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松子壳多糖对小鼠主要免疫细胞功能的影响

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松子壳多糖对小鼠主要免疫细胞功能的影响

刘中禄;吕铁钢;张永亮

【摘 要】目的 探讨松子壳多糖(pine nut shell polysaccharide,PSP)对小鼠主要免疫细胞的影响.方法 应用MTT法测定PSP对小鼠脾淋巴细胞的毒性和对ConA或LPS诱生小鼠脾T、B淋巴细胞的转化,用中性红吞噬试验测定腹腔巨噬细胞的吞噬功能,应用乳酸脱氢酶释放法测定NK细胞的杀伤活性.结果 PSP对脾细胞毒性很低,各种浓度对小鼠脾淋巴细胞的增殖均有较强的促进作用(P＜0.01);PSP在浓度50～300μg/mL时,明显促进T淋巴细胞的转化(P＜0.01),但是当浓度达到300μg/mL时表现出一定的抑制作用(P＞0.05);PSP在25～200μg/mL时显著促进了小鼠脾B淋巴细胞的转化(P＜0.05),但是当浓度达到300μg/mL时,抑制作用极显著(P＜0.01);不同浓度均可以增强小鼠腹腔巨噬细胞吞噬中性红的能力及其代谢功能,当浓度在100μg/mL时能显著的促进巨噬细胞吞噬中性红的能力(P＜0.01);PSP在浓度100～300μg/mL时,能极显著的促进NK细胞对Yac-1的杀伤作用(P＜0.01),当浓度达到400μg/mL,对NK细胞杀伤性的促进作用开始减弱.结论 PSP对小鼠脾淋巴细胞的毒性较低,能增强免疫细胞活性,有望成为新一代免疫调节剂.

【期刊名称】《中国比较医学杂志》

【年(卷),期】2010(020)010

【总页数】5页(P33-37)

【关键词】松子壳多糖;免疫细胞;免疫活性

【作 者】刘中禄;吕铁钢;张永亮 【作者单位】第三军医大学大坪医院野战外科研究所实验动物中心,重庆,400042;华南农业大学,广州,510095;华南农业大学,广州,510095

【正文语种】中 文

【中图分类】R392

多糖是来自高等植物，动物细胞膜，微生物的细胞壁中的天然大分子物质，已提取300多种，这些从天然产物中分离出来的多糖对抗肿瘤、抗病毒、抗氧化、抗衰老、降血糖、降血脂、愈溃疡、提高人体免疫力等方面都有非常显著的效果［1］。

松子壳多糖(pine nut shell polysaccharide，PSP)是从松子壳(松塔)中提取的酸性多糖成分，其在抗肿瘤、抗病毒和免疫促进剂作用［2－6］方面研究较多。本试验着重探讨松子壳多糖对小鼠脾淋巴细胞增殖、巨噬细胞吞噬功能及NK细胞杀伤活性的影响，考察松子壳多糖对小鼠的免疫调节作用，旨在为新型免疫调节剂的研发奠定一定的实验基础。

SPF级昆明小鼠20只，雌雄各半，体重18～22 g，购于第三军医大学实验动物中心［SCXK(渝)2007－0002］。

松子壳多糖(PSP)，由吉林大学农学部生化教研室提供［7］，以双蒸水配成10

mg/mL母液，临用时以含10%胎牛血清的RPMI－1640培养基稀释至所需浓度。

RPMI－1640培养基(美国 GIBCO公司);胰酶(Amersco公司);小牛血清(杭州四季青公司);四甲基偶氮唑盐(MTT)(Sigma公司)，以含10%小牛血清的RPMI－1640培养基配制，浓度为5 mg/mL;红细胞裂解液(Tris－NH4Cl，pH 7.4);吩臻二甲酯硫酸盐(PMS)(Biochemika公司);刀豆蛋白A(ConA)、脂多糖(LPS)、氧化型辅酶I(NAD)、左旋乳酸和碘硝基氯化四氮哩(INT)(Sigma公司);中性红生理盐水溶液，浓度为0.1%;分析纯二甲基亚砜(DMSO)(金山化工厂);细胞培养板(Coster公司)。Yac－1细胞系(吉林大学农学部免疫教研室惠赠)。 酶联免疫检测仪(BIO－RAD公司);CO2孵箱(美国SHELLAB公司);倒置显微镜(OLYMPUS公司);低温高速离心机(德国Heracus)。

1.4.1 PSP对小鼠脾淋巴细胞体外转化的影响:在无菌条件下常规方法制备小鼠脾细胞，用含10%小牛血清的RPMI－1640(完全培液)调整细胞浓度为5×106/mL制成脾细胞悬液备用。

PSP对小鼠脾细胞的毒性试验:取上述脾细胞悬液，加入96孔细胞培养板，100

μL/孔。24 h后加入不同稀释浓度的PSP(终浓度分别为1000、500、200、100、50 和 25 μg/mL)，设 3 个复孔;对照组加入完全培液，置5%CO2孵箱中37℃培养48 h，培养结束前4 h，每孔加入MTT 20 μL，弃上清后每孔加DMSO100 μL，振荡 5 min，酶联免疫检测仪 570 nm下测A值，取3复孔均值。

PSP对ConA诱导的小鼠T淋巴细胞体外转化的测定:如上述脾细胞悬液，加入96孔细胞培养板，100 μL/孔。实验组及转化对照组每孔加入ConA10 μL(终浓度5

μg/mL)，空白对照孔加入等量完全培养液。实验组加入不同稀释浓度的PSP(终浓度分别为 400、300、200、100、50 和25 μg/mL)，设 3 个复孔;转化对照组加入完全培液。置5%CO2孵箱中，37℃培养48 h，按前述MTT法测定各A值，取3复孔均值。

PSP对LPS诱导的小鼠B淋巴细胞体外转化功能测定:方法同T淋巴细胞，只是丝裂原以终浓度20 μg/mL的 LPS代替 ConA。

1.4.2 PSP对小鼠巨噬细胞活性的影响:小鼠腹腔巨噬细胞悬液的制备:断颈处死小鼠后，75%乙醇消毒。剪开小鼠腹部外层皮肤，向其中注人无菌冷Hanks液5mL，轻揉小鼠腹部后用注射器将腹腔液抽出，置于无菌离心管中离心(1200 r/min，5

min)，沉淀弃上清，用完全培液制成2×106/mL的细胞悬液，将此细胞悬液加96孔培养板内，每孔100 μL，置5%CO2孵箱中37℃培养2 h。弃掉未贴壁细胞，再用10%NCS RPMI－1640洗涤细胞3次，剩下的贴壁细胞即为制备的巨噬细胞。

PSP对巨噬细胞代谢的影响:将巨噬细胞与不同浓度的PSP共同培养24 h后，每孔加入MTT20 μL(5 mg/mL)，37℃ 5%CO2培养 4 h后取出，弃上清后每孔加

DMSO100 μL，微量振荡器振荡5 min，酶联免疫检测仪570 nm下测A值，取3复孔均值。

PSP对小鼠巨噬细胞吞噬功能的影响:如上制备小鼠巨噬细胞，加入96孔细胞培养板内，每孔100 μL，含2×105个巨噬细胞。实验孔加入不同稀释浓度的 PSP，终浓度分别为 400 μg/mL、300 μg/mL、200 μg/mL、100 μg/mL、50 μg/mL、25 μg/mL，每个浓度设3个复孔。对照组加入完全培液。置5%CO2孵箱中，37℃，饱和湿度连续培养24 h，然后每孔加入0.1%的中性红生理盐水溶液，每孔100 μL，继续培养 2 h。弃上清，加入 DMSO，100 μL/孔，震荡，酶联免疫检测仪570 nm下测 A值，取三复孔均值。

1.4.3 PSP对小鼠NK细胞活性的影响:将已调整好浓度的脾细胞悬液(即效应细胞)及Yac－1细胞悬液(即靶细胞)各取100 μL(效∶靶 =50∶1)加人96孔培养板中。实验孔加入不同稀释浓度的PSP(终浓度分别为 400、300、200、100、50 和 25

μg/mL)，设 3 个复孔，每孔 100 μL。以 0.5%BSA RPMI－1640为正常对照，同时设靶细胞自然释放孔(加100 μL 的0.5%BSA RPMI－1640)及最大释放孔(加

100 μL 1%NP－40)，混匀，置 5%CO2孵箱中，37℃，培养4 h。孵育结束后，将其置于4℃5 min终止反应，吸出100 μL的上清液于另一96孔板中，加人100 μL新鲜配制的底物LDH反应液充分混匀，反应15 min后，酶标仪570 nm处测各孔A值，按下式计算NK细胞活性:NK细胞活性(%)=(试验组A值－自然释放对照组A值)/(最大释放对照组A值－自然释放对照组A值)×100。

采用SPSS10.0软件对数据统计，采用t检验，方差分析。

PSP对脾细胞毒性很低，对脾淋巴细胞增殖的促进作用随浓度增加变化不大，多糖浓度达到500 μg/mL，对脾淋巴细胞的增殖虽有促进作用，但和低剂量比较有所下降(表1)。

各浓度的PSP能协同ConA诱导的小鼠T淋巴细胞体外转化。当浓度在50～200

μg/mL时，能明显的促进T淋巴细胞的转化，差异极显著 (P＜0.01);但是当浓度达到300 μg/mL时表现出一定的抑制作用(P＞0.05)(表2)。

与对照组比较，PSP在25～200 μg/mL时显著促进了小鼠脾B淋巴细胞的转化(P＜0.05)，但是随着浓度的继续升高，表现出较强的抑制作用，当浓度达到300

μg/mL时，抑制作用极显著(P＜0.01)(表3)。

2.4.1 PSP对巨噬细胞代谢的影响:与对照组比较，PSP浓度在25～200 μg/mL时极显著增强了小鼠巨噬细胞的代谢功能 (P＜0.01)，但是随着浓度的继续升高，对巨噬细胞的代谢逐渐表现出抑制作用，当浓度达到400 μg/mL时抑制作用极显著(P＜0.01)(表4)。

2.4.2 PSP对小鼠巨噬细胞吞饮功能的影响:与对照组比较，PSP在25～300

μg/mL范围内，随浓度升高促进了巨噬细胞吞噬中性红的作用，浓度在100

μg/mL时促进作用极为显著(P＜0.01)，但是当浓度达到400 μg/mL时表现出一定的抑制作用，总体上PSP对巨噬细胞的活性影响呈双向剂量依赖关系(表5)。

与对照组(自然释放组)比较，PSP在浓度100～300 μg/mL时，能极显著的促进NK细胞对Yac－1的杀伤作用(P＜0.01);在25～50 μg/mL时，能显著的促进NK细胞对Yac－1的杀伤作用(P＜0.05)，但浓度达到400 μg/mL，对NK细胞杀伤性的促进作用不明显(表6)。

脾脏是机体内最大的外周免疫器官，也是T/B淋巴细胞定居和接受抗原刺激产生免疫应答的重要场所，ConA等有丝分裂原能非特异性地诱导T细胞活化，LPS等有丝分裂原能非特异性地诱导B细胞活化，导致细胞因子合成及细胞因子受体表达。脾淋巴细胞转化实验是研究免疫调节剂对淋巴细胞作用的常用方法，也是反映机体细胞免疫最基本的指标，淋巴细胞的增殖和分化是机体免疫应答过程中的一个重要阶段，淋巴细胞受到抗原或促有丝分裂原刺激时增殖能力的强弱反应了淋巴细胞功能的高低。

淋巴细胞增殖反应既可通过形态学观察计数，也可用3H－TdR掺入法检测细胞内DNA合成量的增加，据此判断出淋巴细胞对有关刺激的反应性与功能状态。本实验采用MTT法检测PSP体外刺激对小鼠脾淋巴细胞转化的影响。MTT法的原理是活细胞特别是增殖细胞中存在线粒体水解酶可将MTT分解为兰紫色的结晶物质而显色，其光密度值能够反映细胞的增殖情况。

结果显示，PSP对淋巴细胞转化的影响呈现出低剂量促进、高剂量抑制的双向免疫调节作用，具体原因有待于进一步研究。PSP对淋巴细胞转化的这种强促进作用，为松子壳多糖的深入开发利用提供了一定的实验基础，因此继续探讨其免疫调节机制具有非常重要的意义。

巨噬细胞是机体天然抵抗力的一种重要效应细胞，而且是一种具有多种功能的免疫细胞。激活的巨噬细胞可以参与特异性和非特异性免疫反应，有较强的吞噬和胞饮作用，巨噬细胞吞噬能力是衡量机体非特异性免疫功能的重要要指标之一。巨噬细胞的代谢状况和其吞噬能力直接相关，代谢旺盛，则说明巨噬细胞的吞噬能力增强;代谢减弱，则吞噬功能下降。实验结果表明，PSP浓度在25～200 μg/mL时极显著增强了小鼠巨噬细胞的代谢功能(P＜0.01)，但是随着浓度的继续升高，对巨噬细胞的代谢逐渐表现出抑制作用，当浓度达到400 μg/mL时抑制作用极显著(P＜0.01)。PSP在25～300 μg/mL范围内，随浓度升高促进了巨噬细胞吞噬中性红的作用，浓度在100 μg/mL时促进作用显著(P＜0.05)，但是当浓度达到400

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黄芪多糖对2型糖尿病大鼠骨骼肌组织GLUT4表达的影响

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时珍国医国药２００７年第１８卷第１１期ＬＩＳＨＩＺＨＥＮ　ＭＥＤＩＣＩＮＥ　ＡＮＤ　ＭＡＴＥＰｄＡ　ＭＥＤＩＣＡ　ＲＥＳＥＡＲＣＨ　２００７　ＶＯＬ．１８　ＮＯ．１１　

由验证实验结果可知，由正交设计实验优选的提取工艺以及　

醇沉工艺稳定可行。　

表４工艺验证实验结果　％　

３结论　

土茯苓多糖最佳提取工艺条件为：固液比１：３０，微波功率　８　，提取温度　℃，微波萃取两次，　次，提取液浓缩至．００Ｗ　１００　１０　ｒａｉｎ／　

原体积的１／５—１／６，终浓度为９ｏ％乙醇醇析。　

由单因素实验可知，在用水提取土茯苓多糖的同时，相当大　

的一部分土茯苓总黄酮也被浸出，经测定其浸出率达到０．１９％　

（文献　报道的为０．２３２％），这就使得土茯苓中有效成分的总浸　

出率得到提高，有利于中药土茯苓资源的有效利用。　

按优化后的提取工艺条件，以预处理过的２０　ｇ干燥的土茯　

苓饮片进行实验，土茯苓多糖提取率、粗多糖得率和粗多糖中多　

糖含量分别为８．３３％，３．９７％和３９．５％，优于传统加热水煎煮法　（固液比１：２０，提取温度ＩＯ０￣Ｃ，提取３次，１．５　ｈ／次）的８．０２％，　

３．５４％和３４．６％。可见，微波辅助提取法大大缩短了提取时间，　

显著提高了土茯苓多糖的提取效率。　

参考文献：　

［１］　田君，池汝安，高洪，等．乙醇提取土茯苓黄酮甙的动力学研究　［Ｊ］．天然产物研究与开发，２００５，ｌ７（１）：ｌ１．　［２］陈韩英，李炳奇，刘红，等．熟地多糖的微波提取和含量测定［Ｊ］．　时珍国医国药，２００４，１５（８）：４８８．　［３］张自萍．微波辅助提取技术在多糖研究中的应用［Ｊ］．中草药，　

２００６，３７（４）：６３０．　［４］张大伟，张永亮，昆道列提，等．红松松子壳酸性多糖最佳提取条件　研究［Ｊ］．时珍国医国药，２００６，１７（６）：９９７．　［５］王晋黄，池汝安，陈少峰，等．土茯苓中提取总黄酮的工艺研究［Ｊ］．　

植物研究，２００６，２６（３）：３７１．　［６］李俐，支玲．土茯苓中多糖的含量测定［Ｊ］．现代应用药学，　

蒲公英多糖对小鼠免疫器官的影响

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动物医学进展。２００８，２９（４）：１０—１２　Ｐｒｏｇｒｅｓｓ　ｉｎ　Ｖｅｔｅｒｉｎａｒｙ　Ｍｅｄｉｃｉｎｅ　

蒲公英多糖对小鼠免疫器官的影响　

陈福星，陈文英，郝艳霜　

（河北农业大学中兽医学院，河北定州０７３０００）　

摘要：从蒲公英中提取多糖，观察其对小鼠免疫机能的影响。３０只昆明种小鼠随机分成试验组和对　

照组，每组１５只。试验持续１０　ｄ，于试验第３天给试验组小鼠灌服制备的蒲公英多糖溶液，对照组小鼠则以　

生理盐水灌胃。试验结束后脱颈处死小鼠，剖检，取胸腺和脾脏分别称重，并取适当组织制备切片镜检。结　

果显示，蒲公英多糖能显著提高脾脏指数和胸腺指数，改善器官内部组织结构，促进小鼠免疫器官的生长发　

育，有利于提高小鼠的免疫功能。　

关键词：蒲公英多糖；免疫器官指数；组织病理学；小鼠　

中圈分类号：Ｓ８５２．４３Ｉ￥８５３．７１　文献标识码：Ａ　文章编号：１００７—５０３８（２００８）０４—００１０—０３　

蒲公英，别名黄花苗、婆婆丁、黄花地丁等，为菊　

科蒲公英属（Ｔａｒａｘａｃｕｍ　ｍｏｎｇｏｌｉｃｕｍ　Ｈａｎｄ—Ｍａｚｚ）　

多年生草本植物的带根全草，《中华人民共和国药　

典１（２００５年）记载其具有清热解毒、消肿散结、利尿　

通淋等功效功能。现代药理研究显示，蒲公英具有　

广泛的药理活性，如抗病原微生物感染、提高机体免　

疫、保肝利胆、抗溃疡等，尤其是抗菌作用最为显著。　

试验发现由蒲公英组成的中药复方添加于患隐性乳　

房炎的奶牛饲料中，奶牛细胞免疫功能明显提高，隐　

性乳房炎发生率显著好转，有效率达８３　［１．。　；金忠　

辉等　］以蒲公英等五味药研制开发的复方蒲公英注　

射液对奶牛临床型和隐性乳房炎均具有较好的疗　

效；将蒲公英水浸液进行体外抑菌试验，对奶牛乳房　

炎主要病原菌均具有较强的抗菌活性［５　］；将蒲公英　

提取物给小鼠口服，能提高小鼠的免疫功能［　。但　

从总体上看，蒲公英应用多是散剂或汤剂，且以复方　

为主，没有形成现代中药剂型，因而作用成分复杂，　

灵孢多糖通过抑制TLR4

灵孢多糖通过抑制TLR4

网络出版时间：２０２３－０９－２７１６：１６：５８　网络出版地址：ｈｔｔｐｓ：／／ｌｉｎｋ．ｃｎｋｉ．ｎｅｔ／ｕｒｌｉｄ／３４．１０８６．ｒ．２０２３０９２６．１４３７．０３８

灵孢多糖通过抑制ＴＬＲ４／ＮＦκＢ通路改善

ＥＡＥ小鼠的髓鞘脱失

李彦青１，王　青１，杨智超１，宋丽娟１，王翰斌２，杨立志２，刘建春１，肖保国３，马存根１

（１．山西中医药大学神经生物学研究中心，国家中医药管理局多发性硬化益气活血重点研究室，山西晋中　０３０６１９；２．山西国润制药有限公司，山西大同　０３８１００；３．复旦大学附属华山医院神经病研究所，上海　２０００２５）

收稿日期：２０２３－０５－１０，修回日期：２０２３－０８－０９基金项目：博士来晋科研启动项目（Ｎｏ２０２１ＢＫＳ０１）；山西省横向课题（Ｎｏ２０２２ＨＸＧＲ０１）；山西中医药大学校级项目（Ｎｏ２０２１ＰＹＪＣ１５，２０２２ＢＫ１５）；山西省卫健委科技领军团队（Ｎｏ２０２０ＴＤ０５）作者简介：李彦青（１９８８－），女，博士，讲师，研究方向：神经药理学，Ｅｍａｉｌ：ｌｙｑｃｈｉｎａ＠ｓｘｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎ；马存根（１９６０－），男，博士，教授，研究方向：药理学，通信作者，Ｅｍａｉｌ：ｍａｃｕｎｇｅｎ＠ｓｘｔｃｍ．ｅｄｕ．ｃｎｄｏｉ：１０．１２３６０／ＣＰＢ２０２３０１０４８文献标志码：Ａ文章编号：１００１－１９７８（２０２３）１０－１９１４－０７中国图书分类号：Ｒ３３２；Ｒ２８４１；Ｒ３２２８１；Ｒ３９２１１；Ｒ７４４３摘要：目的　探究灵孢多糖（ｇａｎｏｄｅｒｍａｌｕｃｉｄｕｍｐｏｌｙｓａｃｃｈａｒｉｄｅｓ，ＧＬＰＳ）对多发性硬化（ｍｕｌｔｉｐｌｅｓｃｌｅｒｏｓｉｓ，ＭＳ）动物模型实验性自身免疫性脑脊髓炎（ｅｘｐｅｒｉｍｅｎｔａｌａｕｔｏｉｍｍｕｎｅｅｎｃｅｐｈａｌｏｍｙｅｌｉｔｉｓ，ＥＡＥ）小鼠的保护作用及机制。方法　将Ｃ５７ＢＬ／６小鼠３０只随机平均分为３组：正常对照组、ＥＡＥ模型组、ＧＬＰＳ组（５ｍｇ·ｋｇ－１）。采用结核分枝杆菌和ＭＯＧ３５５５建立小鼠ＥＡＥ模型，观察ＧＬＰＳ对ＥＡＥ小鼠体质量及神经功能障碍评分的影响；采用固蓝染色和ＨＥ染色观察小鼠脊髓冰冻切片髓鞘组织病理情况、免疫荧光观察ＭＢＰ表达变化；利用流式细胞术检测小鼠脾脏、淋巴结中ＩＬ１７、Ｆｏｘｐ３含量；通过Ｗｅｓｔｅｒｎｂｌｏｔ检测小鼠脊髓组织中ＴＬＲ４／ＮＦκＢ通路蛋白表达水平。结果　与正常对照组比较，ＥＡＥ模型组小鼠神经行为学评分升高，并且伴随体质量降低，脊髓组织大范围髓鞘脱失，呈现大量炎性细胞浸润，髓鞘标志蛋白ＭＢＰ表达下调，ＴＬＲ４／ＮＦκＢ通路蛋白表达水平升高。经ＧＬＰＳ干预后，ＥＡＥ小鼠神经功能评分降低、体质量上升，髓鞘脱失改善，炎性细胞浸润减少，Ｆｏｘｐ３的表达增加，ＩＬ１７的含量降低，ＴＬＲ４／ＮＦκＢ通路蛋白表达降低。结论　ＧＬＰＳ能够抑制ＭＳ动物模型ＥＡＥ的发病进程，其作用机制可能是通过抑制ＴＬＲ４／ＮＦκＢ炎症通路改善髓鞘脱失，从而发挥对中枢神经系统的保护作用。

半枝莲多糖对C26结肠癌小鼠肿瘤微环境T细胞亚群的影响

半枝莲多糖对C26结肠癌小鼠肿瘤微环境T细胞亚群的影响

半枝莲多糖对C26结肠癌小鼠肿瘤微环境T细胞亚群的影响

摘要】 目的：观察半枝莲多糖（SPS）对结肠癌小鼠肿瘤微环境T细胞亚群的影响。方法：建立C26结肠癌小鼠移植瘤模型，SPS作用10天后，测定肿瘤重量，计算抑瘤率，流式细胞术检查肿瘤浸润T淋巴细胞亚群的数量。结果：SPS 明显抑制肿瘤生长，提高CD4+、CD8+淋巴细胞的百分率。结论：SPS的抗肿瘤作用与调节T淋巴细胞亚群有关。

【关键词】 半枝莲多糖；T淋巴细胞亚群；结肠癌

【中图分类号】R965 【文献标识码】A 【文章编号】2095-1752（2015）17-0185-02

近年来我国结肠癌的发病率和死亡率逐年上升。结肠癌的发生转移与癌细胞所处的内外环境有着密切关系。研究发现，结肠癌微环境中CD4+CD8+淋巴细胞数量减少和比值改变是导致肿瘤细胞逃逸机体免疫监视，造成肿瘤持续生长、转移的原因[1]。本文通过观察半枝莲多糖对C26结肠癌小鼠肿瘤微环境中T淋巴细胞亚群的影响，从免疫学角度探讨半枝莲多糖（Scutellaria barbata Polysaccharides,

SPS）抗肿瘤作用的分子机制。

1.材料和方法

1.1实验材料

BALB/C小鼠，购于广东医学院实验动物中心；C26结肠癌细胞，北京协和医学院药理教研室惠赠；半枝莲多糖，本室自制；5氟尿嘧啶（5-FU），上海旭东海普药业有限公司；RPMI-1640，美国GIBCO公司；CD4、CD8单克隆抗体，美国Biolegend公司。

1.2实验方法

1.2.1细胞培养

C26为BALB/C鼠源性结肠癌细胞，静置于37℃、5％CO2的培养箱内，用含10％胎牛血清的1640培养基常规培养。

1.2.2模型的制备及分组给药

将对数生长期的C26结肠癌细胞调整密度为1×107/ml，接种于小鼠右侧腋窝皮下，每只小鼠0.2 ml。10d后取瘤组织，剪切成1 mm3左右, 再次接种。如此传3代后,大批接种小鼠腋下。将接种C26细胞24 h后的50只小鼠随机分为模型组，阳性对照5-FU组和SPS低、中、高剂量组。5-FU组腹腔注射5-FU 15mg?kg-1?d-1，SPS低、中、高剂量组分别灌胃SPS 50、100、200 mg?kg-1?d-1，模型组灌胃给予等体积生理盐水，连续给药10 d。