酶与酶工程

1.酶
1.1酶的基本概念
酶的化学本质是蛋白质，这一点是被生物化学所证明了的，研究酶的化学本质，可用研究蛋白质的方法进行研究。

一般情况下，一个结构完整的酶包括蛋白质和非蛋白质两部分，蛋白质部分称为辅基酶蛋白，非蛋白质部分称为辅助因子，辅基酶蛋白和辅助因子构成一个全酶。

辅助因子的化学本质因不同的酶而不同，它可以是小分子量的有机化合物，也可以是无机矿物质离子。

酶是一种生物催化剂，在催化活性上与无机催化剂类似，酶在催化反应时，其本身不发生化学改变，只是催化反应的进行，此外，酶在催化反应时，仅改变反应速度，并不改变反应的平衡。

酶催化反应的动力学机理是降低反应的活化能。

酶作为生物催化剂，其催化反应的专一性远远超过无机催化剂，根据酶的专一化程度，可分为绝对专一性和相对专一性。

绝对专一性：是指一种酶只能催化一种底物进行一种反应，底物的分子结构、空间构型及构象的不同都表现出专一性。

相对专一性：是指一种能够催化一类结构相似的物质进行相同类型的反应，主要是对某一化学键的专一性。

例如，胰蛋白酶(Trypsin EC 3.4.31.4)催化含有赖氨酸或精氨酸羰基的肽键的水解反应，凡是具有含赖氨酸或精氨酸羰基酰胺键的底物都能被此酶催化水解。

1.2酶的结构和功能
构成酶活性中心的氨基酸在一级结构上，呈分散状态，这些氨基酸是通过酶蛋白的二、三、四级结构使得其在空间上彼此集中，构成一个特定的与酶活性表达有关区域，这个特定区域即酶的活性中心(active center)，换句话说，酶的活性中心是酶分子上的与底物结合并催化反应的特定基团或特定区域。

酶活性中心包括两部分，其一是底物结合部位，其二是催化部位。

必需基团参与构成酶的活性中心和维持酶的特定构象。

必需基团是指酶分子中某些基团若经化学修饰后（氧化、烷化、酰化、还原等）使其结构改变，则酶分子丧失活性。

活性部位的基团都是必需基团，必需基团包括活性中心基团和其外的对维持酶活性空间构象所必需的一些基团。

例如，溶菌酶由129个氨基酸构成，而构成活性中心的氨基酸有：Glu35，Asp52，Try62，Asp101(Gly101)。

溶菌酶的内部几乎全部是非极性的(nonpolar) 。

疏水的相互作用在溶菌酶的折叠构象中起重要作用。

在溶菌酶分子的表面，有一个比较深的裂缝，其大小恰好能容纳多糖底物的6个单糖，这是溶菌酶的活性部位。

1.3酶催化专一性基本学
1.3.1说锁钥学说(lock and key theory)
1894年，E.Fisher提出酶与底物作用的锁钥学说，以解释酶与底物之间的专一性问题，其基本含义是：酶与底物分子或底物分子的一部分之间，在结构上有严格的互补对应关系，当底物与酶结合时就像钥匙和锁那样契合对应。

1.3.2诱导契合学说(induced-fit hypothesis)
1958年，Koshland提出了诱导契合学说，其主要内涵是：当酶与底物分子接近时，酶蛋白受底物分子的诱导，其构象发生有利于与底物分子结合或催化的变化，酶与底物在此基础上互补契合，以发挥酶的催化功能。

1.4辅助因子
辅助因子是酶组成中非蛋白的部分。

其主要作用是：参与构成酶的活性中心，作为电子、原子或某些基团的载体参与反应并促进整个催化过程；空间构象的形成和稳定；加快催化过程的速度等。

辅助因子与酶蛋白的关系：一种酶蛋白只能与一种辅助因子结合，才能表现为有活性的全酶；一种辅助因子可以与不同的酶蛋白结合，组成不同专一性的全酶，催化不同底物的相同类型的反应。

例如，琥珀酸脱氢酶＋FAD；乳酸脱氢酶+NAD；乙醇脱氢酶＋NAD。

2.酶工程（Enzyme Engineering）
酶工程是酶学研究与其应用工程结合形成的一门新的技术领域；是酶学、微生物学的基本原理与化学工程技术有机结合、相互渗透形成的交叉性学科。

包括上游工程和下游工程。

前者包括酶的产生和酶制剂制备；后者主要包括酶固定化技术、酶修饰技术和生物反应器。

2.1酶工程的发展历程
酶工程研究的奠基：以工业化酶制剂生产为主要内容的酶工程雏形阶段（50年代）；
酶固定化技术和细胞固定化技术研究始于60年代；
70年代基因工程崛起，将酶工程技术研究引向深入并赋予了新的内涵；
1971年第一次国际酶工程会议的召开，标志了酶工程学科和完善的技术体系的形成；
80年代实现了克隆酶的突破（Wager将青霉素酰化酶基因克隆到Ecoli菌株质粒上，获得了高效表达）；
80年代形成了酶固定化技术、细胞固定化技术研究等酶工程的研究热点，并广泛产业化应用. 开始了转基因技术和酶化学修饰技术；
90年代形成了以遗传工程为先导的酶工程技术分支——生物酶工程（包括酶基因克隆表达和基因修饰）。

2.2酶分子改造
酶应用于工业生产已经有很悠久的历史。

生物催化剂比化学催化剂有很大的优势，生物催化剂表现出高效、专一的催化活性。

近年来，随着基因操作技术的发展, 使得酶的生产成本变得低廉，产量得以提高，酶在工业上的应用越来越广泛。

由于天然酶对催化环境的苛刻要求，天然酶应用与工业生产需要克服很多困难，例如维持酶在生产环境中的稳定性等等。

天然酶的性能与工业生产的实际需要往往衔接不起来，为了获得能用于实际生产的酶，需要对现有的酶进行相应改造。

一方面可以通过酶分子理性设计；另一方面可以采用定向进化技术对酶进行改造。

前者属于理性的设计方法, 后者属于非理性的设计方法。

2.2.1理性设计
在理性设计中，首先要根据蛋白质的结构、功能和机制等详细资料对氨基酸序列中要突变的位点进行精确设计，然后通过取代、插入或缺失等手段改变蛋白质分子中特定的氨基酸。

从而鉴定出与酶特性相关的关键残基和结构元件。

分子设计的方法有寡核苷酸介导的重组PCR，限制性内切酶酶切片段取代法, 盒式突变法和化学合成法。

与使用化学因素、自然因素导致突变的方法相比，定点突变具有突变率高、简单易行、重复性好的特点。

随着通过酶动力学来鉴定有益突变体策略的建立，克服了传统的理性设计要求每轮都对突变体进行测序、纯化和酶特性的测定等缺点，使需要多轮突变对酶进行改性的理性设计方法成为可能。

同时, 随着核磁共振光谱预测蛋白质结构的发展和公共序列数据库储存越来越多的数据，使了解序列数据和结构更为方便。

应用分子模型可以预测怎样增加酶的选择性、活性和稳定性。

即使没有结构信息的情况下，同源酶的结构也可以作为模型。

在理性设计中，通过对蛋白质的三维结构，功能和机制等详细资料进行分析，设计突变位点并进行定点突变，然后将突变的基因引入宿主菌进行蛋白质表达、纯化和性质分析，以获得性能理想的突变体酶（图1）。

2.2.2定向进化
定向进化属于非理性蛋白质设计，是指在不了解有关酶结构与功能之间的关系等信息的情况下通过对酶基因的随机突变和基因片段的重组来创造突变库，然后通过高通量的筛选手段鉴定性能改善的突变体，挑出的有益突变基因可以作为下一轮突变的模板，进行多轮突变和筛选，以进一步提高酶的性能。

定向进化存
在的一个挑战性任务就是模拟自然进化过程, 将自然进化机制引入定向进化中。

定向进化的另一个限制是需要一个从突变库中灵敏而有效地筛选出突变体的方法。

因此，建立高通量的筛选方法是实验成功的关键。

蛋白质的非合理设计，它不需要事先了解酶的空间结构和催化机制，人为地创造特殊的进化条件，模拟自然进化机制（随机突变、基因重组和自然选择），在体外改造酶基因，并定向选择（或筛选）出所需性质的突变酶。

定向进化通过定向进化的手段建立突变库，然后转入宿主细胞进行表达，通过高通量的筛选手段进行筛选，通过蛋白质的特性和产品分析，挑出理想的突变体（图1）。

图1 理性设计和定向进化的路线图。