酶工程

7. 辅助因子： 1) 辅酶物质：较复杂的有机分子；与酶蛋白分子间有一定比例；不可相互替代（辅酶辅基） 2) 活化剂：简单无机离子；无严格比例关系；相似离子可相互替代。 8. R 酶的分类 天然 RNA 型酶 分子内催化的 R 酶 自我剪切酶；自我剪接酶（I 型 IVS 的 R 酶；II 型 IVS 的 R 酶） 分子间催化的 R 酶 作用于其他 RNA 分子；作用于 DNA；作用于多糖；最用于氨基酸酯 寡核酸引导的人工内切核酸酶：杂交酶（寡核苷酸链+断裂因子） 第二章 1. 酶的生产方法：提取法、生物合成法、化学合成法 2. 提高酶产量的方法 1） 条件控制：添加诱导物；降低阻遏物浓度 2） 遗传控制：基因突变；体内基因重组；体外基因重组 3） 其他：添加表面活性剂；添加产酶促进剂 3. 固定化细胞： 定义：固定化活细胞或固定化增殖细胞，指用各种方法固定在载体上又能进行生长、繁殖和 新陈代谢的细胞。 产酶特点： ①提高酶产率 ②可在高稀释率条件下连续发酵 ③发酵稳定性好 ④缩短发酵周期，提高设备利用率 ⑤产品易分离纯化 工艺条件控制：①固定化细胞的预培养 ②溶解氧的供给 ③温度的控制 ④培养基成分的控制 4. 微生物发酵法用于酶的生产的优点： 1） 种类繁多，凡是动植物体内有的酶几乎都能从微生物中找到。 2） 繁殖快，发酵周期短，培养简单，能通过控制培养条件大幅度提高酶的产量。 3） 微生物具有较强的适应能力，可采用各种遗传变异手段培育出新的，更理想的菌株。 5. 植物细胞培养用于酶的生产，应控制的工艺条件： 1） 培养基： ①大量无机盐 ②多种维生素和植物激素 ③一般要求无机氮源 ④一般以蔗糖为碳源 2） 温度与 pH： ①温度一般控制在室温范围 ②pH 一般在微酸性范围 3） 通风与搅拌： ①供给溶解氧，还可使细胞分散 ②需氧量不多，对剪切力敏感，故不可太强烈 4） 光照的控制： 根据细胞特性及目标次级代谢产物的不同进行光照调控。 5） 前提的添加： 可提高次级代谢物的产量。 6） 刺激剂的应用： 可强化次级代谢物的生物合成。 6. 酶的剂型 1） 液体酶制剂：包括稀酶液、浓缩酶液，较为经济，但不稳定，且成分复杂。 2） 固体酶制剂：经浓缩干燥或喷雾干燥制得，有的有淀粉等填充料，便于运输与短期保存 3） 纯酶制剂：包括结晶酶在内，有较高的纯度，通常用作分析试剂或医疗药物。 4） 固定化酶制剂：利于保存和应用的剂型。 7. 酶的稳定性与保存 1) 影响酶稳定性的因素：温度、pH 与缓冲液、酶蛋白浓度、氧 2) 稳定酶的方法：添加底物、抑制剂或辅酶；添加巯基保护剂； 无机离子；表面活性剂；血清蛋白；丙酮、乙醇；甲苯、甲苯酸。
第四章 1. 固定化酶的方法： 1） 吸附法：通过载体表面和酶分子表面见的次级键相互作用而达到固定目的的方法。 ①物理吸附法：通过氢键、疏水键等物理作用力将酶固定于不溶性载体上。 无机吸附剂、有机吸附剂 ②离子交换吸附：在适宜的 pH 和离子强度条件下，利用酶的侧链解离基团和离 子交换基间的相互作用而达到酶的固定化的方法。 优：操作简便，条件温和，吸附剂可反复使用； 缺：酶和载体吸附力较弱，易解吸脱落。 操作方法：静态法、电沉积法、动力学批量式固定化法、反应器装载法。
第三章 1. 酶分子的改造方法： 1） 金属离子置换修饰：通过改变酶分子中所含金属离子，使酶的特性和功能发生改变。 常用的是 Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+、Co2+、Cu2+、Fe2+等。 只适用于本来在结构中含有金属离子的酶。 方法：酶液→加入 EDTA→透析或超滤→加入不同的金属离子。 作用： ①阐明金属离子对酶催化作用的影响 ②提高酶活力 ③增强酶的稳定性 ④改变酶的动力学特性 2） 大分子结合修饰： 利用水溶性大分子与酶结合，使酶的空间结构发生精细的改变， 从而改变酶的特定于功能。 常用：右旋糖酐、聚乙二醇、肝素、蔗糖聚合物、聚氨基酸等，前体 需活化。 作用：①提高酶活力 ②抵消或消除抗原性 3） 肽链有限水解修饰： 在肽链的限定位点进行水解，使酶的空间结构发生精细的改变。 常用专一性较强的蛋白酶或肽酶。 作用：①提高酶活力 ②抵消或消除抗原性 4） 酶蛋白侧链基团修饰： 用小分子化合物对酶蛋白侧链基团进行修饰，引起副键的改变 常用氨基、羧基、胍基、巯基、酚基修饰剂、分子内交联剂 作用：①提高酶活力 ②提高稳定性 ③改变特性与功能 5） 变性诱导构象重建：在酶的高级结构上进行调整，特定条件下复性，酶折叠成所需的特 殊结构，产生新的形状。 6） 物理修饰： 通过物理方法， 使酶分子的空间结构发生某些改变。 不改变酶的组分、 基团、 共价键，副键发生某些变化、重排。 7） 蛋白质工程： 2. 模拟酶：根据酶的作用原理，模拟酶的活性中心和催化机制，用化学合成方法制成高效、高选择 性、结构较简单、稳定性较高的新型催化剂，也成酶的合成类似物。 分类：主-客体模拟酶；胶束酶；肽酶；半合成酶；抗体酶；分子印迹酶 3. 抗体酶：催化抗体，本质是一类具有催化能力的免疫球蛋白，其可变区赋予了酶的属性，是抗体 的高度选择性和酶的高效催化能力巧妙结合的产物。 4. 分子印迹技术： 定义：制备对某一化合物具有选择性聚合物（MIP）的过程，该化合物称为印记分子（P）或 模板分子（T） 。 过程：①选定印记分子和功能单体，使二者发生互补反应； ②在印记分子-单体复合物周围发生聚合反应； ③用抽提法从聚合物中除掉印记分子。 形成的聚合物内保留与印记分子形状、大小完全相同的孔穴。
5. 酶活力：一定条件下，酶所催化的反应速度（单位时间内底物的减少量或产物的增加量） 酶活力单位： UI （常用单位） ： 特定条件下， 每 1min 催化 1μmol 底物转化为产物的酶量为 1UI。 Kat（国际单位） ：特定体系下，反应速度为每秒转化 1mol 底物所需的酶量。 1IU=16.67nkat 比活力：特定条件下，每 1mg 蛋白酶所具有的酶活力单位数。 酶活的测定： 1）取样法：在一定时间间隔内，从反映系统中取出一定量的反应液，并采用适当的方法求得 底物或产物的变化量，具体可用化学法、放射化学法等。 2） 连续法： 在反应过程中对反应系统进行底物或产物变化的直接、 连续观测， 常用光学法 （光 吸收法、荧光法） 、电化学测定法（离子电极法、氧电极法、电位测定法） 、酶偶 联分析法等。 6. 酶蛋白的组成：大部分为复合蛋白质，称为全酶（酶蛋白+辅因子） 1） 单体酶：仅有一个活性部位的多肽链构成的酶 2） 寡聚酶： 由若干相同或不同亚基结合而组成的酶， 亚基一般无活性， 相互结合后有活性。 3） 多酶复合体：多种酶进行连续反应的体系，前一个反应物一般为后一反应的底物。
第一章 1. 酶活性的调节方式 1) 酶浓度的调节：诱导或抑制酶的合成（β-半乳糖苷酶） ；调节酶的降解 2) 激素调节：也和生物合成有关，但调节方式有所不同（乳糖合成酶修饰亚基） 3) 共价修饰调节：调节方式本身通过酶催化进行（磷酸化酶的磷酸化/去磷酸化） 4) 限制性蛋白水解作用与酶活力调控：新生肽以无活性前体形式存在，生理需要时通过限 制性水解作用激活（酶原激活、血液凝固、补体激活） 5) 抑制剂的调节（胰脏的胰蛋白酶抑制剂） 6) 反馈调节：小分子物质抑制其生物合成途径中催化第一步反应的酶的活性。 7) 金属离子、其它小化合物：许多酶需 K+、Na+、Ca2+、Zn2+、Mg2+、Mn2+活化；ATP 2. 酶是生物催化剂 所有酶都由生物体产生（已知的酶都是由生物体合成的；几乎所有生物都能合成酶） 3. 专一性：指一种酶只能催化一种或一类结构相似的底物进行某种类型的反应。 绝对专一性： 一种酶只能催化一种物质进行一种反应 乳酸脱氢酶 丙酮酸→L-乳酸 D-乳酸脱氢酶 丙酮酸→D-乳酸 相对专一性： 一种酶能够催化一类结构相似的物质进行某种相同类型的反应 醇脱氢酶 伯醇/仲醇→醛/酮 4. 酶的分类 分类 1 2 3 4 5 6 名称 氧化还原酶 转移酶 水解酶 裂合酶 异构酶 合成酶 电子的转移 转移功能基团 水解反应 键的断裂 分子内基团的转移 键形成 反应催化的类型 实例 醇脱氢酶 已糖激酶 胰蛋白酶 醛缩酶 葡萄糖异构酶 丙酮酸羧化酶
第六章 1. 酶反应器： 定义：以酶作为催化剂进行反应所需的设备，主要指游离酶、固定化酶、固定化细胞的催化 反应的容器。 分类：
罐型 几何形状和结构管型 膜或片型 分批 进料和出料方式半分批 连续 膜反应器 功能结构液固反应器 气液固三相反应器
2. 各种酶反应器及其特点、优缺点 1) 分批搅拌罐式反应器（STR） 优：结构简单，不需要特殊生产设备，适于小规模生产。 缺：酶无法回收。 2) 超滤膜酶反应器： 优：酶可重复利用，适用于价格较高的酶。 可用于胶态或不溶性底物，特别适用于有产物抑制的场合。 缺：酶的长期操作稳定性差，且酶易在膜上吸附损失，或发生浓度极化。 3) 间歇式搅拌罐反应器（BSTR） 连续流动搅拌反应器（CSTR） 优： 内容物混合充分均匀， 结构简单， 温度及 pH 以控制， 适用于受底物抑制的反应， 传质阻力较低，能处理胶体状底物与不溶性底物，固定化酶易更换。 缺：反应效率较低，载体易受剪切力而破坏，动力消耗哒，BSTR 在用离心或过滤法 回收固定化酶的过程中易造成酶的失效损失。 4) 填充床反应器（PBR） ，属于活塞流反应器（PFR） 优： 单位体积催化剂负荷量大， 反应效率高， 由于产物浓度沿反应器的长度逐渐增高， 故与 CSTR 相比，可减少产物的抑制作用。 缺：温度与 pH 难以控制，产物和底物会产生轴向浓度分布，清洗和更换固定化酶较 麻烦。床内有自压缩倾向，易堵塞，且床内压力降相当大，底物必须加压输入。 5) 流化床反应器（FBR） 优：良好传质、传热性能。pH、温度控制及气体供给比较容易；不易堵塞，可适用 于处理粘度较高的液体；能处理粉末状底物；即使细小颗粒的固定化酶，压力降 也不会很高。 缺：需保持一定流速，运转成本高，难于放大；由于颗粒酶处于流动状态，易导致离 子的机械破损；由于流化床的空隙体积大，酶的浓度不高；由于底物高速流动使 酶冲出降低了转化率。 6) 膜型反应器 优：压力较小，放大容易； 缺：比表面积小。 7) 空心酶管反应器 8) 转型固定化酶反应器 9) 中空纤维膜反应器 10) 鼓泡塔形反应器 3. 选择酶反应器的考虑因素： 1） 酶的形状、大小、机械强度 ①形状：粒状：搅拌罐、固定床、流化床、鼓泡塔；膜状：膜反应器 ②大小：颗粒细小：不宜采用固定床反应器，应采用流化床