王芳融合蛋白的表达与鉴定
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一般微型胶电泳的电压是浓缩胶60‐80v，分离胶100v。
浓缩胶用较小电压的目的使得loading 的样品能够在同一条水 平线上进入分离胶，如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋 白赶上来前进入分离胶。
分离胶，理论上（实际上也是）小电压/长时间分离的效果 会更好，但是在一般操作过程中没有必要等那么长的时，所 以可用大电压快点跑。
d30d%H2储O备胶
3.4ml 0.83ml
1M Tris‐HCl (pH 6.8)
0.63ml
10% SDS
0.05ml
10% AP
0.05ml
混匀上述液体后加5μl 的TEMED
知识点 上样缓冲液各组分的作用
• 2SDS电泳上样缓冲液：
• 1M Tris‐HCl (pH 6.8)2.5ml， • ‐巯基乙醇1.0ml， • SDS 0.6 g， • 甘油2.0ml， • 0.1%溴酚兰1.0ml， • ddH2O 3.5ml。
• 6、TEMED (N,N,N‘,N’‐四甲基乙二胺)
• 7、ddH2O
• 8、2SDS电泳上样缓冲液
• 9、电泳缓冲液/电转缓冲液
• 10、考马斯亮蓝R‐250染液/脱色液
• 11、封闭液/1TBS/抗体/DAB显色液
灌胶模具安装示意
进口模具
国产简易装置
将两块玻璃扳组成的灌胶模具洗净、晾干，按
• 湿转印法（湿转）和半干转印法（半干转）
• 两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和 施加电场的机械装置不同。这两种转印的装置效果均较 好，可根据实验室条件来选择。
• 要点：两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝 胶和膜之间的任何地方存在气泡。气泡阻碍转移并在印 迹膜上产生“秃斑”（即非转移区）。
• 分离胶pH8.8
• 胶的pH升高，Gly的解离度增 大，泳动率上升，又因为它 分子小，故超过所有的蛋白 质分子，紧跟在Cl‐后，形成 了恒定的电场强度，同时由 于胶孔径小，具有分子筛效 应,因此，蛋白质样品在分离 胶中的分离主要取决于它的 分子大小。
不同浓度SDS‐PAGE胶对蛋白的分辨率
SDS‐PAGE过程示意 1. 制胶
思考点
如何使电泳条带漂亮些?
影响跑胶跑的质量，有以下几个因素： 1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。 电压 越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。 2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。 倒胶之 前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，水隔离时，一定要比 较轻地加上去，避免稀释下层的分离胶，使胶不均匀。
• SDS‐PAGE是Western blot的基础。
• SDS是一种阴离子去污剂，带有负电荷和长疏水尾巴，能够断裂分 子内和分子间的氢键，并通过 疏水尾巴与aa的疏水侧链结合;
• SDS‐protein复合物的短轴恒定，长轴与蛋白质分子量的大小成比 例；同时SDS‐protein复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的 电荷量，消除了不同分子间原有电荷差别。
实验提示：B胶调整电泳电压！
补充讲解: 制胶（~20min）
• 仪器设备：电泳仪、垂直板电泳槽、电转芯
试剂清点
• 1、30%丙烯酰胺储备胶溶液
• 2、1.5M Tris‐HCl(pH 8.8)
• 3、1M Tris‐HCl(pH 6.8)
• 4、10% SDS • 5、10%过硫酸铵（AP）
50mL离心管
• SDS‐PAGE电泳的基本原理与操作 • Western blot的基本原理与操作 • Western blot常见问题及对策
PAGE胶
• PAGE胶基本原理：单体丙烯酰胺(Acr)在过硫酸铵与 TEMED(N,N,N’N’-四甲基乙二胺)的催化下聚合成长链，当有 交联剂N,N’-亚甲双丙烯酰胺(bis)参与聚合反应时，长链与 长链之间就交联形成凝胶。
B胶 for Werstern 各上10ul，用预染marker
A胶 for 染色
各上20ul，用普通marker
注意：先B后A，顺序一样。A胶上午11点左右上样电泳（B胶完成电转 后）
上样步骤
• 12000rpm，离心样品1min • 装配电泳槽，玻璃板凹面向内，夹紧。 • 加800ml左右甘氨酸电泳缓冲液到电泳槽，使内槽液
• 10 Marker
• 步骤：
• 2xloading buffer 放在室温融化 • 准备沸水浴 • 各取50ul样品加入50ul的 2xloading buffer，混匀煮沸5min以上
上样顺序
由左至右依次加入离心后样品上清：
• 蛋白marker • 诱导前菌体总蛋白 • 诱导后菌体总蛋白 • 菌液裂解后上清 • 流出液 • 洗涤液1、2、3 • 纯化蛋白
融合蛋白的表达与鉴定 ‐ Western blot
B胶实验1：样品制备（~20min）
• 依次制备并变性9个样品：
• 1 诱导前菌体总蛋白 • 2 诱导后菌体总蛋白 • 3 菌液裂解后上清 • 4 菌液沉淀 • 5 流出液 • 6 洗涤液1 • 7 洗涤液2 • 8 洗脱液1(纯化蛋白) • 9 洗脱液2(纯化蛋白)
• 原理：
• 缓冲液中含有在电泳中能以可预知速率向阳极泳动的染 料，使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利；
• 甘油还能够增大样品密度，以确保样品均匀进入样品孔 内；
• SDS使蛋白变性并带上负电荷； • -巯基乙醇还原蛋白。
知识点
凝胶电泳缓冲液
最常见的凝胶电泳缓冲液由Tris‐甘氨酸组成。缓冲液可以包含 0.1%去污剂，通常是SDS。
• 凝胶三维结构的孔洞大小取决于凝胶的总浓度和单体与交 联剂的比例。当蛋白分子进入凝胶，在电场下进行泳动 时，可根据各自迁移率的不同（与分子量大小、电荷数或 构像有关）而得以分离。
通常使用 Acr : bis = 29 : 1
SDS‐PAGE电泳
• 在PAGE中最常用的十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰 氨凝胶电泳，简称SDS‐PAGE。
• 加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢 出，更不要让样品溢入另一个加样孔。如果发生，应该小 心冲洗污染的加样孔。
B胶实验2：电泳 （~10min）
• 检查液平面高度 • 检查电极方向
• 电泳参数：恒压模式
• 电压先低后高 上层胶： 80V
•
下层胶： 140V
• 时间 ： 约1小时 随时观察泳动情况,调整电泳 参数,及时中止（目标蛋白约72KD）。
Tris‐甘氨酸凝胶可用于分离很宽分子量范围（6‐200KD）的蛋 白质，并可与变性或非变性条件相容。
Tris‐tricine（三羟甲基甘氨酸）最适于分离小分子蛋白质 （<10KD）,加样之前还需要还原变性。
Tris‐乙酸缓冲液有时被用来分离大分子蛋白。
思考点
为什么通常电泳时浓缩胶和分离胶 的电压不一致？
图安装好（其中一块上口带有凹槽，另一块内面 两侧粘有凝胶板隔离胶条，胶条厚度为0.5mm、 0.75mm、1.0mm，按所需凝胶厚度选择）。
实验1：制备下层胶/分离胶
• 安装好胶板
• 配胶、灌胶 • 胶凝固
10%分离胶配方：10ml
ddH2O 30%储备胶
4.0ml 3.3ml
1.5M Tris‐HCl (pH 8.8) 2.5ml
2. 上样
3. 电泳
SDS‐PAGE 小结
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)是利用聚丙烯酰 胺凝胶作为支持物的电泳法，聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙稀酰胺和交联剂甲叉双丙稀酰胺交 联而成的多孔网状凝胶。 SDS‐PAGE是将SDS处理过的蛋白样品进行 PAGE。 PAGE分辨率很高。 不连续PAGE分为浓缩胶和分离胶。。
相对节约、稳妥的方案：两块平行胶
一块染色观察蛋白量， 一块 western免疫印记
最少6小时：电泳1小时， 转移1小时，
block半小时，1抗1小时，洗半小时，2 抗1小时，洗半小时，显色10分钟。
Western blot 四大步骤
印迹与免疫标记 最关键
知识点
蛋白质转印至膜上的方法
•简单扩散：将膜放在凝胶上，同时放一沓干滤纸在膜 上，并在滤纸上放置重物以加快扩散过程。扩散法的主 要缺点是不能定量转移，与电转比较只能转移25‐50%的 蛋白质。
知识点
通用的转移单位示意图
各种转移方法原理相似，都是将膜与胶放在中间，上下加
滤纸数层，做成“Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电 的蛋白质向阳极转移，即膜侧连接阳极或面向阳极。
－阴极
＋阳极
知识点 蛋白的转移过程示意图
转 移 前 － －
转 移 后
知识点
湿转印法（湿 转）
•
湿转印法，即将凝胶‐膜夹层组合完全浸入转印缓冲
面高于加样孔。 • 小心拔去梳子 • 整理样品孔，吹吸样品孔，排出杂质 • 依次加样，更换枪头
上样注意事项
• 上样前应离心蛋白样品，上样量总体积不能超过孔径的容 量（根据梳子）。
• 拔梳子要轻柔，保持加样孔端正并防止加样孔的凝胶隔条 断裂。
• 用吸管反复吹吸加样孔中的液体以去处未聚合的丙稀酰 胺。
10% SDS
0.1ml
10% AP
0.1ml
混匀上述液体后加8μl 的TEMED
灌胶结束 后，加水液
封！
制备分离胶注意事项
• 操作时要使两玻璃对齐，左、右、底三边无间 隙，尤其注意底边平齐，以免漏胶。
• 未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒 性，可通过皮肤和呼吸道吸收，要带手套并小心 操作。
液中。
•
湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然
后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲
液且只能用一种缓冲液。湿转系统转移过程中需保持低
温。
浓缩胶用较小电压的目的使得loading 的样品能够在同一条水 平线上进入分离胶，如果电压太大前端的蛋白容易在后面的蛋 白赶上来前进入分离胶。
分离胶，理论上（实际上也是）小电压/长时间分离的效果 会更好，但是在一般操作过程中没有必要等那么长的时，所 以可用大电压快点跑。
d30d%H2储O备胶
3.4ml 0.83ml
1M Tris‐HCl (pH 6.8)
0.63ml
10% SDS
0.05ml
10% AP
0.05ml
混匀上述液体后加5μl 的TEMED
知识点 上样缓冲液各组分的作用
• 2SDS电泳上样缓冲液：
• 1M Tris‐HCl (pH 6.8)2.5ml， • ‐巯基乙醇1.0ml， • SDS 0.6 g， • 甘油2.0ml， • 0.1%溴酚兰1.0ml， • ddH2O 3.5ml。
• 6、TEMED (N,N,N‘,N’‐四甲基乙二胺)
• 7、ddH2O
• 8、2SDS电泳上样缓冲液
• 9、电泳缓冲液/电转缓冲液
• 10、考马斯亮蓝R‐250染液/脱色液
• 11、封闭液/1TBS/抗体/DAB显色液
灌胶模具安装示意
进口模具
国产简易装置
将两块玻璃扳组成的灌胶模具洗净、晾干，按
• 湿转印法（湿转）和半干转印法（半干转）
• 两者的原理完全相同，只是用于固定胶/膜叠层和 施加电场的机械装置不同。这两种转印的装置效果均较 好，可根据实验室条件来选择。
• 要点：两种转移系统中都必须注意防止在滤纸、凝 胶和膜之间的任何地方存在气泡。气泡阻碍转移并在印 迹膜上产生“秃斑”（即非转移区）。
• 分离胶pH8.8
• 胶的pH升高，Gly的解离度增 大，泳动率上升，又因为它 分子小，故超过所有的蛋白 质分子，紧跟在Cl‐后，形成 了恒定的电场强度，同时由 于胶孔径小，具有分子筛效 应,因此，蛋白质样品在分离 胶中的分离主要取决于它的 分子大小。
不同浓度SDS‐PAGE胶对蛋白的分辨率
SDS‐PAGE过程示意 1. 制胶
思考点
如何使电泳条带漂亮些?
影响跑胶跑的质量，有以下几个因素： 1、电压，小的电压会使胶的分子筛效应得到充分发挥。 电压 越小，条带越漂亮，浓缩胶80v，分离胶100v就能跑得很好。 2、胶的均匀度，胶越均匀，条带越窄，分离越均匀。 倒胶之 前，一定要充分混匀，玻璃板一定要干净，水隔离时，一定要比 较轻地加上去，避免稀释下层的分离胶，使胶不均匀。
• SDS‐PAGE是Western blot的基础。
• SDS是一种阴离子去污剂，带有负电荷和长疏水尾巴，能够断裂分 子内和分子间的氢键，并通过 疏水尾巴与aa的疏水侧链结合;
• SDS‐protein复合物的短轴恒定，长轴与蛋白质分子量的大小成比 例；同时SDS‐protein复合物所带的负电荷大大超过了蛋白质原有的 电荷量，消除了不同分子间原有电荷差别。
实验提示：B胶调整电泳电压！
补充讲解: 制胶（~20min）
• 仪器设备：电泳仪、垂直板电泳槽、电转芯
试剂清点
• 1、30%丙烯酰胺储备胶溶液
• 2、1.5M Tris‐HCl(pH 8.8)
• 3、1M Tris‐HCl(pH 6.8)
• 4、10% SDS • 5、10%过硫酸铵（AP）
50mL离心管
• SDS‐PAGE电泳的基本原理与操作 • Western blot的基本原理与操作 • Western blot常见问题及对策
PAGE胶
• PAGE胶基本原理：单体丙烯酰胺(Acr)在过硫酸铵与 TEMED(N,N,N’N’-四甲基乙二胺)的催化下聚合成长链，当有 交联剂N,N’-亚甲双丙烯酰胺(bis)参与聚合反应时，长链与 长链之间就交联形成凝胶。
B胶 for Werstern 各上10ul，用预染marker
A胶 for 染色
各上20ul，用普通marker
注意：先B后A，顺序一样。A胶上午11点左右上样电泳（B胶完成电转 后）
上样步骤
• 12000rpm，离心样品1min • 装配电泳槽，玻璃板凹面向内，夹紧。 • 加800ml左右甘氨酸电泳缓冲液到电泳槽，使内槽液
• 10 Marker
• 步骤：
• 2xloading buffer 放在室温融化 • 准备沸水浴 • 各取50ul样品加入50ul的 2xloading buffer，混匀煮沸5min以上
上样顺序
由左至右依次加入离心后样品上清：
• 蛋白marker • 诱导前菌体总蛋白 • 诱导后菌体总蛋白 • 菌液裂解后上清 • 流出液 • 洗涤液1、2、3 • 纯化蛋白
融合蛋白的表达与鉴定 ‐ Western blot
B胶实验1：样品制备（~20min）
• 依次制备并变性9个样品：
• 1 诱导前菌体总蛋白 • 2 诱导后菌体总蛋白 • 3 菌液裂解后上清 • 4 菌液沉淀 • 5 流出液 • 6 洗涤液1 • 7 洗涤液2 • 8 洗脱液1(纯化蛋白) • 9 洗脱液2(纯化蛋白)
• 原理：
• 缓冲液中含有在电泳中能以可预知速率向阳极泳动的染 料，使样品呈现颜色，从而使加样操作更为便利；
• 甘油还能够增大样品密度，以确保样品均匀进入样品孔 内；
• SDS使蛋白变性并带上负电荷； • -巯基乙醇还原蛋白。
知识点
凝胶电泳缓冲液
最常见的凝胶电泳缓冲液由Tris‐甘氨酸组成。缓冲液可以包含 0.1%去污剂，通常是SDS。
• 凝胶三维结构的孔洞大小取决于凝胶的总浓度和单体与交 联剂的比例。当蛋白分子进入凝胶，在电场下进行泳动 时，可根据各自迁移率的不同（与分子量大小、电荷数或 构像有关）而得以分离。
通常使用 Acr : bis = 29 : 1
SDS‐PAGE电泳
• 在PAGE中最常用的十二烷基硫酸钠－聚丙烯酰 氨凝胶电泳，简称SDS‐PAGE。
• 加样太快可使样品冲出加样孔，若有气泡也可能使样品溢 出，更不要让样品溢入另一个加样孔。如果发生，应该小 心冲洗污染的加样孔。
B胶实验2：电泳 （~10min）
• 检查液平面高度 • 检查电极方向
• 电泳参数：恒压模式
• 电压先低后高 上层胶： 80V
•
下层胶： 140V
• 时间 ： 约1小时 随时观察泳动情况,调整电泳 参数,及时中止（目标蛋白约72KD）。
Tris‐甘氨酸凝胶可用于分离很宽分子量范围（6‐200KD）的蛋 白质，并可与变性或非变性条件相容。
Tris‐tricine（三羟甲基甘氨酸）最适于分离小分子蛋白质 （<10KD）,加样之前还需要还原变性。
Tris‐乙酸缓冲液有时被用来分离大分子蛋白。
思考点
为什么通常电泳时浓缩胶和分离胶 的电压不一致？
图安装好（其中一块上口带有凹槽，另一块内面 两侧粘有凝胶板隔离胶条，胶条厚度为0.5mm、 0.75mm、1.0mm，按所需凝胶厚度选择）。
实验1：制备下层胶/分离胶
• 安装好胶板
• 配胶、灌胶 • 胶凝固
10%分离胶配方：10ml
ddH2O 30%储备胶
4.0ml 3.3ml
1.5M Tris‐HCl (pH 8.8) 2.5ml
2. 上样
3. 电泳
SDS‐PAGE 小结
聚丙烯酰胺凝胶电泳（PAGE)是利用聚丙烯酰 胺凝胶作为支持物的电泳法，聚丙烯酰胺凝胶 是由单体丙稀酰胺和交联剂甲叉双丙稀酰胺交 联而成的多孔网状凝胶。 SDS‐PAGE是将SDS处理过的蛋白样品进行 PAGE。 PAGE分辨率很高。 不连续PAGE分为浓缩胶和分离胶。。
相对节约、稳妥的方案：两块平行胶
一块染色观察蛋白量， 一块 western免疫印记
最少6小时：电泳1小时， 转移1小时，
block半小时，1抗1小时，洗半小时，2 抗1小时，洗半小时，显色10分钟。
Western blot 四大步骤
印迹与免疫标记 最关键
知识点
蛋白质转印至膜上的方法
•简单扩散：将膜放在凝胶上，同时放一沓干滤纸在膜 上，并在滤纸上放置重物以加快扩散过程。扩散法的主 要缺点是不能定量转移，与电转比较只能转移25‐50%的 蛋白质。
知识点
通用的转移单位示意图
各种转移方法原理相似，都是将膜与胶放在中间，上下加
滤纸数层，做成“Sandwich”样的转移单位，并且保证带负电 的蛋白质向阳极转移，即膜侧连接阳极或面向阳极。
－阴极
＋阳极
知识点 蛋白的转移过程示意图
转 移 前 － －
转 移 后
知识点
湿转印法（湿 转）
•
湿转印法，即将凝胶‐膜夹层组合完全浸入转印缓冲
面高于加样孔。 • 小心拔去梳子 • 整理样品孔，吹吸样品孔，排出杂质 • 依次加样，更换枪头
上样注意事项
• 上样前应离心蛋白样品，上样量总体积不能超过孔径的容 量（根据梳子）。
• 拔梳子要轻柔，保持加样孔端正并防止加样孔的凝胶隔条 断裂。
• 用吸管反复吹吸加样孔中的液体以去处未聚合的丙稀酰 胺。
10% SDS
0.1ml
10% AP
0.1ml
混匀上述液体后加8μl 的TEMED
灌胶结束 后，加水液
封！
制备分离胶注意事项
• 操作时要使两玻璃对齐，左、右、底三边无间 隙，尤其注意底边平齐，以免漏胶。
• 未聚合的丙烯酰胺和亚甲双丙烯酰胺具有神经毒 性，可通过皮肤和呼吸道吸收，要带手套并小心 操作。
液中。
•
湿转是一种传统方法，将胶/膜叠层浸入缓冲液槽然
后加电压。这是一种有效方法但比较慢，需要大体积缓冲
液且只能用一种缓冲液。湿转系统转移过程中需保持低
温。
