外,细胞内谷胱甘肽(G S H)是预测猪卵母细胞细胞质成熟的分子标志物,猪大卵泡卵母细胞内G S H含量显著高于小卵泡卵母细胞[30]㊂卵母细胞内脂滴等代谢物含量㊁表观遗传修饰的差异等都是导致大㊁小卵泡卵母细胞体外成熟发育能力差异的可能原因,需要更为系统的研究和阐述㊂以上研究揭示了大㊁小卵泡卵母细胞转录物㊁活性因子及调控成熟信号等的差异,表明卵母细胞内物质积累对卵泡卵母细胞生长㊁卵母细胞成熟及发育能力的获得㊁生殖的重要性,小卵泡卵母细胞物质积累不足是导致发育能力低的重要原因㊂2.2大、小卵泡的卵泡液成分及含量差异卵泡液是血清的超滤液,是穿过血滤泡屏障的血浆成分转移以及颗粒和卵母细胞分泌活动的产物,卵泡液成分包括激素㊁生长因子㊁活性氧㊁蛋白质㊁肽和氨基酸等㊂卵泡液中含有多种激素,在卵泡及卵母细胞的生长发育过程中起着关键调控作用,大㊁小卵泡内激素含量不同,卵泡对激素水平的感应不同是导致卵母细胞发育能力不同的重要因素之一㊂研究比较不同物种发现小卵泡内促卵泡激素(F S H)含量高[8,19,31],同时小卵泡颗粒细胞高表达促卵泡激素受体(F S H R),促进小卵泡进一步生长[32]㊂F S H能够激活磷脂酰肌醇-3激酶/蛋白激酶B/叉头转录因子O亚族1(P I3K/A k t/F O X O1)信号通路,引起固醇元件结合转录因子2(S R E B P2)上调,促进3-羟3711中国畜牧兽医51卷基-3甲基戊二酸单酰辅酶A还原酶(HMG C R)表达调控卵泡内颗粒细胞合成胆固醇[33-35],F S H还具有增强表皮生长因子(E G F)诱导E G F R酪氨酸磷酸化的作用[36],F S H-E G F R能激活S MA D2/3信号通路,调控卵丘扩展和类固醇生成[37]㊂因此,F S H 在小卵泡中含量高,可促进小卵泡的进一步生长,在大卵泡内F S H主要是促进卵母细胞核成熟㊂抗缪勒氏激素(AMH)的表达仅局限于腔前和小腔卵泡颗粒细胞,通常在小腔前卵泡中出现表达高峰,伴随着腔前卵泡直径的增加,颗粒细胞和卵泡液中AMH水平降低,优势卵泡不再产生AMH[38-39]㊂AMH在调控卵母细胞发育中的作用是增加腔前卵泡中雄烯二酮的含量,抑制颗粒细胞增殖[40-41],另外通过抑制F S H诱导的芳香酶活性共同抑制雌二醇(E2)合成[42],表明AMH对优势卵泡的选择是必需的㊂大卵泡孕酮(P4)和E2含量均高于小卵泡,促黄体生成素受体(L H R)和雌激素,及类固醇合成酶,主要是细胞色素P450酶(芳香化酶和17α羟化酶)表达量高,其作用是为激素应答做准备[30,43]㊂E2可与卵母细胞分泌因子共同作用,通过调控钠肽通路促进卵丘细胞环磷酸鸟苷(c GM P)产生[44-45],高水平c GM P维持减数分裂的阻滞,促进卵母细胞胞质充分成熟㊂卵泡液中重要成分还包括卵母细胞及颗粒细胞分泌的重要生物活性因子,B i j t t e b i e r等[46]利用蛋白组学鉴定猪卵泡液和血清中与卵丘细胞扩展相关的蛋白因子,但因技术的限制仅鉴定了13种差异表达蛋白,精确度也较低㊂因此,仍需利用转录组及蛋白组学等技术系统研究猪卵泡液关键因子及相互作用,揭示卵泡因子之间的互作以及揭示卵母细胞成熟分子调控机制㊂2.3大、小卵泡颗粒细胞和卵丘细胞的差异卵泡生长过程的重要变化包括颗粒细胞数量的增加以及颗粒细胞和卵丘细胞的分化,猪小腔卵母细胞周围的卵丘细胞数量显著低于中等卵泡卵母细胞[47],小卵泡内颗粒细胞和卵丘细胞数量不足,发挥功能受限,必定会影响卵母细胞发育能力㊂卵丘细胞分泌因子包括过氧化氢酶㊁超氧化物歧化酶㊁血管内皮生长因子㊁G S H㊁特异性转录因子和环核苷酸(c AM P㊁c GM P)等,分泌因子在维持氧化稳态,抑制凋亡,调控细胞增殖和凋亡,以及卵母细胞减数分裂恢复中发挥关键作用,能够促进卵母细胞成熟发育[48]㊂常见的颗粒细胞分泌因子包括利钠肽(N P s)㊁类表皮生长因子(E G F-l i k ef a c t o r s)㊁前列腺素(P G E)等[49]㊂其中利钠肽家族成员C-型利钠肽(C N P)由卵泡壁粒细胞分泌,结合卵丘细胞表面的利钠肽受体2(N P R2)[50],诱导c GM P的表达,具有维持卵母细胞减数分裂阻滞的作用[51],利钠肽受体系统对卵巢生长和卵母细胞减数分裂的有序发生起重要作用,决定雌性生殖能力[52-53]㊂直径1~2m m 猪卵泡卵丘细胞内N p r2m R N A水平显著低于直径3~6m m卵泡卵丘细胞[19]㊂促黄体生成素(L H)和F S H作用的重要通路是通过转活化E G F信号通路在调控卵丘细胞增殖分化中发挥作用㊂已经在啮齿类动物[54-56]㊁人[57]㊁灵长类[58]㊁牛[59]和猪[60]颗粒细胞中证实类表皮生长因子的表达,如双调蛋白(A R E G)㊁上皮调节蛋白(E R E G)和β-细胞素(B T C)㊂这些类E G F生长因子以自分泌或旁分泌形式通过E G F R作用于壁颗粒细胞和卵丘颗粒细胞[55-56,60-61],在卵母细胞减数分裂恢复中发挥关键作用㊂E G F及类表皮生长因子能够提高体外成熟卵母细胞成熟率㊁受精和早期胚胎发育能力[8,62]㊂直径<3m m的山羊卵泡卵丘卵母细胞复合体(C O C s)中E G Fm R N A水平低于直径>3m m的卵泡[63],而缺少E G F类生长因子C O C s不会发生扩展[64-65],猪小腔卵泡卵母细胞对E G F类生长因子的反应能力及结合能力低[18,65]㊂P G E2水平的升高是调控卵丘扩展和卵母细胞成熟及排卵的关键㊂抑制P G E2的合成,卵丘细胞扩展㊁卵母细胞成熟和排卵率降低,缺少P G E2或P G E2受体表达的小鼠不能排卵[66-68]㊂利用前列腺素合成抑制剂也能阻断兔㊁奶牛和灵长类动物的排卵,将前列腺素合成抑制剂直接注射到猕猴的优势卵泡中,卵泡则不能应答L H的刺激进而不能排卵,注射抑制剂的同时注射P G E2会恢复排卵[69]㊂综上,大㊁小卵泡卵母细胞㊁卵泡液㊁颗粒与卵丘细胞存在显著差异(图1):①小卵泡内卵母细胞转录活性强;基因表达与大卵泡卵母细胞有差异;c AM P含量低;c-MO S㊁M P F活性低;旁分泌因子G D F9/B M P15少;G S H含量少;②小卵泡卵泡腔内卵泡液含量及成分与大卵泡卵泡液差异显著;F S H㊁AMH含量高;P4㊁E2含量低;③小卵泡内颗粒细胞和卵丘细胞数量少;N P㊁PG E2㊁E G F家族生长因子少;N P R2表达少㊂此外,大㊁小卵泡颗粒细胞㊁卵丘细胞㊁卵泡液以及卵母细胞之间的信息交流,促进支持卵泡和卵母细胞的生长成熟,它们之间47113期李有为等:哺乳动物小卵泡卵母细胞体外成熟的研究进展的相互联系及结合程度不同都可能造成卵母细胞发育能力差异㊂卵泡和卵母细胞生长成熟极其复杂,人们对其认识极其有限,卵泡内生命活动及其调控机制仍需要进一步阐明㊂与大卵泡相比,ʏ表示小卵泡内物质含量多;ˌ表示小卵泡内相应物质含量少C o m p a r e dw i t hl a r g ef o l l i c l e s ,ʏi n d i c a t e da h i gh e rc o n t e n to fs u b s t a n c e si ns m a l lf o l l i c l e s ;ˌi n d i c a t e dl o w c o n t e n to f c o r r e s p o n d i n g s u b s t a n c e s i n s m a l l f o l l i c l e s 图1 哺乳动物大、小卵泡内物质差异F i g .1 D i f f e r e n c e s i n s u b s t a n c e s b e t w e e n l a r ge a n d s m a l lf o l l i c l e s i nm a m m a l s 3 提高小卵泡卵母细胞体外成熟发育能力的措施在体内卵泡环境,卵母细胞长时间停滞在第一次减数分裂前期,一旦置于体外成熟培养环境,卵母细胞很快自发恢复减数分裂,完成核成熟㊂哺乳动物卵泡长至大腔卵泡时期卵母细胞才生长完全,胞质完全成熟,体外成熟培养导致小卵泡卵母细胞在胞质未成熟之前提前恢复减数分裂,使得卵母细胞发育能力低㊂基于上述小腔卵泡卵母细胞发育能力不足的原因分析,体外成熟培养过程中,提高小腔卵泡卵母细胞发育能力的举措主要是在支持生长的培养基中进行前培养或者抑制卵母细胞的核成熟,保证卵母细胞足够的胞质成熟时间,以及卵母细胞与卵丘细胞或颗粒细胞共培养,弥补小腔卵泡卵母细胞生长的不足,以提高小卵泡卵母细胞质量㊂3.1 抑制核成熟提高小卵泡卵母细胞体外成熟发育能力很多研究在卵母细胞体外成熟培养的早期阶段利用抑制剂抑制生发泡破裂(G V B D )的发生,以提高猪卵母细胞胞质的成熟,但对卵母细胞发育能力的提高非常有限㊂抑制核成熟研究最多的是卵母细胞内c AM P -蛋白激酶A (P K A )-M P F 通路的调控,在猪和小鼠卵母细胞成熟过程中使用d b -c AM P ㊁利用抑制剂3-异丁基-1-甲基黄嘌呤(I B M X )㊁西洛酰胺抑制磷酸二酯酶(P D E )进而抑制c AM P 的降解,添加毛喉素(F S K )激活腺苷酸活化酶,这些都能够维持卵母细胞内高水平的c AM P ,抑制细胞核过早发生成熟,提高猪小卵泡(1~2m m )卵母细胞发育能力[70-71]㊂添加C D K 抑制剂r o s c o v i t i n e 抑制M P F 的活化,能显著提高猪[72]㊁山羊[73]㊁水牛[74]小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力㊂相似的,添加b u t yr o l a c t o n eⅠ抑制C D K 1也能够提高牛卵母细胞成熟[75]㊂颗粒细胞产生的C N P 被用作天然的卵母细胞核成熟抑制剂㊂在小鼠㊁山羊㊁猪和牛的研究中证实5711中国畜牧兽医51卷C N P能够抑制卵母细胞减数分裂的恢复,体外成熟培养过程添加C N P可提高小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力[76-78]㊂添加C N P能够维持卵丘细胞间的通讯;诱导卵母细胞染色质结构的改变;增加卵母细胞直径㊁线粒体D N A拷贝数㊁线粒体活性和活性氧水平;降低G S H水平;增加卵丘细胞功能[44,79]㊂另外,在体外延迟减数分裂自发恢复的安全有效方法是培养体系中加入卵泡液或添加卵泡液因子,利用卵泡液成分抑制核成熟,同时支持卵母细胞胞质成熟和核成熟,猪的体外成熟培养体系大都添加卵泡液㊂添加卵泡液因子也是提高卵母细胞体外成熟质量的重要方法,体外培养直径2~4m m猪卵泡卵母细胞添加c AM P㊁B M P15和G D F9的同时添加A R E G可提高卵母细胞体外成熟发育能力[18], B M P15㊁G D F9及E G F㊁胶质细胞衍生神经营养因子(G D N F)的组合均能提高卵母细胞发育能力[64,80-81]㊂除此,在培养恒河猴小卵泡(直径0.5㊁0.5~2.0m m)卵母细胞过程中发现添加人绒毛膜促性腺激素(h C G)[82]㊁A R E G[83]能够提高核成熟㊂3.2成熟前培养提高小卵泡卵母细胞发育能力成熟前培养是利用支持生长的培养基促进卵母细胞进一步生长,包括卵泡的培养和卵母细胞的前培养㊂卵泡培养能够实现早期初级卵泡甚至原始卵泡的生长,进一步完成体外卵母细胞的成熟培养,但成熟率不能达到要求㊁培养体系复杂㊁时间长㊁成本较高,并不适合于服务胚胎工程生产,在这里不做赘述㊂卵母细胞的成熟前培养常用的方法是低浓度的激素,如猪小卵泡卵母细胞在体外成熟的1/250浓度的F S H和L H的生长培养基中培养24h,随后在成熟培养基中培养20h可提高猪卵母细胞发育能力[84]㊂与抑制核成熟相似的是成熟前培养也是给予胞质充分的时间以促进其成熟,所以在前培养过程中一般在调控激素水平的基础上结合使用抑制核成熟因子㊂如在培养的前10h添加F S H㊁E2和I B M X,后10h添加P4㊁F S H㊁E2和I B M X,在随后的22h 培养过程中更换为L H㊁E G F和P4可提高猪小卵泡(3~5m m)卵母细胞发育能力[60]㊂前培养过程添加垂体腺苷酸环化酶激活多肽(P A C A P)刺激细胞产生c AM P,能够提高1~3m m猪卵泡卵母细胞发育能力[85]㊂绵羊小卵泡(2~4m m)卵母细胞添加C N P的培养基进行6h前培养,在添加A R E G和P G E2的培养基培养18h,能够提高卵裂率和囊胚率[49]㊂在临床上,将多囊卵巢综合征患者小卵泡(直径<6m m)添加C N P进行前培养,然后再利用体外成熟培养系统能够显著提高小卵泡卵母细胞成熟率和发育能力[77,86-87],同时避免了激素对患者的副作用㊂在此培养系统基础上添加A R E G则能够进一步提高多囊卵巢综合征患者小卵泡卵母细胞发育能力[88]㊂3.3颗粒细胞及卵丘细胞与卵母细胞共培养提高小卵泡卵母细胞发育能力为弥补小卵泡内颗粒及卵丘细胞数量及所分泌因子不足导致的卵母细胞发育能力降低㊂研究者通过共培养及添加相应分泌因子的方式或者改善培养方式来提高卵母细胞体外成熟的发育能力㊂用3~6m m卵泡卵母细胞颗粒细胞团与1~ 2m m卵泡卵母细胞共培养,能够提高猪小卵泡卵母细胞直径,同时促进卵母细胞的成熟[47]㊂在绵羊中研究发现,如果将来自小卵泡(0.5~1.0m m)的卵母细胞与直径3.0~4.0m m卵泡卵母细胞卵丘细胞共培养,则近48%的小卵泡卵母细胞能够恢复减数分裂并能够发育到MⅡ阶段[89]㊂山羊小卵泡(直径<3m m)卵母细胞与裸卵共培养也能够提高卵裂率和囊胚率[90]㊂这些研究表明,卵泡颗粒细胞㊁卵丘细胞以及卵母细胞自身对卵母细胞成熟和发育能力的获得都是有利的,同时,在共培养的基础上再添加其他因子也能提高卵母细胞体外成熟和发育能力㊂除上述措施外,提高小卵泡卵母细胞体外成熟的发育能力的措施还有很多,包括添加抗氧化㊁抗凋亡㊁增强线粒体功能㊁增强表观遗传修饰㊁促进卵丘扩展㊁自噬等作用的物质㊂褪黑素[91]㊁辅酶Q10[92]㊁血管内皮生长因子[93]能够提高卵母细胞体外成熟的发育能力,特别是质量差的小卵泡卵母细胞㊂亚麻酸能够提高山羊小卵泡(<2m m)卵母细胞减数分裂能力和发育至囊胚的能力[94]㊂培养猪小卵泡(1~3m m)卵母细胞时添加烟酸或烟酰胺,可改善卵母细胞体外成熟和发育能力[95]㊂促进胞质成熟,弥补小卵泡的不足能够部分提高小卵泡卵母细胞发育能力,但并不能达到大卵泡卵母细胞发育成熟的程度,还有很大的提升空间㊂4总结与展望卵母细胞生长成熟是一个异常复杂的生物过程,需要卵母细胞与邻近的颗粒细胞㊁卵丘细胞及卵6711。

哺乳动物卵母细胞体外成熟研究进展生科1202班张文娅201224140212摘要：卵母细胞体外成熟培养已经成为现代胚胎生物技术的重要内容之一，是性别控制、体外受精、核移植和转基因等技术成功前提和关键[1]。

关键字：哺乳动物；卵母细胞哺乳动物卵巢内含有大量的原始卵泡，其数量因物种和发育阶段而不同，如出生小鼠大约为一万个，人和家畜约为几百万个。

到初情期后，小鼠约四千个，牛羊约十万个，猪约四十多万个，但大部分卵泡中途闭锁退化，在一个生殖周期中发生排卵的卵泡只有一个或几个[2]。

所以说，哺乳动物卵巢的开发潜力很大。

1 卵母细胞的获取卵母细胞体外成熟（in vitro maturation,IVM）是指从卵巢中获取未成熟卵，经过适宜的体外培养条件，卵母细胞发育成熟并具有受精和胚胎发育能力。

哺乳动物卵母细胞体外成熟质量对卵母细胞的激活、受精及其后继的胚胎发育均有重要影响[3]。

获取大量的优质卵母细胞是实现卵母细胞体外成熟培养的先决条件，也是胚胎生物技术研究的基础。

1.1 活体采集活体卵母细胞的采集主要有盲采法、内窥镜法和超声波法。

20世纪80年代初，Sirard首次将内窥镜用于牛卵泡卵母细胞的采集，同年Copata也以同样的方法获得成功；荷兰Pieterse等首次利用超声波技术通过子宫壁从活牛卵巢采集到卵母细胞。

盲采法由熟悉操作的人一只手通过操控采卵器进行阴道弯隆穿刺，另一只手直肠内配合引导采卵器并把握卵巢吸取含有卵子的卵泡液进行取卵[4]。

盲采法回收率达65%以上。

内窥镜法是在腹腔镜探头的观察下，通过操作杆和采卵针收集卵母细胞的方法。

内窥镜法对卵母细胞的回收率达40%-80%，超声波法回收率达60%。

盲采法是使用最多的一种方法。

活体采集对操作人员的技术要求比较高。

1.2 离体采集离体采集卵母细胞最大的优势在于取材方便，相比活体采卵技术，显著降低了卵母细胞的获取成本和对操作人员的技术要求，能够满足实验对大批量卵母细胞的需求。

17―β―雌二醇对猪卵母细胞体外成熟及体外受精胚的影响摘要：为了观察17-β-雌二醇对猪卵母细胞体外成熟及体外受精胚的影响，选用屠体卵巢上的卵母细胞为试验材料，将其分为4组，分别在培养基中添加0、25、50、75 μmol/L 17-β-雌二醇，体外成熟培养时间为36～44 h，受精胚培养时间为9 d。

结果表明，在培养基中分别添加17-β-雌二醇0、25、50、75 μmol/L时猪卵母细胞体外成熟率分别为58.5%、67.1%、80.9%、64.5%，卵裂率分别为51.2%、56.5%、63.5%、59.2%，囊胚形成率分别为16.7%、24.2%、19.5%、24.0%。

结果显示在培养基中添加50 μmol/L 17-β-雌二醇可提高猪卵母细胞体外成熟率至80.9%，提高体外受精胚的卵裂率至63.5%，但囊胚形成率以添加量为25 μmol/L的组最高，说明添加17-β-雌二醇可提高猪卵母细胞成熟率、卵裂率以及囊胚率。

关键词：17-β-雌二醇；卵母细胞；体外成熟；体外受精；胚胎培养中图分类号：S828.3 文献标识码：A 文章编号：0439-8114（2015）22-5660-02Abstract：For observing the effect of 17-β-E2 on theporcine oocytes maturation and fertilized embryos’development in vitro，the porcine oocytes collected from prepubertal gilts’ovaries were cultured in maturation medium which added different concentration 17-β-estrodiol （0、25、50、75 μmol/L）for 36～44 hours. The fertilized eggs were cultured for 9 days. The results showed that the maturation rate of each addition was 58.5%，67.1%，80.9%，64.5%，respectively. The cleavage rate was 51.2%，56.5%，63.5%，59.2%，respectively，and the blastocyst rate was 16.7%，24.2%，19.5% and 24.0%，respectively. It indicated that the addition of 17-β-estrodiol could improve maturation rate，cleavage rate and blastocyst rate，and the maturation rate & cleavage rate of 50 μmol/L addition were higher than the other 3 groups，but the blastocyst rate of 25 μmol/L addition was higher than the other groups.Key words：17-β-estrodiol；porcine oocytes；in vitro maturation；in vitro fertilization；embryo culture自Mattiol等[1]用屠体的卵母细胞获试管猪以来，卵母细胞的体外成熟培养已经取得了较大的进展[2]。