中温α-淀粉酶的酶学性质研究

α淀粉酶（中温）使用要领及效率之阳早格格创做导读：α淀粉酶（中温）是采与劣良菌株枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis）经液体深层收酵、粗制而成的下效死物制剂，广大应用于啤酒等死产中.产品个性淀粉酶为火解酶类，能正在较下温度下随机火解淀粉、糖本及其落解物里面的α1.4葡萄糖苷键，爆收可溶性糊粗战少量矮散糖，使得胶状淀粉溶液的粘度赶快下落，过分火解可爆收少量葡萄糖战麦芽糖.酶活力单位的定义1mL液体酶，于60℃、pH=6.0条件下，1h液化1g可溶性淀粉所需的酶量，即为1个酶活力单位，以u/mL表示.效率条件温度： PH值：最适温度范畴：70℃～75℃；最适pH范畴：5.0～6.0；灵验温度范畴：60℃～85℃. 灵验pH范畴：5.0～7.0.效率成果使淀粉液化更真足，醪液分层更明隐，色度矮，收缩糊化战过滤时间，普及设备战本料利用率；可真止无麦芽糊化支配，以普及辅料比率，进而落矮啤酒死产成本，革新啤酒本量，普及经济效率.规格及尺度淀粉酶为浅褐色液机制剂，酶活力≥3,000u/mL，果收酵本料、周期等果素的效率，颜色会稍有好别，但是没有会效率使用成果.本产品切合国家尺度GB8275《食品增加剂α淀粉酶制剂》.本产品切合食品仄安国家尺度GB2760《食品仄安国家尺度食品增加剂使用尺度》战GB25594《食品仄安国家尺度食品工业用酶制剂》的相闭确定.使用量正在啤酒酿制历程中，使用辅料时，推荐加量为辅料搞沉的0.04~0.08%（即每吨辅料加进0.4~0.8L），与α淀粉酶（耐下温）拆配使用效验更好；然而，由于糖化本料组成及工艺参数的好别，本品的最好增加量应通过正在糖化车间中举止分歧增加量的考查去决定.如果工艺中需安排料液的pH，请正在安排完毕后再加进酶液.使用仄安酶制剂是蛋黑量，吸进灰尘或者悬浮微粒大概会爆收过敏效率，引导人们爆收过敏反应.如果万古间交触某些酶，大概会刺激皮肤、眼睛战粘膜；飞溅战热烈搅动大概制成可吸进的粉尘.修议脱戴具备呵护效率的衣服、脚套战眼睛或者脸部呵护物.储藏淀粉酶属死物活性物量，应置于矮温、搞燥处保存，预防阳光曲射及少久与中界交触.本产品本启拆正在15℃以下矮温阳凉搞燥环境，保量期12个月。

生物化学学号：淀粉酶酶学性质的研究学生姓名：####指导教师：#####所在院系：生命科学学院所学专业：#######学号：######### 大学中国·哈尔滨2011 年12 月摘要：酶是酶是一种生物催化剂，它具有催化剂属性，同是也具有一些无机催化剂所不具有的特性。

催化特定化学反应的蛋白质、RNA或其复合体。

是生物催化剂，能通过降低反应的活化能加快反应速度，但不改变反应的平衡点。

本实验通过利用淀粉酶水解还原糖，还原糖能使3，5-二硝基水杨酸还原，生成棕色的3-氨基-5硝基水杨酸。

淀粉酶活力与还原糖的量成正比，用比色法测定淀粉酶作用于淀粉后生成的还原糖的量，以单位质量样品在一定时间内生成还原糖的量表示酶活力。

酶的活性又同时受到温度、PH、激活剂抑制剂等的影响。

关键词：淀粉酶活力温度 PH 激活剂和抑制剂前言：淀粉酶是水解淀粉和糖原的酶类总称，通常通过淀粉酶催化水解织物上的淀粉浆料，由于淀粉酶的高效性及专一性，酶退浆的退浆率高，退浆快，污染少，产品比酸法、碱法更柔软，且不损伤纤维。

淀粉酶的种类很多，根据织物不同，设备组合不同，工艺流程也不同，目前所用的退浆方法有浸渍法、堆置法、卷染法、连续洗等，由于淀粉酶退浆机械作用小，水的用量少，可以在低温条件下达到退浆效果，具有鲜明的环保特色。

此酶以Ca2+为必需因子并作为稳定因子和激活因子，也有部分淀粉酶为非Ca2+依赖型。

淀粉酶既作用于直链淀粉，亦作用于支链淀粉，无差别地随机切断糖链内部的α－1，4-链。

因此，其特征是引起底物溶液粘度的急剧下降和碘反应的消失，最终产物在分解直链淀粉时以葡萄糖为主，此外，还有少量麦芽三糖及麦芽糖，其中真菌a-淀粉酶水解淀粉的终产物主要以麦芽糖为主且不含大分子极限糊精，在烘焙业和麦芽糖制造业具有广泛的应用。

另一方面在分解支链淀粉时，除麦芽糖、葡萄糖、麦芽三糖外，还生成分支部分具有α-1，6-键的α-极限糊精（又称α-糊精）。

淀粉酶酶学性质的研究摘要淀粉酶可将淀粉水解为麦芽糖和少量葡萄糖，它们遇碘呈现不同的颜色，根据这个性质对淀粉酶进行不同条件下的研究。

通过在不同条件下对酶的性质进行研究发现萌发小麦种子中淀粉酶的最适温度在40℃，随着温度的升高或降低都会对酶活性产生影响；萌发的小麦种子的淀粉酶最适pH在5.6左右，低于或高于最适pH酶的活性逐渐降低；研究还发现Cl¯是淀粉酶的激活剂而Cu²+则对淀粉酶有抑制作用。

关键词：淀粉酶 .不同条件性质淀粉是植物最主要的储藏多糖，也是人和动物的重要食物和发酵工业的基本原料。

淀粉经淀粉酶水解后生成葡萄糖和麦芽糖等小分子物质而被机体利用。

通过对小麦种子中淀粉酶酶学性质的研究可以用于农业研究用于食品¸工业原料等，还可以提高小麦的应用范围和利用率。

⒈材料与方法⒈⒈实验材料萌发的小麦种子⒈⒉实验设计称取2g萌发3天的小麦种子，置于研钵中，加入少量2ml蒸馏水，研磨匀浆。

将匀浆倒入刻度试管中，定容至25ml。

提取液在室温下放置提取15-20min，每隔数分钟搅动一次，使其充分提取。

然后在4000r/min转速下离心10min，将上清液倒入一个干净的试管中，即为淀粉酶粗酶液。

⒈⒊实验方法与结果⒈⒊⒈温度对淀粉酶活性的影响取8支试管，编号，按下表操作，并记录观察到的颜色。

管号 A a B b C c D d缓冲液（pH5.6）/ml 1.0 — 1.0 — 1.0 — 1.0 —淀粉溶液/ml 2.5 — 2.5 — 2.5 — 2.5 —淀粉酶提取液/ml — 1.0 — 1.0 — 1.0 — 1.0预保温/10min 4℃室温40℃沸水浴混合A→a B→b C→c D→d酶促反应（10min）4℃室温40℃沸水浴碘液各加3滴（滴管应先冷却至室温）显色浅蓝色无色无色蓝色低温时酶的活性低，但没有失活，随着温度升高，酶的活性越来越高，后来又降低当温度到达很高时酶失活。

DOI:10.13995/ki.11-1802/ts.026430引用格式:马银凤,申培立,王彩喆,等.中温α-淀粉酶的分子进化及酶学性质[J].食品与发酵工业,2021,47(11):14-18.MA Yinfeng,SHEN Peili,WANG Caizhe,et al.Molecular evolution and biochemical characterization of Bacillus amyloliquefa-ciens α-amylase[J].Food and Fermentation Industries,2021,47(11):14-18.中温α-淀粉酶的分子进化及酶学性质马银凤1,申培立2,王彩喆1,牛丹丹1,田康明1,王正祥1∗1(天津科技大学化工与材料学院,天津,300457)2(天津科技大学生物工程学院,天津,300457)摘㊀要㊀解淀粉芽胞杆菌α-淀粉酶(Bacillus amyloliquefaciens α-amylase ,BAA )是淀粉加工㊁织物退浆㊁食品等相关工业中最主要的中温型淀粉液化酶,但其工业应用属性一直未被深入研究㊂该研究基于酶分子进化原理,获得了催化属性显著改善的BAA 突变体E2M6㊂与BAA 相比,突变体E2M6的最适作用温度提高5ħ,最适作用pH 则未发生变化,突变体酶活性对Ca 2+㊁Mg 2+㊁Na +等金属离子的依赖性显著降低,其淀粉水解效率(κcat /K m )较BAA 提高了1.75倍,显示其具有更好的工业应用价值㊂关键词㊀解淀粉芽胞杆菌α-淀粉酶;分子进化;酶学性质;淀粉水解活性第一作者:硕士研究生(王正祥教授为通讯作者,E-mail:zxwang0519@)㊀㊀基金项目:国家重点研发计划政府间国际科技创新合作重点专项项目(2018YFE0100400);天津市高等学校创新团队建设规划项目(TD13-5009);国家自然科学基金项目(31601407)收稿日期:2020-12-10,改回日期:2020-12-21㊀㊀解淀粉芽胞杆菌α-淀粉酶(Bacillus amyloliquefa-ciens α-amylase,BAA)可以随机水解直链淀粉或支链淀粉分子中的α-1,4糖苷键,生成麦芽糊精和少量葡萄糖,是一种内切型液化酶,最适作用温度为55ħ㊁最适作用pH 为6~7,是一种典型的钙离子依赖型淀粉液化酶[1-2]㊂BAA 在淀粉液化㊁织物退浆和食品加工等工业中具有重要应用价值,是工业上产量最大㊁应用领域最广的中温型α-淀粉酶[3-4]㊂BAA 作为我国开发应用较早的工业酶制剂之一,早在19世纪60年代就开始了工业化生产,但发酵水平一直停滞在300~500U /mL,且酶制剂产品质量不稳定㊁货架期太短(3个月左右)㊂2009年前后,经过分子育种技术,在改善BAA 酶制剂质量和货架期的同时,BAA 发酵生产水平提高至1500U /mL 以上,由此确立了BAA 生产的世界领先地位[5]㊂但是,针对BAA 工业应用属性的研究,一直以来未有很大的突破㊂现有针对BAA 的分子进化研究,主要包括:LEE 等[6]对BAA 编码基因进行随机突变,发现233位的氨基酸残基与BAA 的酶学性能有关;CORNEL-IUS 等[7]通过易错PCR 与DNA 体外随机重排技术(DNA shuffling)对BAA 编码基因进行改造,得到水解活力提高8倍的突变体BAA29,比酶活性由15U /mg 提高至140U /mg;WU 等[8]通过易错PCR 对BAA 编码基因进行随机突变,得到Ca 2+依赖性降低的突变体Q264S;林碧瑜[9]发现BAA 第28位氨基酸由天冬氨酸突变为谷氨酸可以提高比酶活性,与野生型BAA 相比突变体的比酶活性提高了约30%㊂BAA 工业应用属性有待改善的主要方面:1)酶活性的钙离子依赖型,即如何降低其在实际工业应用中氯化钙或碳酸钙等钙盐的补加;2)如何适度提高其最适作用温度,有利于淀粉液化和加工工艺的实施㊂为此,本文在前期研究积累[9]的基础上,进一步对其特定氨基酸残基进行突变并解析酶学性质,研究结果对后续进一步提升BAA 的应用具有显著价值㊂1㊀材料与方法1.1㊀材料1.1.1㊀菌种与质粒含有BAA 突变体2M6表达质粒的Bacillus subti-lis 2M6-A1为本实验室前期构建与保藏;B.subtilis1A717为本实验室保藏,用于质粒构建;载体pHY-WZX 为本实验室前期构建[10],用于BAA 及其突变体的表达;Bacillus licheniformis Z902(Δamy )[11]为酶高效表达宿主细胞,由本实验室前期通过分子改造B.licheniformis CBBD302[12]获得㊂1.1.2㊀酶与试剂中温α-淀粉酶工业产品,江苏锐阳生物科技有限公司;Pyrobest DNA 聚合酶,Takara 公司;限制性内切酶Xba I㊁Sma I㊁T 4DNA 连接酶和DNA 分子量标准,上海生工生物工程股份有限公司;琼脂糖凝胶DNA回收试剂盒和小量DNA产物纯化试剂盒,北京庄盟生物科技有限公司,其他试剂除特殊要求外均为国产分析纯㊂1.1.3㊀培养基LB培养基(g/L):酵母浸出物5,蛋白胨10,氯化钠10;固体培养基添加20g/L琼脂㊂必要时在培养基中添加终质量浓度为20μg/mL的硫酸卡那霉素㊂产酶鉴定培养基:在固体LB培养基的基础上,加入1%可溶性淀粉[13]㊂发酵培养基(g/L):CaCl20.3,(NH4)2SO43,棉籽粉20,α-乳糖20,KH2PO410,K2HPO420,pH7.2[13]㊂1.2㊀实验方法1.2.1㊀常规分子克隆操作质粒DNA的提取㊁酶切㊁转化子筛选等均按照实验室常规方法进行[14];枯草杆菌与地衣芽胞杆菌的遗传转化按照文献进行[15-16];DNA纯化按照试剂盒说明书进行㊂1.2.2㊀定点突变以突变体2M6编码基因为模板,按照文献方法进行定点突变[5]㊂具体步骤为:以baa-28a(5ᶄ-CGATAAATGTTCCGCATCATTCTG-3ᶄ)和baa-28b(5ᶄ-CAGAATGATGCGGAACATTTATCG-3ᶄ)为突变引物,引入突变位点D28E,与两端引物BAA-1(5ᶄ-TACTCTAGAGTAAATGGCACGCTGATGCAGTAT-3ᶄ)和BAA-2(5ᶄ-TTTCTGAACATAAATGGAGCAGG-3ᶄ)组合,通过PCR扩增获得上下游两段DNA片段;再以此两段DNA片段为模板,以BAA-1和BAA-2为引物,将上下游两段DNA片段融合为突变体E2M6全长基因㊂采用Sanger核苷酸序列测定法确认突变基因序列㊂1.2.3㊀突变体的表达、制备与纯化将突变体全长编码DNA片段纯化后经Xba I酶切,并克隆入表达载体pHY-WZX的Xba I/Sma I位点,转化入枯草杆菌1A717构建重组质粒pHY-E2M6,正确构建的质粒转化入地衣芽胞杆菌Z902中,获得产酶重组菌地衣芽胞杆菌Z-E2M6㊂将Z-E2M6接种入盛有50mL发酵培养基的250 mL摇瓶,37ħ㊁220r/min条件下培养120h;发酵结束后离心收集上清液,即为突变体粗酶液㊂酶液经饱和度为30%~40%的硫酸铵沉淀,再经凝胶层析柱Superdex-G75进一步纯化㊂纯化蛋白经SDS-PAGE 分析[17],蛋白质浓度用Bradford法测定[18]㊂1.2.4㊀酶活测定中温α-淀粉酶酶活力按照GB1886.174 2016‘食品安全国家标准食品添加剂食品工业用酶制剂“进行测定[19]㊂酶活性定义为:1mL液体酶在60ħ㊁pH6.0条件下,1h液化1g可溶性淀粉即为1个酶活力单位,以U/mL表示㊂1.2.5㊀酶学性质分析1.2.5.1㊀最适作用温度及热稳定性将酶样在不同温度(30~90ħ)下测定酶活力,最高酶活力值以100%计,计算其不同温度下的相对酶活力,确定最适作用温度㊂将酶样用pH6.0缓冲液进行适当稀释,在不同温度(50㊁55㊁60㊁65ħ)下保温1h,间隔10min取样,测定残余酶活力,未经热处理的酶活力值以100%计,计算处理后酶样的相对酶活力㊂1.2.5.2㊀最适作用pH及pH稳定性将酶样用不同pH(4~8)缓冲液进行稀释,并用对应pH缓冲液测定酶活力,最高酶活力值以100%计,计算其不同pH条件下的相对酶活力,确定最适作用pH㊂将酶样与不同pH值缓冲液以1ʒ10(体积比)混合,37ħ静置1h,测定酶样的残余酶活力值㊂未经处理的酶活力值以100%计,计算处理后酶样的相对酶活力㊂1.2.5.3㊀金属离子及化学试剂对酶活的力影响在反应体系中加入不同金属离子和化学试剂,终浓度为1mmol/L或5mmol/L,在酶的最适反应条件下测定样品酶活力,未经处理的酶活力值以100%计㊂1.2.5.4㊀酶动力学参数的测定将酶样用最适作用pH缓冲液适当稀释后,以不同质量浓度(0.4㊁1㊁2㊁4,10和20mg/mL)可溶性淀粉溶液为底物,在最适反应条件下按照实验室常规方法[9]进行测定,并以双倒数法(Lineweaver-Burk法)作图,计算酶的动力学参数㊂2㊀实验结果2.1㊀突变体的构建与制备以突变体2M6编码基因为模板,特异性引物序列介导BAA编码基因的定点突变,获得突变体E2M6全长编码基因㊂将此基因酶切后克隆入表达载体pHY-WZX中,获得了重组表达载体pHY-E2M6㊂进一步将此表达质粒转化入地衣芽胞杆菌Z902中,获得产酶重组菌地衣芽胞杆菌Z-E2M6㊂经摇瓶发酵制备酶液,并经硫酸铵沉淀和凝胶过滤色谱进行纯化,获得了纯化的BAA突变体E2M6,经SDS-PAGE电泳鉴定,呈现单一纯蛋白条带(图1),分子质量为58kDa,与理论大小相符㊂M-蛋白分子量标准;1-B.licheniformis Z902发酵酶液;2-E2M6粗酶液;3-纯化后的E2M6图1㊀纯化突变体E2M6的SDS-PAGE图谱Fig.1㊀The SDS-PAGE profile of mutant E2M62.2㊀突变体的酶学性质2.2.1㊀最适作用温度与最适作用pH由图2-a可知,突变体E2M6的最适作用温度为60ħ,60~70ħ之间维持较高活性,突变体的最适酶活较野生型BAA提高了至少5ħ;在30~60ħ温度范围内,突变体E2M6与BAA的变化趋势大致相同;当温度升至80ħ时,野生型BAA的酶活力明显下降(小于40%),突变体E2M6仍保留70%以上的酶活力;当反应温度升至90ħ时,突变体E2M6仍保留20%以上的酶活力,而BAA仅残余约10%的酶活a-温度;b-pH图2㊀突变体E2M6的最适作用温度与最适作用pH Fig.2㊀Optimum temperature and pH optimal of mutant E2M6力㊂可见,对BAA的突变拓宽了BAA的作用温度范围㊂在60ħ条件下,测定不同pH(4.0~8.0)条件下的酶活力,结果如图2-b所示㊂突变体E2M6与BAA的最适作用pH相同,都为pH6.0,且两者在不同pH条件下的酶活力大致相同,在pH5.0~7.0范围内皆具有较高活性㊂2.2.2㊀热稳定性与pH稳定性BAA突变体的热稳定性和pH稳定性如图3所示㊂突变体在50ħ下保温1h后,E2M6与BAA分别保留80%㊁60%以上的酶活力;55ħ保温1h后E2M6与BAA分别保留60%㊁40%以上酶活力;60ħ保温1h后E2M6与BAA分别保留50%㊁30%以上的酶活力;65ħ保温1h后E2M6与BAA分别保留40%㊁15%以上的酶活力(图3-a)㊂综上,E2M6热稳定性较BAA有所提升㊂突变体E2M6与BAA的pH稳定性趋势大致相同㊂当pH在6.0~9.0范围内,pH的升高对BAA及E2M6酶活力影响较小,相对酶活力保持在80%以上(图3-b)㊂a-热稳定性;b-pH稳定性图3㊀突变体E2M6的热稳定性与pH稳定性Fig.3㊀The thermostability and pH stability of the mutant E2M62.2.3㊀金属离子和化学试剂对酶活性的影响不同金属离子及化学试剂对突变体酶活性的影响结果如表1㊂与BAA相比,突变体E2M6酶活力对Ca2+㊁Mg2+㊁Na+等金属离子的依赖性降低;SDS对BAA及突变体E2M6酶活均有抑制作用,但与BAA相比E2M6对SDS更敏感㊂表1㊀不同金属离子和化学试剂对突变体E2M6的影响Table1㊀Effect of different metal ions and chemicals on E2M6金属离子或化学试剂(1mmol/L)相对酶活力/%E2M6BAA金属离子或化学试剂(5mmol/L)相对酶活力/%E2M6BAA对照100100对照100100Na+103ʃ2.9115ʃ2.7Na+101ʃ2.3144ʃ1.9K+104ʃ1.6100ʃ1.7K+97ʃ1.683ʃ2.3Li+103ʃ1.5126ʃ2.3Li+99ʃ2.5124ʃ1.3Ca2+115ʃ0.9122ʃ2.1Ca2+112ʃ0.1137ʃ3.2Mg2+104ʃ3.4104ʃ3.2Mg2+97ʃ1.9119ʃ1.5Zn2+102ʃ0.3101ʃ2.3Zn2+103ʃ3.5109ʃ1.6Mn2+99ʃ2.6101ʃ2.2Mn2+96ʃ2.3106ʃ1.3Co2+104ʃ1.4106ʃ2.4Co2+104ʃ4.9108ʃ3.2Fe3+102ʃ3.1104ʃ2.2Fe3+103ʃ1.4102ʃ1.3SDS54ʃ1.382ʃ2.5SDS35ʃ2.279ʃ1.6EDTA58ʃ0.556ʃ3.2EDTA51ʃ0.955ʃ4.3 2.2.4㊀突变体E2M6动力学特征测定突变体E2M6的比酶活力数据与动力学常数,结果汇总于表2㊂突变体E2M6比酶活力为185 U/mg,较BAA提高了约66%;突变体E2M6的底物亲和力较BAA显著提高,最大反应速度虽有所降低,但突变体E2M6的淀粉水解效率(κcat/K m)有所提升,较BAA提高了1.75倍㊂表2㊀突变体E2M6的酶促学动力学特征Table2㊀The kinetic parameters of the mutant E2M6中温α-淀粉酶比酶活力/(U㊃mg-1)动力学参数V max/[mg㊃(mL㊃min)-1]K m/(mg㊃mL-1)κcat/(min-1)κcat/K m[mL㊃(mg㊃min)-1]E2M6185ʃ2.310.0ʃ0.9 2.4ʃ0.219.1ʃ1.37.92 BAA111ʃ1.528.1ʃ2.811.0ʃ1.031.0ʃ2.1 2.883㊀结论通过研究,本文获得了BAA工业应用性能显著提升的突变体,其活力的钙离子依赖性显著降低,最适作用温度有所提高,更适合淀粉加工工业应用需求㊂参考文献[1]㊀范如意.基因工程技术改造地衣芽孢杆菌实现中温α-淀粉酶高效表达[D].无锡:江南大学,2014.FAN R Y.Heterologous expression ofα-amylase in Bacillus licheni-formis with genetic engineering modification[D].Wuxi:Jiangnan University,2014.[2]㊀姜锡瑞,段刚.酶制剂实用技术手册[M].北京:中国轻工业出版社,2002.JIANG X R,DUAN G.Practical technical manual of enzyme prepa-ration[M].Beijing:China Light Industry Press,2002.[3]㊀SIVARAMAKRISHNAN S,GANGADHARAN D,NAMPOOTHIRI KM,et al.α-Amylases from microbial sources-an overview on recent developments[J].Food Technology&Biotechnology,2006,44(2): 173-184.[4]㊀刘洋,沈微,石贵阳,等.中温α-淀粉酶的酶学性质研究[J].食品科学,2008,29(9):373-377.LIU Y,SHEN W,SHI G Y,et al.Enzymatic properties of mesophilic α-amylase from Bacillus amyloliquefaciens M23[J].Food Science, 2008,29(9):373-377.[5]㊀刘洋.中温α-淀粉酶编码基因剂量对其生产水平提高的重要作用[D].无锡:江南大学,2009.LIU Y.The important role ofα-amylase gene dosages on 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中兽医医药杂志　J TCVM 2007年第3期68 资 料耐高温α-淀粉酶的研究进展王　楠,马荣山(沈阳农业大学,辽宁沈阳　110161) 中图分类号:S853.1 文献标识码:B　文章编号:100026354(2007)0320068202 α-淀粉酶(α-a mylase)广泛地存在于动植物和微生物中,它是一种内切葡萄糖苷酶,是目前最重要的工业酶制剂之一[1]。

当今广泛使用的酶制剂始于1906年,人类发现了用于液化淀粉生产乙醇的细菌淀粉酶,首先应用于工业的α-淀粉酶来自于真菌。

由于一些细菌α-淀粉酶具有耐高温、耐酸、耐碱等特性,更符合工业生产中的某些极端条件,因此,目前在需高温的发酵等工业中使用最为广泛的是细菌α-淀粉酶,尤其是来自杆菌(如解淀粉芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌)的耐高温α-淀粉酶已占据相当大的市场。

1　耐高温α-淀粉酶的种类耐高温α-淀粉酶按来源分为古菌α-淀粉酶和真菌α-淀粉酶;它们的最适作用温度在60℃以上。

一般古菌来源的α-淀粉酶较真菌能够耐受更高的温度。

许多古菌能够在各种极端的条件下生存,如高温、高渗、强酸、强碱等,维持它们生命活动的很多蛋白质也可适应其生存环境,因此,耐高温α-淀粉酶有很多来自古菌。

以下列出部分耐高温α-淀粉酶的性质(表1)。

表1　耐高温α-淀粉酶的种类 菌　种类别最适温度/℃最适pHB acillus subtilis真菌60～706.0B acillus lichenifor m is真菌905.5～7.0D esulfurococcus m ucosus古菌1005.5Pyrococcus furiosus古菌>1005.6Pyrococcus w oesei古菌1005.5Pyrococcus kodakaraensis K OD1古菌906.5Ther m ococcus aggregans古菌1006.5Ther m ococcus celer古菌906.0Ther m ococcus guaym agensis古菌100 5.52　耐高温α-淀粉酶的分子结构根据X-射线衍射等技术得知的或由基因序列推算出的耐高温α-淀粉酶的分子量大多在40-60k D之间,有的以单体形式存在,有的以二聚体存在。

中温a淀粉酶中温a淀粉酶简介|中温a淀粉酶cas|中温a淀粉酶价格|中温a淀粉酶厂家中温a淀粉酶是由枯草芽孢杆菌经液体深层发酵提炼而成，其产品为液体剂型，适用于生物制药、淀粉糖、酒精、啤酒、味精、发酵工业、纺织等。

*外观形态及主要技术性能指标液体：棕褐色液体、高浊度有少量沉淀固体：浅黄色粉状酶活力 U/ml （ g ） 2000最适宜温度： 70 ℃－ 80 ℃最适宜 pH 值范围： 5.5 － 7.0 ，最适 pH 值： 6.0 － 6.4密度 g/ml ≦ 1.25产品标准 : QB 1805.1-93*酶活力定义及参考用量60 °C 、PH6.0条件下,1毫升酶液1小时液化可溶性淀粉1克成为糊精即为1个酶活力单位。

用 u/ml 表示。

一般按每克淀粉用4-10个单位计算。

中温a淀粉酶特性1 、作用方式：能水解淀粉、可溶性糊精及低聚糖中的 a － 1 ， 4 葡萄糖苷键。

酶作用后可使糊化淀粉的粘度迅速下降，水解生成糊精及少量葡萄糖和麦芽糖等。

2 、热稳定性：本产品最适作用温度在 60 ～ 75 ℃之间。

随着温度的升高，其反应速度加快，但失活也快，温度低可以适当延长反应时间。

3 、pH 稳定性： pH 值 6.0 － 7.0 较稳定，最适作用 pH 值 6.0 － 6.4 ，pH5.0 以下失活严重。

4 、与淀粉浓度关系：淀粉和淀粉的水解产物糊精浓度的增加对酶活力的稳定性有很大的提高作用，即浓度增加酶活力的稳定性增加。

5 、钙离子浓度对酶活力的影响：钙离子对酶活力的稳定性有提高作用，没有钙离子酶活力完全消失。

钙离子的浓度应在 150~250mg/kg 。

6 、 pH 稳定性与钙离子的关系：钙的存在酶活力的 pH 值范围增大；不含钙离子的淀粉酶 pH 值作用范围小。

中温a淀粉酶应用范围及使用方法1 、啤酒行业使用大米、玉米为原料时，先磨粉通过 40 目以上筛孔，在糊化锅中调浆后加淀粉酶，加酶量在 6U/g 左右，在 70 ℃－ 80 ℃液化 30 分钟左右。

α-淀粉酶的应用及研究进展作者：冯健飞来源：《现代农业科技》2010年第17期摘要介绍了α-淀粉酶的工业应用,包括面包焙烤工业、淀粉液化与糖化、纤维脱浆、造纸工业、除垢剂制造、制药与临床化学分析等,并概括了了α-淀粉酶国内外应用与研究进展,以期为α-淀粉酶的进一步研究提供参考。

关键词α-淀粉酶;工业应用;研究进展中图分类号 Q556.2 文献标识码A文章编号 1007-5739(2010)17-0354-02α-淀粉酶分布十分广泛,遍及微生物至高等植物。

其国际酶学分类编号为EC.3.2.1.1,作用于淀粉时从淀粉分子的内部随机切开α-1,4糖苷键,生成糊精和还原糖,由于产物的末端残基碳原子构型为A构型,故称α-淀粉酶。

现在α-淀粉酶泛指能够从淀粉分子内部随机切开α-1,4糖苷键,起液化作用的一类酶。

α-淀粉酶是一种十分重要的酶制剂,大量应用于粮食加工、食品工业、酿造、发酵、纺织品工业和医药行业等,它占了整个酶制剂市场份额的25%左右。

目前,工业生产上都以微生物发酵法大规模生产α-淀粉酶[1-4]。

1α-淀粉酶的工业应用1.1面包焙烤工业作为保鲜剂酶应用在焙烤工业中生产各种高品质的产品已经有几百年的历史。

最近几十年,麦芽α-淀粉酶和微生物α-淀粉酶被广泛用于焙烤工业。

这些酶用于面包工业,使这些产品体积更大,颜色更好,颗粒更柔软。

至今,焙烤工业中的α-淀粉酶一直是从大麦麦芽和细菌、真菌叶提取的。

现代化连续焙烤过程中,在面粉中添加α-淀粉酶不仅可以增加发酵率、降低生面团黏度(改进产品的体积和质地),增加生面团中糖的含量,改良面包的口感、外皮颜色和焙烤质量,还可以延长焙烤食品的保鲜时间。

在储存过程中,面包颗粒变得干燥、坚硬、表皮不再清脆,导致面包的口感变差。

这些变化统称为变质。

每年仅仅由于面包变质而造成的损失超过1亿美元。

各种传统的添加剂被用于防止食品变质,以改善焙烤食品的质地和口味。

最近,人们开始关注酶作为防腐剂、保鲜剂在生面团改良方面的作用,如支链淀粉酶和α-淀粉酶配合可以有效的用于防腐。

安徽农业科学１６０ｒ／ｖａｉｎ摇床培养１２ｈ／’种子液以１０％的接种量接种于产酶发酵培养基上，３７℃、１６０ｒ／ｍｉｎ摇床培养２４ｈ后发酵液５０００ｒ／ｍｉｎ离心１０ｍｉｎ，取上清液测酶活力。

选取酶活力较高的菌株作为试验菌种。

１．４．Ｌ３酶活力的测定一１。

仅一淀粉酶能将淀粉水解为长短不一的短链糊精和少量的还原糖，而使淀粉对碘呈蓝紫色的特异反应逐渐消失，可以用这种显色消失的速度来衡量酶的活力。

用ＹｏｕｎｇＪ．Ｙ００改良法：取５ｒＩｌｌ０．５％可溶性淀粉溶液，在４０℃水浴中预热１０ｍｉｎ，然后加入适当稀释的酶液０．５ｍｌ，反应５ｍｉｎ后用５Ｉｌｌｌ０．１ｍｏｌ／ＬＨ２Ｓ０４溶液终止反应。

取０．５ｍ１反应液与５ｌＩｌｌ工作碘液显色，在６２０ｎｍ波长处测光密度。

以０．５ｍｌ水代替０．５ｒＩｌｌ反应液为空白，以不加酶液（加相同的水）的管为对照。

，酶活力单位定义为：在４０℃、５ｖａｉｎ内水解ｌｎ蟮淀粉（０．５％淀粉）的酶量为１个活力单位。

酶活力计算公式如下：酶活力（ｕ／ＩＩｌｌ）＝（民一Ｒ）／ＲｏＸ５０ＸＤ式中，尺。

、Ｒ分别为对照、反应液的光密度；Ｄ为酶的稀释倍数，调整Ｄ使（Ｒ一尺）／民在０．２～０．７。

１．４．２酶学性质的研究。

１．４．２．１酶反应最适温度的确定。

设置４０、６０、８０℃３个温度梯度，测定反应体系在不同温度下的酶活力，确定酶反应的最适温度。

１．４．２．２酶反应最适ｐＨ值的确定。

用不同的缓冲液设置ｐＨ值为４、６、ｌＯ３个梯度值，测定反应系在不同ｐＨ值下的酶活力，确定酶反应的最适ｐＨ值。

１．４．２．３ｃａ２＋对酶热稳定性的影响。

在１００℃下调整酶液中Ｃａ２＋的不同浓度，测定不同时间Ｆ的酶活力，确定ｃｄ＋对酶热稳定性的影响。

２结果与分析２．１Ｏｒ＂淀粉酶生产菌株的分离筛选２．１．１初筛结果。

采用碘熏法从淀粉筛选平板｝＝挑出ｌＯ株有明显淀粉水解圈（图１）的菌株。

图１菌种的水解圈Ｆｉｇ．１Ｈｙｄｒｏｌｙｚｅｄｃｉｒｃｌｅｏｆｓｔｒａｉｎ２．１．２复筛结果。